酸性偏移結合熱誘導對大豆分離蛋白微凝膠結構及其特性的影響

楊 平，徐彩紅，徐 昕，王麗娟，朱 旺，李佳美，孟憲軍，許 青,

（1.沈陽師范大學學前與初等教育學院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽師范大學糧食學院，遼寧 沈陽 110034；3.沈陽師范大學實驗技術中心，遼寧 沈陽 110034；4.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

微凝膠是尺寸在微米級及以下，由天然生物大分子構成的多孔三維網狀結構，具有高比表面積、多孔、易變形等優點，在食品乳化、功能性物質荷載與遞送等方面具有廣泛應用前景，是近年來食品科學研究的熱點[1]。

蛋白質作為兩親性分子，具有高度的聚集性和良好的膠凝性[2-3]，在一定的酸和熱誘導下，可以自組裝成多種形貌的凝膠結構，如牛奶中的酪蛋白和乳清蛋白、蛋清蛋白、膠原蛋白等均可自組裝成微凝膠[4]。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）作為天然大分子材料，來源廣泛、價格低廉，疏水性氨基酸含量較高，極性和帶電殘基比例大，是制備食品微凝膠的理想原料。

自組裝是基礎粒子由無序到有序轉變的過程，是一種制備具有吸引特性新粒子的新技術[5]。蛋白質的自組裝是分子內和分子間吸引力/排斥力的平衡所控制，自主裝作用力的大小不僅與蛋白質自身組成、結構有關，還與其所存在環境密切相關[6]。酸性偏移時蛋白質處于變性與未變性之間的熔球態，其氨基酸殘基具有較高的凈電荷[7]，電荷間的排斥力促使蛋白質結構展開，微環境的變化使其經歷去折疊、亞基解離以及再聚集過程，重新自組裝成微米顆粒[8]，Jiang Jiang等[9]研究發現酸性偏移可以改變大豆蛋白結構，提高其乳化性；李次力等[10]發現酸性偏移使大豆親脂蛋白發生自組裝；熱誘導能提供的額外分子間斥力，改變蛋白質暴露出的官能團，提高蛋白質顆粒的表面疏水性，改變蛋白質的結構[11]和功能[12]，乳清蛋白經過高溫可形成穩定性高、耐熱性好的球形網狀微凝膠[13]，王健等[14]發現酸性偏移能增加SPI在加熱過程中的柔性，使其結構更加舒展。蛋白質變性程度不同，會導致其表面氨基酸組成、電荷分布的差異，進而形成不同的微凝膠結構，不同蛋白質改性方法相結合，可以更加精準的定向調控蛋白質變性程度。因此，本研究通過酸性偏移結合熱誘導對蛋白質進行膠凝化改性，探究熱誘導溫度對微凝膠結構及其特性的影響，精準調控蛋白質的自組裝，為合理開發植物蛋白微凝膠提供理論支持和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕（純度94.2%）山東禹王實業有限公司；硫磺素T（thioflavin-T，ThT）、8-苯氨基萘-1-磺酸（8-phenylaminonaphthalene-1-sulfonic acid，ANS）美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

F97 Pro熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司；VEC-TOR33傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀、Dimension Icon原子力顯微鏡 德國Bruker公司；DSC 200 F3差示掃描量熱儀德國耐馳公司；S3500激光粒度分析儀 美國Microtrac公司；FE28 pH計 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；Scientz-12N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；X-12R高速冷凍離心機 美國Beckman公司；3150紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的提取

采用堿溶酸沉方法提取SPI，用10 倍質量的去離子水溶解低溫脫脂豆粕粉，調節pH值至8.0、室溫（25 ℃）攪拌2 h后，8000 r/min離心20 min，取上清液。再調節pH值至4.6，4 ℃靜置1 h后，上述條件再次離心，用2 mol/L NaOH溶液攪拌至沉淀充分溶解，調節pH值至7.0，4 ℃透析48 h，冷凍干燥后備用。

1.3.2 大豆分離蛋白微凝膠（soy protein isolate microgel，SPIM）制備

參考Li Ting等[15]方法稍作修改。用超純水配制10 mg/mL的SPI溶液，4 ℃水化過夜，3 mol/L HCl溶液調節pH值至2.0，15000 r/min離心15 min，取上清液。經6～8 kDa透析袋透析24 h后，稀釋至2 mg/mL，在不同溫度（25、45、55、65、75、85 ℃）條件下，以200 r/min恒溫攪拌12 h后4 ℃冷卻，得到SPIM初始液，冷凍干燥后保存。不同溫度下制備的微凝膠，分別記作25SPIM、45SPIM、55SPIM、65SPIM、75SPIM、85SPIM。

