矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)

王 偉，崔 妍，鄭明珠，蔡 丹，劉景圣，劉美宏，劉回民

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118）

2型糖尿病是一種以慢性高血糖為特征的復(fù)雜代謝性疾病，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)[1]。通過抑制消化酶（如α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）延緩腸道葡萄糖吸收是降低高血糖的有效手段[2]。阿卡波糖、伏格列波糖等常用于治療糖尿病的藥物，是通過抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性減少碳水化合物的水解。然而，這些藥物會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的副作用，例如胃腸道不適、肝酶損傷、腎功能損害等[3-4]。因此，尋找具有輕微或無不良影響的新型α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶天然抑制劑應(yīng)用于高血糖預(yù)防和治療非常重要。研究指出，天然來源的植物多酚具有較強(qiáng)的消化酶抑制活性和較低的毒性[5]。任順成等[6]發(fā)現(xiàn)梔子黃通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式能顯著抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的活性。此外，一些天然類黃酮化合物被發(fā)現(xiàn)可以通過非競(jìng)爭(zhēng)性抑制模式顯著抑制α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的活性，例如芹菜素、楊梅素以及槲皮素等[7-8]。

黑米花色苷（black rice anthocyanins，BRA）是黑米中的重要活性物質(zhì)，主要是由矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）、花青素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷組成[9]。C3G屬于多酚類黃酮物質(zhì)，具有多種生物活性，如抗炎、抗胰島素抵抗、調(diào)節(jié)血脂等[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，C3G可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，從而降低糖尿病小鼠的血糖水平并增強(qiáng)胰島素敏感性[11-12]。然而，C3G對(duì)α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的具體抑制機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過酶動(dòng)力學(xué)、熒光猝滅以及分子對(duì)接等方法對(duì)其抑制機(jī)制做進(jìn)一步的解析，以期為其在降糖保健食品的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶、豬胰α-淀粉酶、玉米淀粉 上海源葉生物科技有限公司；BRA、C3G 成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Fluostar omega多功能酶標(biāo)儀 德國BMG Labtech公司；SQP電子天平 德國Sartorius公司；1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；AllegraX-30R高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；LAMBDA365紫外-可見分光光度計(jì) 美國PerkinElmer公司；F7000熒光分光光度計(jì)日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果測(cè)定

采用PNPG法測(cè)定BRA對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性[13]。將25 μL的樣品溶液與25 μL 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液混合孵育15 min后，加入50 μL 1 mmol/L PNPG底物溶液。加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，隨后使用多功能酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定BRA對(duì)α-淀粉酶的抑制活性[14]。0.3 mL BRA溶液（1、3、5、7、9 mg/mL）加入0.3 mL 2.5 U/mL的α-淀粉酶溶液。混合液在37 ℃預(yù)熱5 min，加入預(yù)溫的1%淀粉溶液反應(yīng)15 min。使用多功能酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.2 超濾-高效液相色譜分析

將20 μL BRA（10 mg/mL）、20 μLα-淀粉酶（10 mg/mL）和160 μL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）混合并孵育30 min。置于10 kDa分子質(zhì)量的超濾離心管離心20 min以截留復(fù)合物，并洗滌除去未結(jié)合的組分。使用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液使α-淀粉酶變性。Ultimate LP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.5%甲酸溶液。洗脫方案如下：A相在0～2 min為90%，2～6 min為90%～80%，6～10 min為80%～70%，10～15 min為70%～65%，15～20 min為65%～50%，20～24 min為50%～10%，24～29 min為10%～90%，29～30 min為90%。柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min。結(jié)合率按下式計(jì)算：

式中：Aa為超濾篩選前各化合物色譜峰面積；Ab為親和篩選作用后活性酶結(jié)合的各化合物色譜峰面積；Ac為與變性酶結(jié)合的各化合物色譜峰面積。

1.3.3 酶抑制動(dòng)力學(xué)

