酸誘導酪蛋白膠束-海藻酸鈉乳液凝膠性質及其對原花青素的負載性能

喬蕾蕾，楊 敏，秦娟娟，廖海周，季 偉，李 茜

（甘肅農業大學理學院，甘肅 蘭州 730070）

原花青素（proanthocyanidins，PC）是天然多酚類化合物，具有良好的抗氧化、抗炎等作用[1-2]。然而，PC穩定性較差，在特定pH值、光、熱作用下易降解，導致生物利用度低，限制了其在食品及醫藥行業中的應用[3]。為了改善花青素的穩定性和生物利用度，常對其進行適宜的包封和負載，已開發出多種負載體系，如乳液、脂質體、生物聚合物顆粒等[4-6]。研究表明，利用魔芋葡甘聚糖制備的微粒負載PC，經過胃和小腸各消化4 h后，保留率可達79.47%[5]。以膠原蛋白、果膠、殼聚糖復合物為基質的微膠囊對花青素的包封率高達92.58%，負載量為12.34 g/100 g[6]。葡萄皮中的花青素在W/O/W雙乳液中的包封率達（87.74±3.12）%[7]。另外，以淀粉為基質的乳液凝膠對PC和姜黃素具有較好的同時負載和控釋效果；可見，乳液凝膠在遞送活性物質方面具有一定的潛力[8]。

乳液凝膠是基于蛋白質、多糖等大分子制備的一種復雜的膠體材料，其中既有乳液滴又具有凝膠結構，兼備了乳液和凝膠的雙重優點，具有更好的貯藏穩定性和腸道給藥性[9-10]。乳液凝膠可作為新型遞送系統，使活性成分更好地到達靶向部位，提高生物利用度[11-13]。Lin Duanquan等[14]研究發現，海藻酸鹽和大豆分離蛋白為基質的乳液凝膠對番茄紅素包封后，可通過改變pH值控制釋放和提高包封率，且乳液凝膠包封提高了番茄紅素的穩定性。大豆分離蛋白基乳液凝膠對槲皮素的包封率可達（66.62±0.98）%[15]。包封在W/O/W型乳液凝膠中的槲皮素化學穩定性和溶解度均得以改善，有效生物利用度提高了2～4 倍[16]。由此可見，乳液凝膠在包埋和遞送活性分子方面具有優異的性能。

酪蛋白膠束（micellar casein，MC）是乳中酪蛋白的天然存在形態，具有納米級多孔結構和兩親性，可作為一種天然載體，用于負載活性物質[17-18]。本團隊前期研究表明，MC負載改善了PC的熱穩定性和H2O2氧化穩定性[19]。目前，已有研究對酪蛋白-海藻酸鈉（sodium alginate，SA）復合乳液凝膠進行了結構和流變性分析，發現該乳液凝膠具有良好的持水性[20]。此外，酪蛋白酸鈉-阿拉伯糖基木聚糖復合凝膠在遞送表沒食子兒茶素沒食子酸酯時以pH值響應模式釋放，在低pH值下可保護其不降解[21]。然而，MC基乳液凝膠性質及其對PC的包封研究較少。

以MC、SA為基質，以葡萄糖酸-δ-內酯（gluconateδ-lactone，GDL）為酸化試劑，制備含油量為70%的乳液凝膠，研究GDL添加量對乳液凝膠微觀結構、穩定性和流變行為的影響；分析乳液凝膠對PC的釋放特性。研究結果可為乳液凝膠在負載PC方面的應用提供參考依據，也可為MC在乳液凝膠中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MC參照本團隊前期方法制備，將巴氏殺菌牛乳在4000×g離心30 min，所得脫脂乳進行膜過濾，截留分子質量為100 kDa，跨膜壓力為0.4 MPa，流速為480 L/h；收集截留濃縮液后冷凍干燥至恒質量，即得MC，測得總蛋白質含量為（83.26±1.87）%；金龍魚大豆油 益海嘉里食品工業有限公司；SA、PC、GDL 上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶（1500 U/mg）、胰蛋白酶（＞2500 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 設備與儀器

FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；H1850臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；AD500S-H均質機 上海昂尼儀器儀表有限公司；N-180M光學顯微鏡 河南兄弟儀器設備有限公司；MF52-N倒置熒光顯微鏡 廣州明美光電技術有限公司；STA449F5同步熱分析儀 德國耐馳儀器制造有限公司；ZEEnit700P火焰原子吸收光譜儀 德國耶拿分析儀器股份公司；HR-1混合流變儀 沃特世科技有限公司；BXT-SH82恒溫水浴振蕩器 上海能共實業有限公司；UV-1780雙光束紫外-可見分光光度計 島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳液凝膠的制備

準確稱取一定量的MC，溶于0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中（pH 6.86），37 ℃恒溫水浴中磁力攪拌2 h，并添加0.02%的疊氮化鈉作為抑菌劑，制得40 mg/mL的MC溶液。將一定量SA溶于0.05 mol/L pH 6.86的磷酸鹽緩沖溶液中，37 ℃恒溫水浴中磁力攪拌至溶解，4 ℃放置過夜至完全水合，制得2%的SA溶液。

取8 mL MC溶液，分別添加0、5、10、15 mg/mL的GDL，37 ℃磁力攪拌2 min，然后與2 mL SA溶液混合，磁力攪拌2 min；取9 mL混合液添加到21 mL大豆油中，采用均質器14000 r/min均質3 min，制得乳液凝膠，分別記作G-0、G-5、G-10、G-15。

向MC溶液中加入4 mg/mL的PC，參照上述步驟制得乳液凝膠，分別記作G/PC-0、G/PC-5、G/PC-10、G/PC-15。

1.3.2 乳液凝膠微觀結構分析

采用光學顯微鏡和倒置熒光顯微鏡觀察乳液凝膠的微觀結構。用磷酸鹽緩沖液將樣品稀釋一定倍數后放置在載玻片上，采用光學顯微鏡于物鏡×40、目鏡×10下進行觀察，并用ImageJ軟件對油滴的尺寸進行統計。用1 mg/mL的羅丹明B對MC染色，用0.5 mg/mL的尼羅紅對油進行染色，然后制成乳液凝膠，采用熒光顯微鏡進行觀察，激發波長分別為545 nm和488 nm。

1.3.3 乳液凝膠穩定性分析

1.3.3.1 貯藏穩定性

將乳液凝膠分裝于小玻璃瓶中，置于4 ℃冰箱保存，動態觀察其外觀及微觀結構。

1.3.3.2 熱穩定性

將乳液凝膠分別置于65 ℃和80 ℃水浴中加熱30 min，自然冷卻至室溫后分析乳液凝膠的外觀和微觀結構變化。

1.3.3.3 稀釋穩定性

向去離子水中加入1 mol/L的HCl溶液或NaOH溶液，分別配制成pH值為1、3、4、5、7、9的水溶液，向乳液凝膠中加入3 mL不同pH值的溶液，放置7 d后對其進行外觀及顯微鏡觀察。

1.3.4 乳液凝膠中MC解離程度分析

1.3.4.1 MC解離程度分析

分別取放置0 h和72 h的乳液凝膠4000×g離心60 min；取離心后下層水相，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。水相與緩沖溶液以1∶1的比例混合，渦旋30 s，在沸水浴中加熱5 min，然后在4000×g離心4 min；上樣量為6 μL，電壓150 V，用考馬斯亮藍R250進行染色。

1.3.4.2 鈣離子的解離程度分析

采用火焰原子吸收光譜儀測定乳液凝膠離心后水相中鈣離子含量。

1.3.5 熱重（thermogravimetry，TG）分析

準確稱取13～15 mg乳液凝膠樣品，置于氧化鋁坩堝中，以空坩堝作為對照，用熱分析儀對樣品的熱穩定性進行分析，用氮氣進行吹掃，溫度范圍為25～500 ℃，升溫速率為5 ℃/min。