1.3.3 ThT熒光光譜分析

參考Gharanjig等[16]方法稍加修改。取質量濃度為2 mg/mL SPIM樣品溶液40 μL，經過0.24 μm濾膜過濾，與4 mL ThT工作液（0.4 mg/mL）充分混合后，進行熒光光譜分析。設定激發波長為440 nm，發射波長為488 nm，激發狹縫和發射狹縫為5 nm。

1.3.4 二級結構測定

取1～2 mg凍干的樣品與200 mg KBr充分研磨混勻，150 MPa加壓5 min后，FTIR掃描樣品[17]，掃描范圍為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。PeakFit 4.12軟件分析酰胺I帶（1600～1700 cm-1），用峰面積比率表示蛋白質二級結構的相對含量。

1.3.5 表面疏水性分析

采用ANS法[18]進行分析。取4 mL質量濃度為1 mg/mL的樣品與20 μL的8 mmol/L ANS充分混合，避光反應10 min后進行熒光分析，設定激發波長為365 nm，發射波長為484 nm。

1.3.6 粒度測定

取4 mL質量濃度為1 mg/mL的樣品，經0.45 μm濾膜過濾后，采用激光粒度分析儀測定樣品粒度，將樣品累計粒度分布達到10%、50%、90%時的粒度值，分別記作Dx（10）、Dx（50）、Dx（90）。

1.3.7 差示掃描量熱分析

稱取50 μL質量濃度為20 mg/mL的樣品，置于密封坩堝中，設定加熱溫度為20～200 ℃，升溫速率為10 ℃/min，利用差示掃描量熱儀自帶的軟件，計算變性溫度（Tm）和焓變（ΔH）。

1.3.8 微觀結構觀察

采用原子力顯微鏡輕敲模式觀察樣品的微觀形貌，設定頻率為320 kHz，掃描速率為1 Hz，silicon tips長度為125 μm，曲率半徑為42 N/m。

1.3.9 乳化性分析

參考栗俊廣等[19]方法，并作適當修改。取50 μL質量濃度為10 mg/mL的SPIM樣品與5 mL質量分數0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液充分混勻，用紫外分光光度計于500 nm波長處測定吸光度。按照下式計算乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsion stability index，ESI）：

式中：ρ為SPIM質量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分數（20%）；A0和A10為靜置時間為0 min和10 min的吸光度。

1.3.10 持水性的測定

準確稱取2 g的SPIM于離心管中，4 ℃、8000 r/min離心15 min后，稱量沉淀的質量，按下式計算凝膠持水率：

式中：m1為離心前SPIM的質量/g；m2為離心后SPIM的質量/g。

1.4 數據分析

采用SPSS 21.0軟件進行數據處理，單因素方差分析，實驗數據用表示，P＜0.05，差異顯著，有統計學意義，并采用Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 ThT熒光分析結果

ThT可以與蛋白質中β-折疊結構特異結合，β-折疊相對含量越多則ThT熒光強度越強[20]。圖1顯示，與25SPIM相比，酸性偏移結合熱誘導后SPIM的熒光強度增加，其中75SPIM和85SPIM的熒光強度最大，這可能由于酸性偏移環境使SPI表面呈現大量正電荷，分子間的靜電斥力增加，而酸性偏移結合熱誘導后，蛋白質體積發生一定程度的膨脹，使其表面靜電荷密度相對降低，分子間靜電斥力減小，部分結構互相靠近形成β-折疊結構[21]。

圖1 SPIM的形成動力學曲線Fig.1 Kinetic curves of SPIM formation

從圖1還可以看出，SPIM形成動力學曲線的最初2 h內熒光強度增長速率最快，而后速率逐漸減緩，在4～12 h處熒光強度達到最高并保持平穩。SPIM形成初期（0～4 h），樣品ThT熒光強度增大，可能是由于酸性偏移結合熱誘導后蛋白質二級結構發生轉變[22]，呈現“折疊-去折疊-復折疊”的變化，β-折疊相對含量增加[23]。平衡階段（4～12 h），樣品ThT熒光強度保持平穩，表明蛋白質二級結構轉變基本完成，β-折疊相對含量穩定，此階段以β-折疊作為自組裝的“構建單元”，相互交聯形成微凝膠[15]。

