亞臨界水制備芝麻ACE抑制肽的分離純化、構效、分子對接

孫 強，王瑞丹，黃紀念,2,*，蘆 鑫，宋國輝，游 靜

（1.河南省農業科學院農副產品加工研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省特色油料作物基因組學重點實驗室，河南 鄭州 450002）

芝麻，又稱胡麻、脂麻，是中國主要的油料作物之一。目前，芝麻主要用于制油，由于國內對芝麻香油的喜愛，芝麻榨油工藝中有高溫烘烤生香工藝。經過高溫處理后，芝麻餅粕中芝麻蛋白發生嚴重變性，限制后續加工利用[1-2]。為了充分利用資源，擴大芝麻蛋白的應用范圍，對高溫芝麻餅粕進行一定處理進而制備功能肽具有重要意義。

大量研究證實，通過體內消化釋放或體外制備的不同生物活性肽具有抗疲勞、降血壓、提高免疫力、降血脂、抗菌等多種生理功能，且易被人體消化吸收，食用安全性高[3]。食源性功能肽的制備大多是利用酶法水解[4-5]，但該方法存在轉化率低、水解速率低、蛋白酶價格昂貴等局限性，長時間酶解還會導致微生物污染[6]。亞臨界水是指溫度在沸點（100 ℃）以上，臨界溫度（374 ℃）以下仍保持為液體狀態的水，又稱為高溫水、高溫液態水、超加熱水等。在亞臨界水狀態下，酸/堿能夠催化反應較快進行，且與常溫狀態相比，僅需要很少的酸/堿催化劑即可?？梢姡瑏喤R界水技術是一種綠色環保、前景廣闊的萃取技術，具有設備操作簡單、成本低、提取率高等優點，又具有良好的滲透與溶解能力，在副產物深加工方面得到了廣泛關注[7-8]。目前已有開展亞臨界水制備寡肽與氨基酸等相關研究，并表明該技術利用高溫芝麻粕資源可行[9]，但尚未明確利用亞臨界水技術制備功能肽的序列與構效關系。此外，如何克服亞臨界水水解蛋白質斷裂位點無專一性、獲得的肽段重現性不好等缺點，控制反應產生所需要的寡肽仍需繼續深入研究。

血管緊張素轉化酶（angiotension converting enzyme，ACE）對血壓起重要的調節作用。ACE能催化血管緊張素I過多地轉化為血管緊張素II，使心肌收縮加強，致使血壓升高。同時使具有血管舒張作用的舒緩激肽失活，引發血壓升高。臨床上高血壓患者大多數使用合成ACE抑制劑（如賴諾普利）控制血壓的升高，這類藥物會產生味覺功能紊亂、皮疹、血壓過度偏低等副作用[10-11]，因此食源性ACE抑制肽是近年來的研究熱點。本研究在亞臨界水狀態下，利用酸催化水解芝麻蛋白制備ACE抑制肽，并對其進行分離純化，利用液相色譜-質譜聯用儀進行結構鑒定，篩選典型芝麻ACE抑制肽，同時以比較分子場分析（comparative molecular force field analysis，CoMFA）方法建立寡肽的三維定量構效關系（three dimensional quantitative structure-activity relationship，3D-QSAR）模型，以揭示寡肽分子周圍立體場和靜電場分布對ACE抑制活性的影響，利用AdmetSAR對其吸收、代謝、毒性進行評價，并利用分子對接分析其與ACE分子的結合方式，探討其抑制作用的分子機理，進而為芝麻蛋白的資源化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂高溫芝麻粕（蛋白（45.00±0.74）%、粗脂肪（2.54±0.03）%、水分（6.98±0.17）%、灰分（10.45±0.14）%、總糖（35.03±1.10）%）由本實驗室自制；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）Genview科技有限公司；ACE、馬尿酰組氨酰亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu，HHL）、鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）美國Sigma-Aldrich公司；超濾膜UE010（截留分子質量10 kDa）、UE005（截留分子質量5 kDa）、UE003（截留分子質量3 kDa）、納濾膜（截留分子質量150 Da）中科瑞陽膜技術有限公司；乙腈、三氟乙酸為色譜級，其他試劑均為國產分析純；寡肽LFRAR、LFRAV、LFRYF、LFRNF、LFREF、AFRAF、MFRAF、VFRAF、NVFRGF、DVFRGF、LFRAFD、EVFRGF由無錫亞肽生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