1.3.6 乳液凝膠流變性測定

使用流變儀測試乳液凝膠的流變性，采用直徑為40 mm的平行板，設置間隙為1000 μm。測定溫度25 ℃，頻率掃描范圍10～100 Hz，記錄儲能模量（G’）和損耗模量（G”）。穩定剪切掃描在剪切速率為10～300 s-1下進行。

1.3.7 乳液凝膠的體外模擬消化

參考Chang Chao等[22]的方法，稍作修改。將1 g乳液凝膠放入截留分子質量為1 kDa的透析袋中，加入3 mL含有3.2 g/L胃蛋白酶和0.5%脂肪酶、pH 1.2的模擬胃液，將透析袋浸沒于不加酶的胃液中，于37 ℃、100 r/min下振蕩2 h，每隔0.5 h取3 mL透析液，用同體積模擬胃液補充。振蕩結束后將透析袋中的溶液pH值調為7.5，加入3 mL含有10 g/L胰蛋白酶和12 g/L豬膽鹽、pH 7.5的模擬腸液，浸沒于不加酶的腸液中，振蕩8 h；分別在指定時間點取3 mL透析液，用同體積模擬腸液補充。于波長278 nm處對透析液進行吸光度測定，PC釋放量通過同介質下繪制的標準曲線（y=0.00642x+0.01563）計算。

1.4 數據統計

2 結果與分析

2.1 乳液凝膠的微觀結構及貯藏穩定性

由圖1a可以看出，乳液凝膠為O/W型結構，MC分布于油滴表面。由圖1b可知，乳液凝膠呈半固體狀，倒置后未見流動，說明其為凝膠。空白或負載了PC的乳液凝膠放置420 d后沒有出現相分離，也未見油相析出，說明凝膠具有極好的貯藏穩定性。

由圖2可知，隨著GDL添加量的增大，乳液凝膠中油滴的平均粒徑減小，這是因為GDL添加量越大，酸化反應越快，酸化后終點pH值越低。SA在酸的作用下由負電荷變為正電荷，與MC間的相互作用由靜電斥力變為靜電引力，相互結合形成復合物；另一方面，MC在酸化作用下解離出鈣離子，而鈣離子具有交聯SA的作用，因此MC與SA復合物結構收縮，致使油滴粒徑減小[23]。相同添加量的GDL下，添加PC的乳液凝膠中油滴粒徑略小于未添加PC的乳液凝膠，這可能是由于PC與MC可通過非共價作用結合，且由于PC為聚合物，可同時與MC上多個氨基酸殘基或不同MC上的氨基酸殘基結合，起到交聯作用，使MC結構更加緊縮和致密。因此，所有樣品中G/PC-15的油滴粒徑最小。有研究發現，酚類分子的數量和組成可能影響乳液凝膠的物理性質和穩定性[24]。PC的加入使得乳液凝膠的油滴粒徑更小，有利于提升其穩定性。

圖2 不同貯藏期乳液凝膠光學顯微鏡圖及油滴粒徑分布Fig.2 Optical microscopic images and oil droplet size distribution of emulsion gels during storage

在貯藏期間，隨著放置時間的延長，添加了GDL的凝膠中油滴的粒徑出現先減小后增大的趨勢，說明貯藏初期，pH值逐漸變化，乳液凝膠微觀結構不斷調整，且其穩定的微觀結構形成需要較長時間。當貯藏420 d時，油滴的粒徑與0 d樣品的粒徑相差不大，證實了乳液凝膠未發生明顯的油滴合并和析出，說明其具有極高的穩定性，與外觀觀察結果一致。