2.2 二級結構分析結果

FTIR可以分析不同熱誘導溫度對蛋白質二級結構的影響，以及微凝膠形成前后結構的變化。如圖2所示，25SPIM的酰胺I帶特征峰在1635 cm-1，酰胺II帶在1535 cm-1，而微凝膠形成后酰胺I帶的特征峰紅移至1610 cm-1附近，酰胺II帶的特征峰紅移至1525 cm-1附近，酰胺A帶（3000～3600 cm-1）吸收峰的強度和位置也發生改變，這表明靜電作用、疏水作用、氫鍵作用[24]參與了SPIM的自組裝。

圖2 SPIM的FTIR圖Fig.2 Fourier transform infrared spectra of SPIM

二級結構是蛋白質發揮功能的基礎，當α-螺旋/β-折疊比值降低時蛋白質的有序性會增加，結構變得疏松而有序、柔性增加[25]，當β-折疊相對含量增加、β-轉角相對含量降低時，蛋白質的穩定性會增加[26]。通過PeakFit軟件去卷積擬合FTIR的酰胺I帶，可以定量評價蛋白質二級結構的分類和比例，其中β-折疊、無規卷曲、α-螺旋、β-轉角結構對應波數分別為1610～1639、1640～1649、1650～1659、1660～1700 cm-1[27]。去卷積擬合后得到的各類二級結構占比（圖3），可見隨著溫度升高β-轉角相對含量逐漸減少，β-折疊相對含量逐漸增加，α-螺旋/β-折疊比值逐漸降低，其中75SPIM和85SPIM組的比值最小，均約為0.23，比25SPIM組降低了48.89%，這表明酸性偏移結合熱誘導增加了SPIM的柔性和穩定性。

圖3 SPIM的二級結構組成Fig.3 Secondary structure composition of SPIM

2.3 表面疏水性分析結果

疏水相互作用是維持蛋白質三級結構的主要作用力，表面疏水性指數可以表征蛋白質分子表面疏水基團的相對含量，是評價蛋白質構象變化的重要參數[28]。圖4顯示，酸性偏移結合熱誘導后，SPIM表面疏水性指數隨著溫度升高呈現先上升后下降的趨勢，其中65SPIM表面疏水性指數最大，顯著高于其他各組（P＜0.05），比25SPIM增加了43.98%。這可能是由于酸性偏移結合熱誘導會加速蛋白質高級結構解折疊，使其內部疏水性基團暴露，ANS熒光探針結合位點增多[29]；但當熱誘導溫度大于65 ℃時，大量疏水基團暴露于蛋白分子表面，疏水效應使疏水基團彼此靠近，蛋白質分子重新聚集，表面疏水性指數降低。

圖4 SPIM的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of SPIM

2.4 粒度分析結果

粒度分析可以闡明蛋白質聚集行為對其凝膠特性的影響。酸性偏移結合熱誘導后樣品的粒度分析結果如圖5、表1所示，各組樣品的粒度均在1000 nm以下，屬于微凝膠顆粒。如圖5所示，25SPIM粒度呈三峰分布，與其相比，45SPIM粒度分布3 個峰均左移，粒度變小；當熱誘導溫度大于55 ℃時，SPIM粒度分布轉為單峰，峰形態趨近于正態分布，表明酸性偏移結合熱誘導改變了蛋白質的形態。表1顯示，當熱誘導溫度大于55 ℃時，隨著溫度的升高Dx（50）值逐漸增加，這可能是由于自組裝是熱力學平衡條件下進行的分子重排過程，熱誘導使自組裝的“構建單元”運動加劇，有效碰撞機率增加，導致了平均粒度的增加。表1還顯示，隨著熱誘導溫度升高，比表面積逐漸增加，其中75SPIM的比表面積最大，為25SPIM的9.26 倍，顯著高于其他各組（P＜0.05），但當溫度大于75 ℃時，SPIM比表面積降低，表明熱誘導溫度過高不利于其比表面積的繼續增加。