WHF-0.5型反應釜 威海自控反應釜有限公司；TGL20M-II高速冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；XS205電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Infinite200 Pro酶標儀 奧地利Tecan公司；NGC QuestTM10 Plus色譜系統 美國伯樂公司；Cary eclipse熒光光譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Testcell C-70平膜裝置 日本東電公司；Ultimate 3000毛細管高效液相色譜儀、Q ExactiveTMHybridQuadrupole-Orbitrap?電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質譜儀 美國Thermo Fisher科技公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫亞臨界水處理芝麻蛋白

采用堿溶酸沉的方法從脫脂高溫芝麻粕中提取芝麻蛋白，以1∶50（g/mL）的比例向芝麻蛋白中加入蒸餾水，攪拌混勻后采用5 mol/L HCl溶液和5 mol/L NaOH溶液將混合液的pH值調節至1.5后，轉移入反應釜中以125 ℃加熱60 min。反應后的水解液以5000 r/min離心20 min，收集上清液并調至pH 7.0，5000 r/min再次離心20 min，取上清液于4 ℃保存。

1.3.2 超濾分離水解液

將水解液裝入平膜裝置，采用納濾膜（截留分子質量150 Da）進行脫鹽，操作壓力3 MPa，轉速400 r/min，透過液達到初始溶液體積的80%時，終止納濾，重復3 次，截留液備用。將截留液依次通過UE010、UE005和UE003進行超濾，得到4 個組分，分別為＞10、5～10、3～5、＜3 kDa，采用BCA法[12]測定各組分寡肽濃度，并測定各組分ACE抑制活性的IC50值。

1.3.3 NGC QuestTM10 Plus色譜分析條件

將超濾獲得的活性最強的組分采用0.22 μm的濾膜過濾后進樣到NGC QuestTM10 Plus色譜系統。色譜柱：Shim-pack GIS C18制備柱（20 cm×250 mm，10 μm）；流動相A為含有0.1%三氟乙酸的乙腈，流動相B為含有0.1%三氟乙酸的超純水；流速7.5 mL/min；進樣體積1 mL；檢測波長220 nm；梯度洗脫條件為：0～50 min，45%～50% A、55%～50% B。使用收集器以0.5 min/管收集流動相，將各色譜峰對應試管混合，測定ACE抑制活性并計算IC50值，確定活性最強的峰組分進行質譜鑒定。

1.3.4 質譜分析條件

將活性最強的峰組分進行前處理后采用Ultimate 3000毛細管高效液相色譜儀進行檢測，上樣量5 μL，分析柱采用Acclaim PepMap RPLC C18（150 μm×150 mm，1.9 μm），洗脫條件為：流動相A為0.1%甲酸-2%乙腈溶液，流動相B為0.1%甲酸-80%乙腈溶液，流速600 nL/min，0～5 min，94%～91% A、6%～9% B；5～20 min，81%～86% A、9%～14% B；20～50 min，86%～70% A、14%～30% B；50～58 m i n，70%～60% A、30%～40% B；58～60 min，60%～5% A、40%～95% B。采用電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質譜儀，毛細管溫度270 ℃，電壓2.2 kV，一級質譜參數：分辨率70000，電荷掃描范圍m/z100.0～1500.0。二級質譜參數：分辨率17500，以碰撞誘導裂解方式激活產生碎片離子，激活Q為0.250 s-1，激活時間30.000 ms，最小信號要求1500.0，以m/z100開始掃描。質譜原始數據采用從頭測序的方法進行寡肽序列解析。

1.3.5 ACE抑制肽生理活性與安全性預測

對鑒定到9 個芝麻ACE抑制肽的生理活性采用Admet SAR2.0（http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/）進行預測，其中以人體腸道吸收、經口生物利用度表征吸收特性，血腦屏障表征分布特性，以細胞色素P450底物與抑制活性表征代謝特性，以致癌性、埃姆斯誘變、鉀離子通道的α亞基編碼基因抑制活性、蜂毒性、生物降解表征毒性特性[13]。

1.3.6 3D-QSAR構效模型的建立

3D-QSAR是利用數學建模的方式描述一類具有相似特征結構與其生物活性之間定量關系的方法，其中最為廣泛使用的是CoMFA法，CoMFA模型的三維等勢圖可以形象直觀地顯示分子結構區域與生物活性之間的關系[14]。將13 個寡肽序列在SYBYL-X 2.1.1軟件中protein building模塊錄入，寡肽的電荷模式采用MMFF94模擬，能量優化采用MMFF94力場的Powell共軛梯度算法（最大運算次數10000，能量優化終止標準0.0005 kcal/（mol·?））。采用ACE抑制活性最高的寡肽LFRAF為模板，其中以FR作為骨架構建CoMFA模型，分子疊加圖見圖1。采用偏最小二乘法和逐一剔除法對模型進行評價，在交叉驗證系數（Q2）＞0.5、誤差預測標準差（R2）＞0.6條件下證明模型建立成功，具有良好的預測能力[15-16]。