2.2 乳液凝膠的熱穩定性及酸堿穩定性

2.2.1 熱穩定性

如圖3所示，熱處理后，乳液凝膠倒置均未見流動，并且沒有出現油相析出和相分離行為，說明其熱穩定性較高。MC在90 ℃以下具有較好的穩定性，而且向蛋白質中添加多糖可以提高凝膠穩定性[25-26]。另一方面，擁擠的油滴限制了油滴的運動，降低了其在熱處理過程中合并析出的可能性，提升了乳液凝膠穩定性。因此MC與SA形成的乳液凝膠具有較高的熱穩定性。

圖3 熱處理后乳液凝膠的外觀、光學顯微鏡圖及油滴粒徑分布Fig.3 Appearance,optical microscopic images and oil droplet size distribution of emulsion gels after heat treatment at different temperatures

同一樣品經過不同溫度熱處理后油滴粒徑不同。其中，65 ℃處理樣品油滴粒徑小于80 ℃。這是因為當溫度達到80 ℃時，MC可能發生熱聚集，部分小油滴出現合并現象，導致粒徑增大[27]。

2.2.2 稀釋穩定性

將制備的乳液凝膠浸泡在不同pH值溶液中放置7 d后的表觀狀態如圖4所示。所有凝膠均具有較好的酸堿穩定性，未見油相析出。經不同pH值溶液處理后，乳液凝膠G-0上清液具有一定程度的渾濁，其中pH 1、7、9時渾濁程度較大，而pH 5時上清液澄清透明。這是因為MC在遠離等電點的pH值下溶解性較好，凝膠中的MC在水溶液稀釋下因溶解進入了稀釋液中。另外，G/PC-0上清液較G-0上清液澄清，說明PC具有交聯MC的作用，使其更好地固定在凝膠網絡中，難以溶出。添加GDL后，乳液凝膠在不同pH值下稀釋后上清液較為澄清，因為MC經GDL酸化，逐漸團聚或沉淀，穩定性提升，在不同pH值下難以溶出。由此可見，GDL的添加提升了乳液凝膠的酸堿穩定性，使其在pH 1～9范圍內保持凝膠結構穩定，有利于乳液凝膠在酸堿環境中的加工。

圖4 不同pH值下乳液凝膠的外觀Fig.4 Appearance of emulsion gels at different pH

通過乳液凝膠在不同pH值溶液中浸泡后油滴粒徑的變化進一步評價其酸堿穩定性，如表1所示，不同pH值溶液浸泡后乳液凝膠油滴粒徑不同；溶液pH值由低到高變化時，油滴的平均粒徑逐漸增大，即pH 1時油滴粒徑最小，pH 9時粒徑最大。這是因為MC在酸化過程中結構變得更加致密，且充斥在油滴間的SA由負電荷變為正電荷，與MC形成靜電引力而結合在一起，進一步促使油滴粒徑收縮[28]。當pH 9時，MC所帶負電荷增加，結構變得松散，因此油滴粒徑增大。

表1 不同pH值下乳液凝膠中油滴的平均粒徑Table 1 Average size of oil droplets in emulsion gels at different pH μm

2.3 乳液凝膠的熱分解特性

圖5 為乳液凝膠的T G 和微商熱重（derivative thermogravimetry，DTG）曲線。所有樣品在100 ℃內出現第一失重階段，為水分蒸發所致。SA的第二失重階段在225～275 ℃，為其熱分解所致，分解溫度為237 ℃。MC在200～460 ℃出現第2次失重，為蛋白質的熱分解，分解溫度為316 ℃。PC的降解溫度為295 ℃。油的失重主要發生在320～460 ℃范圍內，分解溫度為406 ℃，殘留量為1.84%，基本分解完全。乳液凝膠的第二失重階段與油類似，其分解溫度為407.5 ℃，這是因為乳液凝膠中70%為油相。但是，乳液凝膠殘余量大于油，因為其中含有SA和MC。另外，由于GDL和PC添加量較少，對乳液凝膠的TG曲線及分解溫度沒有顯著影響。