表1 SPIM的粒度和比表面積Table 1 Particle size and specific surface area of SPIM

圖5 SPIM的粒度分布Fig.5 Particle size distribution of SPIM

2.5 差示掃描量熱分析結果

差示掃描量熱法可以分析熱誘導引起的蛋白質構象變化。Tm值為熱變性過程中，蛋白質中折疊狀態和去折疊狀態的含量相等時的溫度，其值越大蛋白質越穩定；ΔH表示蛋白質變性需要的能量，ΔH增大則需要更多的能量使蛋白質去折疊，蛋白質結構更緊湊[30]。表2顯示，酸性偏移結合熱誘導后，隨溫度升高樣品的Tm和ΔH值呈現先降低后升高的趨勢，其中55SPIM的Tm和ΔH值最低，75SPIM和85SPIM最高。這可能是由于酸性偏移結合低溫熱誘導引起了蛋白質結構解折疊，熱穩定性較低，而隨著熱誘導溫度繼續升高，蛋白質自組裝成結構緊湊的微凝膠，熱穩定性增加。

表2 SPIM的變性溫度和焓變值Table 2 Denaturation temperature and enthalpy change of SPIM

2.6 微觀形態觀察結果

圖6顯示酸性偏移結合不同溫度熱誘導后，SPIM微觀形態發生了明顯變化。25SPIM呈現球狀結構，顆粒大小均勻；45SPIM球狀結構部分消失，顆粒大小不均勻，出現細小的顆粒樣結構；55SPIM呈現長度較短的棒狀結構；65SPIM呈現樹形聚集物，分枝細長；75SPIM和85SPIM凝膠結構相似，都具有網狀的微觀結構。這可能由于酸性偏移結合低溫熱誘導時，自組裝的“構建單元”濃度較低，其端基相連成棒狀結構[31]，隨著熱誘導溫度升高，“構建單元”濃度增加，聚集成為空間網狀結構。由圖6還可見，75SPIM的孔徑較均勻且規則，網狀結構連續，而85SPIM部分網狀結構連續部分中斷，孔徑大小不一，出現熱誘導過度現象。

圖6 SPIM的微觀形態Fig.6 Microscopic morphology of SPIM

2.7 EAI及ESI分析結果

如圖7所示，隨著熱誘導溫度的升高，樣品的EAI和ESI呈現先升高后下降的趨勢。75SPIM的EAI及ESI顯著高于其他各組（P＜0.05），分別為87.17 m2/g和65.55%，較25SPIM分別提高了30.87%和85.54%，這可能由于SPIM二級結構中α-螺旋/β-折疊比值降低，凝膠柔性升高，利于蛋白-界面相互作用，可以承受更高的外界干擾，乳液的穩定性提高[32]。與75SPIM相比，85SPIM的EAI及ESI顯著降低（P＜0.05），這可能與其微觀結構的孔徑大小不均勻、網狀結構不連續、比表面積減小、吸附能力下降有關。

圖7 SPIM的EAI和ESIFig.7 EAI and ESI of SPIM

2.8 持水性分析結果

微凝膠的持水性可以反映其空間網狀結構的緊密程度。圖8顯示，隨著熱誘導溫度升高，微凝膠持水性呈現階段性變化，其中25～55 ℃階段，隨著溫度的升高，持水率呈現增加的趨勢，即55SPIM持水性最高，這表明熱誘導增加了微凝膠吸附和結合水的能力，且具有較強的穩定性和抗干擾能力。55～85 ℃階段，持水性呈現降低的趨勢，這可能與其微觀結構較緊密，基質中存在未結合的過量水，離心后這些水被釋放出來有關[33]。本研究持水率的變化與蛋白質二級結構中α-螺旋相對含量變化趨勢一致。

圖8 SPIM的持水性Fig.8 Water-holding capacity of SPIM

3 結論

通過酸性偏移結合熱誘導對SPI進行膠凝化改性，對比熱誘導溫度對SPIM結構及其凝膠特性的影響，發現適度的熱誘導能使SPI自組裝成孔徑大小均勻的網狀微凝膠。結果表明，酸性偏移結合熱誘導提高了蛋白質中β-折疊相對含量，靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵作用參與了微凝膠的自組裝。隨著熱誘導溫度升高，SPIM的表面疏水性指數先上升后下降，熱穩定性逐漸增強。與25SPIM相比，75SPIM的比表面積增加，乳化活性、乳化穩定性增強，持水性升高。綜上所述，酸性偏移結合熱誘導是一種調控蛋白質微凝膠結構和特性的有效方法，通過精準控溫可以提升微凝膠的質量。