圖1 LFRAF及其衍生肽的分子疊加圖Fig.1 Structural alignment of LFRAF and its derived peptides

1.3.7 分子對接分析

采用分子對接軟件Molecular Operating Environment（MOE）探究寡肽與人體ACE分子的結合方式。從PDB網站（https://www.rcsb.org/structure/1086）下載含有賴諾普利的人體ACE分子的PDB文件導入MOE軟件，質子化后，除去水分子，作為模板[17]。所選肽段作為配體，能量最小化后載入MOE中Dock模塊，拼接方法為Proxy Triangle，優化設置為Rigid Receptor，得分選用London d G和GBV/WSA d G方式，從30 個構型中選取最佳構型與ACE分子進行拼接。

1.3.8 ACE抑制活性的測定

參考Wang Ruidan等[18]的方法，將15 μL樣液（無抑制的反應液中以蒸餾水代替）與30 μL底物溶液（5 mmol/L HHL的氯化鈉磷酸緩沖液）混合，然后加入30 μL 12.5 mU/mL的ACE酶液，于37 ℃水浴反應30 min。反應結束后加入125 μL 1.2 mol/L NaOH溶液終止酶反應，接著加入30 μL含2% OPA的甲醇溶液，混合均勻后靜置20 min，隨后加入40 μL 6 mol/L HCl溶液終止衍生反應。對照液中以蒸餾水代替。將反應溶液稀釋10 倍后使用熒光光譜儀測定熒光吸收強度，測定條件為：激發波長340 nm，發射波長455 nm，狹縫寬度5 nm。樣液的ACE抑制率計算公式如下：

式中：a為抑制劑與ACE都存在時的熒光吸收強度；b為抑制劑不存在而ACE存在時的熒光吸收強度；c為抑制劑存在而ACE不存在時的熒光吸收強度；d為抑制劑與ACE都不存在時的熒光吸收強度。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均重復測定3 次，采用SPSS 13.0進行方差分析，其中P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 芝麻水解液的超濾分離

采用超濾的方法分別獲得分子質量＞10、5～10、3～5 kDa和＜3 kDa四個組分的寡肽溶液，其ACE抑制活性見表1。不同分子質量的ACE抑制活性存在顯著差異。低分子質量組分的ACE抑制活性強，尤其＜3 kDa的組分最強，而高分子質量組分的ACE抑制活性弱。此結果與Lin Kai[19]、Fu Weiqing[20]等的研究結果一致。低分子質量組分肽鏈短，空間位阻小，更易進入ACE活性口袋，從而改變ACE的催化活性。因此通過低分子質量超濾膜的寡肽溶液能夠提高肽段的ACE活性。

表1 超濾分離芝麻蛋白水解液所得組分及ACE抑制活性Table 1 Ultrafiltration fractions from sesame protein hydrolysate and their ACE inhibitory activity

2.2 NGC QuestTM10 Plus色譜系統分離水解液

對＜3 kDa組分進行NGC色譜系統分離，所得圖譜見圖2，共分離得到5 個色譜峰（P1～P5），該5 個峰組分的保留時間及ACE抑制活性測定結果見表2。由表2可知，峰1的IC50值最低，表明其ACE抑制活性最強。因此選擇峰1組分進行后續質譜鑒定。

表2 NGC色譜系統分離芝麻蛋白水解液所得峰組分及ACE抑制活性Table 2 ACE inhibitory activity of peaks separated in NGC chromatography system

圖2 NGC QuestTM10 Plus系統分離色譜圖Fig.2 Chromatogram of the fraction less than 3 kD in NGC QuestTM 10 Plus system

2.3 芝麻ACE抑制肽的序列鑒定

通過液相色譜-質譜聯用儀分析峰1組分，其總離子流圖見圖3。共鑒定得到9 個寡肽，理論分子質量范圍在639.4319～933.4821 Da，其ACE抑制活性的IC50值見表3。其中KPLLK、LFRAFD的ACE抑制活性相對較弱，LFRAF的相對含量最高，且具有強ACE抑制活性，其二級質譜圖如圖4所示。