圖5 乳液凝膠的DTG和TG曲線Fig.5 DTG and TG curves of emulsion gels

2.4 乳液凝膠中MC的解離特性

2.4.1 MC的解離程度分析

對乳液凝膠放置0 h和72 h的離心清液進行SDS-PAGE分析，結果如圖6所示。就新制備的乳液凝膠而言，未添加GDL的樣品上清液基本沒有酪蛋白條帶，說明酪蛋白以膠束態存在，全部位于凝膠內部用于乳化和穩定油滴。添加GDL后，上清液中出現酪蛋白條帶，其含量在GDL添加量為10 mg/mL時達到最大值。當GDL添加量為15 mg/mL時，酪蛋白條帶消失，且乳清蛋白含量降低，明顯低于G-0。GDL添加量較低時，雖然酸化程度較弱，但仍然在短時間內引起MC的局部酸化，使其出現輕度解離，因此上清液中出現酪蛋白單體，且其含量隨著GDL添加量的增大而增大。當GDL添加量為15 mg/mL時，其對局部接觸的MC酸化程度較強，pH值迅速下降，MC尚未解離便開始聚沉，因此上清液中未見酪蛋白單體。添加PC后，上清液中酪蛋白解離程度與未添加PC的乳液凝膠變化趨勢一致，但酪蛋白單體含量明顯低于未添加PC組，可見PC具有交聯酪蛋白的作用，使其解離程度降低，穩定性提高[29]。

圖6 乳液凝膠放置0 h和72 h后離心清液的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE profiles of the supernatant from emulsion gels after standing for 0 and 72 h

就放置72 h后的乳液凝膠而言，在不添加PC的情況下，GDL添加量為0、5 mg/mL的乳液凝膠上清液中酪蛋白單體含量高于0 h的樣品，這是因為隨著放置時間的延長，MC在SA的靜電斥力作用下出現了輕度解離，加上少量GDL的酸化誘導并未達到等電點，使MC解離程度增大。添加PC后，其通過交聯作用將酪蛋白連接在一起，GDL酸化使交聯的MC相互聚集，成為一個整體，加上SA的靜電作用，使MC解離程度大幅度降低，因此上清液中未見酪蛋白單體。由此可見，GDL添加量為15 mg/mL時，可防止MC的解離；添加PC也可降低MC的解離程度，提高其穩定性。

2.4.2 MC中鈣離子的解離程度分析

如圖7所示，未添加PC時，隨著GDL添加量的增大，清液中鈣離子含量顯著增加（P＜0.05），可見GDL誘導了MC酸化，鈣離子解離[30-32]。添加PC后，清液中鈣離子濃度隨著GDL添加量的增加而增大，但當GDL添加量為0～10 mg/mL時，其鈣離子含量均低于未添加PC的樣品，再次證實了PC的交聯作用；當GDL添加量為15 mg/mL時，清液中鈣離子含量迅速增大，且大于未添加PC的樣品。這可能是因為PC交聯使酪蛋白分子間、酪蛋白與SA之間的間隙增大，酸化雖然使酪蛋白、SA相互聚集，但分子間具有一定的間隙，因此鈣離子易于逸出至清液。

圖7 乳液凝膠上清液鈣含量Fig.7 Calcium concentration in the supernatant of emulsion gels

2.5 乳液凝膠流變性

如圖8a所示，乳液凝膠的表觀黏度隨剪切速率的增加而降低，表現出剪切稀化行為，因為隨著剪切速率的增加，乳液凝膠網絡結構被破壞，油滴開始出現移動，表觀黏度降低[33]。隨著GDL添加量的增大，乳液凝膠表觀黏度增大，這歸因于GDL改變了凝膠體系的pH值，使MC與SA分子間的相互作用發生變化，油滴粒徑減小，凝膠結構變得致密，所以表觀黏度增加。另外，由于PC與MC和SA之間產生交聯作用，因此添加PC后乳液凝膠的表觀黏度均高于未添加組。