圖3 液相色譜-質譜聯用鑒定峰1組分的總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatogram of peak 1 identified by liquid chromatography-mass spectrometry

2.4 ACE抑制肽生理活性與安全性預測

吸收、分布、代謝和排泄特性是鑒定寡肽生物活性的關鍵因素[21]。功能肽在體內發揮作用必須能被人體吸收、代謝，且毒副作用小。因此有必要對寡肽的生理活性與安全性進行預測。由圖5可知，除PELLRKL、PNPRSFF、LPLLK，其他寡肽能通過小腸吸收。除LPLLK的所有寡肽具有高血腦屏障，表明不會對中樞神經系統造成影響。此外，寡肽不屬于細胞色素P450的底物，也沒有其抑制活性，表明不會干擾細胞的正常代謝活動。由毒性特性結果可知，盡管DVFRGF、TFHNLFR、LFRAFD預測具有鉀離子通道的α亞基編碼基因抑制活性，但所有寡肽不會致癌，安全性高。上述結果表明，所得芝麻ACE抑制肽不會干涉人體正常的生理活動。

圖5 ACE抑制肽的吸收、分布、代謝和排泄預測Fig.5 Prediction of absorption,distribution,metabolism,and excretion of ACE inhibitory peptides

2.5 3D-QSAR構效模型的建立

以LFRAF中FR為骨架，衍生其他寡肽，基于CoMFA方法建立LFRAF、LFRAR、LFRAV、LFRYF、LFRNF、LFREF、AFRAF、MFRAF、VFRAF、NVFRGF、DVFRGF、EVFRGF、LFRAFD的半數抑制濃度負對數值（pIC50）的3D-QSAR模型，以揭示寡肽周圍立體場和靜電場分布對ACE抑制活性的影響，探討寡肽ACE抑制活性的分子機理。寡肽IC50及轉換成相應的pIC50值如表4所示，其中pIC50用于CoMFA計算中的因變量，pIC50預測值與測量值之間的殘差值均小于0.7。以ACE抑制肽LFRAF及其衍生寡肽所構建的CoMFA模型統計參數見表5。由表5可知，模型交叉驗證系數（Q2）=0.514＞0.5，非交叉驗證相關系數（R2）=0.997＞0.6，并且具有較低的預測標準誤差0.032（＜0.05）和較高的F值，表明建立的模型具有良好的內部穩定性，且模型中立體場與靜電場對pIC50值的貢獻率分別為50.9%和49.1%，說明CoMFA模型中立體場與靜電場對抑制肽分子與ACE之間的相互作用都有重要影響，且立體場的影響較靜電場大。上述結果證明所建立的CoMFA模型具有良好的預測能力和可靠性。

表4 LFRAF及衍生寡肽的ACE抑制活性Table 4 ACE inhibitory activity of LFRAF and its derived peptides

表5 LFRAF及衍生寡肽的CoMFA模型統計參數Table 5 Statistical parameters of LFRAF and its derived peptides in CoMFA model

圖6A為以pIC50最高的寡肽LFRYF為模板的CoMFA模型的三維立體作用分布圖，其中，綠色區域表示增大取代基體積有利于提高活性，黃色區域表示減小立體位阻有利于提高活性。由立體場的空間分布可知，在第1位氨基酸殘基（N端）處存在綠色區域，表明在此處引入大基團有利于提高活性。例如寡肽MFRAF的ACE抑制活性強于LFRAF。Yan Wenli等[22]研究同樣報道了這一結論，即N端處有大基團氨基酸的寡肽具有較強的ACE抑制活性。在末位氨基酸殘基（C端）的羰基處存在黃色區域，表明在此處引入小基團有利于提高活性，其側鏈處存在綠色區域，表明在此處引入大基團有利于提高活性。如寡肽LFRAF活性明顯強于LFRAV的結果很好驗證了這一點。活性比較高的ACE抑制肽的C末端多為色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）等芳香族氨基酸以及脯氨酸（Pro）。齊春艷[23]采用分子對接和3D-QSAR相結合的方法對以Phe為C末端的ACE抑制二、三肽進行研究，篩選出Gly-Glu-Phe（GEF）、Val-Glu-Phe（VEF）、Val-Arg-Phe（VRF）以及Val-Lys-Phe（VKF）4 種三肽。

圖6 CoMFA模型中立體場（A）和靜電場（B）對LFRYF活性的影響Fig.6 Effect of steric field (A) and electrostatic field (B) on activity of LFRYF in CoMFA model