圖8 乳液凝膠的表觀黏度和流變性Fig.8 Apparent viscosity and rheological properties of emulsion gels

如圖8b所示，在角頻率低于100 rad/s時，所有樣品的G’大于G”，說明在此頻率范圍內所有樣品都表現出較強的彈性特征且為固態[34]。隨著角頻率的增大，所有樣品的G’和G”逐漸增加，這是凝膠的典型動態流變特性[35]。隨著GDL添加量的增加，乳液凝膠的G’和G”交叉點向更高頻率移動，說明凝膠結構的松弛過程和結構的轉化需要更長時間和更高頻率，且G’和G”之間的差異增大，表明在較短的時間尺度上液滴間運動減少，主要為凝膠狀行為[33]。因此，GDL添加量越多，乳液凝膠網絡結構越穩定。GDL添加量越大，乳液凝膠體系的pH值越小，MC與SA之間的相互作用由靜電斥力變為靜電引力，使得乳液凝膠的網絡結構更加緊密，更不容易被破壞。加入PC后，乳液凝膠的G’和G”交叉點向更高頻率移動，說明PC與MC之間的交聯作用使得乳液凝膠的網絡結構更加穩定。

2.6 乳液凝膠對PC的控釋特性

如圖9所示，在2 h的模擬胃液消化過程中，乳液凝膠中PC的釋放率均小于游離PC的釋放率，這是因為游離PC在酸性條件下具有較好的溶解性，而乳液凝膠中的PC被結合和包覆于凝膠網絡結構中，難以擴散至模擬胃液中。在模擬腸液中，乳液凝膠中PC的釋放率顯著高于游離PC。就乳液凝膠組而言，模擬消化4～8 h時，未添加GDL的乳液凝膠中PC釋放率最低，其次為G/PC-5；G/PC-10和G/PC-15中PC的累計釋放量最高，且二者差異不大。

圖9 模擬胃腸條件下乳液凝膠中PC的釋放曲線Fig.9 Release curves of PC from emulsion gels under simulated gastrointestinal conditions

PC在酸性條件下穩定，而在中性和堿性條件下會快速降解[36]。因此，游離PC在模擬腸液環境中發生降解，其釋放率最低。經過乳液凝膠包封后，PC被包封于凝膠網絡內部，難以直接接觸腸液，從而保護了其結構穩定，因此釋放率較高。另外，添加適量的GDL賦予了乳液凝膠酸性環境，可用于抵消腸液的弱堿性，進而保護了PC的穩定。因此，當GDL添加量為10、15 mg/mL時PC的釋放率最高。由此可見，添加GDL有利于提升乳液凝膠中PC的穩定性。有研究指出，果膠負載對胃腸系統中的花青素具有保護作用，在腸道消化過程中釋放更多的花青素，并提高其生物利用度[36]，這與本實驗的研究結果一致。

3 結論

以MC和SA為基質，以GDL為酸化試劑，制備了含油量70%的乳液凝膠。該乳液凝膠貯藏420 d后仍保持結構穩定，未見油相析出。隨著GDL添加量的增加，乳液凝膠中油滴粒徑減小。添加5 mg/mL和10 mg/mL GDL誘導了MC的解離，部分酪蛋白單體析出；但當其添加量為15 mg/mL時，酪蛋白單體未見析出，且在GDL的酸化作用下，MC中大量鈣離子解離，與SA交聯，顯著改善了乳液凝膠的穩定性和黏彈性。因此，隨著GDL添加量的增大，乳液凝膠的表觀黏度和儲能模量增大。另外，添加PC也具有提高乳液凝膠黏彈性的作用。GDL誘導酸化后，乳液凝膠的酸性環境可有效防止PC在腸道環境下的降解，提高PC的累計釋放率，有利于改善其生物利用度。

由此可見，GDL酸化的MC-SA基乳液凝膠負載可顯著改變PC的腸道釋放特性，且該體系具有極高的穩定性，具備開發功能食品的潛力。