圖6B為以pIC50最高的寡肽LFRYF為模板的CoMFA模型的分子周圍靜電場分布圖，藍色區域表示增大基團正電荷有利于化合物活性的提高，紅色區域則表示在此處引入帶負電荷的基團對活性有利。由靜電場的空間分布可知，N端處存在紅色區域，表明在N端處引入帶負電荷的基團有利于寡肽活性的提高。C端羧基的羥基處存在紅色區域，表明在此處引入帶負電荷的基團能夠提高ACE抑制活性。然而在氨基附近也存在藍色區域，意味著在該處引入帶正電荷的基團有利于ACE抑制活性的提高。盡管靜電相互作用較為復雜，但C末端帶正電荷取代基的作用是ACE抑制活性的主要因素。該研究結果與Lu Xin等[24]研究結果一致。例如，寡肽LFRAR中C端為帶有正電荷的精氨酸（Arg）氨基酸殘基，其活性與寡肽LFRAF、LFRAV相比大大提高。這一結果證實了之前的報道，Sun Lixia[25]、Mirzaeia[26]等研究發現帶正電荷的氨基酸如賴氨酸和精氨酸的C端殘基有助于提高ACE抑制活性。寡肽在C末端區域含有Phe、Leu、Val、Ile、Pro、Arg和Lys等疏水性氨基酸或堿性氨基酸，這些氨基酸更傾向于與ACE催化活性位點發生結合，從而抑制ACE的催化活性[27]。

由表4、5和圖6可知，ACE抑制肽的氨基酸序列對其ACE抑制能力十分重要。3D-QSAR模型是研究氨基酸序列對ACE抑制肽抑制能力影響的較為準確的方法，目前利用該模型進行分析多以二肽、三肽為主，對于ACE抑制肽的QSAR研究還處于起步階段，能夠準確描述所有ACE抑制肽的結構與其抑制活性的模型鮮有報道，因此也存在著一定的局限性[28]。

2.6 分子對接分析

通過分子對接從分子層面探究寡肽分子與ACE的相互作用方式，揭示其抑制作用機理。據報道，ACE分子主要有S1、S2和S1’三個活性口袋。其中S1口袋包含Ala354，Glu384和Tyr523殘基，S2口袋包含Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520殘基，S1’口袋包含Glu162殘基。同時ACE在其活性位點有一個輔酶因子鋅離子（Zn2+），可以與His383，His387、Glu411形成離子鍵或配位鍵[29-30]。由圖7a可知，LFRAF與賴諾普利的位置基本一致，能夠整個嵌入ACE分子內部，與ACE分子良好對接。圖7b顯示了ACE氨基酸殘基與LFRAF相互作用的結果。LFRAF通過氫鍵與ACE分子的Glu162、His353、Lys511結合，通過離子鍵與Asp377、His387及Zn701結合，通過疏水相互作用與Phe527、His353結合。因此，LFRAF能夠占據ACE分子的催化活性中心（S2和S1’），同時與非活性中心的氨基酸殘基緊密結合，從而有效抑制血管緊張素I進入ACE催化活性位點，進而抑制ACE的催化活性。同時，與Zn2+結合能夠導致Zn2+與ACE分子間形成的四面體螯合結構發生扭曲變形，使ACE催化活性下降[31]。該結果同時驗證2.4節的研究結果，即C末端側鏈處大基團尤其芳香族氨基酸的存在有助于提高ACE抑制活性。

圖7 LFRAF與ACE分子對接結果圖Fig.7 Molecular docking results of LFRAF with ACE

3 結論

芝麻蛋白水解液經過超濾分離得到分子質量＜3 kDa組分具有最強的ACE抑制作用。采用NGC QuestTM10 Plus色譜系統進一步純化＜3 kDa組分，并通過液相色譜-質譜聯用儀從峰1組分中鑒定到9 個ACE抑制肽，這些寡肽安全性高，不會干涉人體正常的生理活動?；贑oMFA方法成功建立LFRAF的3D-QSAR模型，立體場與靜電場對ACE抑制活性影響相當。ACE抑制肽的C端處帶正電荷氨基酸殘基與側鏈處引入大基團能夠提高ACE抑制能力。LFRAF通過占據ACE的S2、S1’活性口袋，并與Zn2+結合從而抑制ACE活性。后續有必要開展寡肽的酶抑制類型研究及體內評價，尋找并結合信息學手段快速篩選活性強的ACE肽段，為開發高效食源性ACE抑制肽提供理論指導。