酶抑制動(dòng)力學(xué)測(cè)定按照經(jīng)典方法進(jìn)行，略有修改[15]。具體如下：底物PNPG濃度調(diào)整為1 mmol/L，設(shè)定不同濃度α-葡萄糖苷酶（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 U/mL），添加不同濃度的C3G。根據(jù)酶濃度與酶反應(yīng)速率變化關(guān)系圖，判斷酶促反應(yīng)是否可逆。在α-葡萄糖苷酶（0.5 U/mL）的條件下，隨著PNPG濃度（0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L）增加，確定C3G對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制模式。

α-淀粉酶動(dòng)力學(xué)研究是根據(jù)1.3.1節(jié)反應(yīng)條件與各種質(zhì)量濃度（0、1、3、5 mg/mL）的抑制劑進(jìn)行，并且底物的質(zhì)量濃度范圍規(guī)定在5～15 mg/mL。同時(shí)，以1/V對(duì)不同質(zhì)量濃度底物的抑制劑質(zhì)量濃度作圖獲得α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制劑常數(shù)[16]。

1.3.4 紫外吸收光譜測(cè)定

根據(jù)劉碩等[17]的方法稍作修改。C3G溶液與α-淀粉酶溶液/α-葡萄糖苷酶溶液的質(zhì)量濃度比為0∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1，振蕩搖勻。在室溫下反應(yīng)15 min后，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍測(cè)定混合液的紫外吸收光譜。

1.3.5 熒光光譜學(xué)測(cè)定

配制成酶-抑制劑混合體系：300 μLα-葡萄糖苷酶溶液和100 μL不同質(zhì)量濃度的C3G溶液（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL）。測(cè)定混合體系熒光強(qiáng)度，發(fā)射波長(zhǎng)為300～450 nm，狹縫寬度為10 nm。α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶熒光光譜測(cè)定方法類似，其中C3G溶液質(zhì)量濃度分別為0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL。對(duì)照組：磷酸鹽緩沖液代替C3G。結(jié)合常數(shù)（Ka）、熒光猝滅常數(shù)（Kq）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）按式（2）和（3）計(jì)算：

式中：F0和F分別為α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶在沒有抑制劑和有抑制劑的情況下的熒光強(qiáng)度；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；τ0為不存在猝滅劑時(shí)熒光團(tuán)的平均壽命（其值約為10-8s）；[Q]為C3G的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；[P0]為α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

采用AutoDock 4.2分子模擬軟件進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)C3G與兩種酶的結(jié)合模式和作用力。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的PDB編號(hào)分別為3WY2、1DHK。酶蛋白結(jié)構(gòu)從UniProt（https://www.uniprot.org/）獲取，C3G小分子結(jié)構(gòu)從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取。結(jié)合能被用來評(píng)估酶蛋白與小分子的結(jié)合親和力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 BRA對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用

膳食淀粉可以被α-淀粉酶消化成還原糖，接著再被α-葡萄糖苷酶消化為葡萄糖，從而導(dǎo)致2型糖尿病患者的餐后血糖水平升高[18-19]。因此，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性對(duì)于延緩碳水化合物降解和葡萄糖吸收至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)BRA對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性，且對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制呈現(xiàn)劑量依賴性。由圖1A可知，當(dāng)BRA質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)到了81.22%。BRA對(duì)α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的抑制效果可以通過半數(shù)抑制濃度（IC50）表示，即BRA引起的α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶活力降低50%的結(jié)果。通過線性擬合計(jì)算得出，阿卡波糖（IC50=0.214 μg/mL）對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果高于BRA（IC50=13 μg/mL）。此外，圖1C、D顯示，BRA對(duì)α-淀粉酶的抑制作用與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且抑制效果低于阿卡波糖。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)BRA對(duì)α-淀粉酶的IC50（1.141 mg/mL）遠(yuǎn)大于α-葡萄糖苷酶，其原因可能是α-淀粉酶與BRA中活性物質(zhì)的親和能力比α-葡萄糖苷酶更弱。總而言之，BRA對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有較好的抑制作用，可能作為潛在的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑。

圖1 BRA和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶（A、B）和α-淀粉酶（C、D）的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of BRA and acarbose against α-glucosidase(A and B) and α-amylase (C and D)

2.2 BRA的高效液相色譜分析

對(duì)BRA進(jìn)行超濾-高效液相色譜分析，以鑒定出BRA中與酶蛋白結(jié)合的主要活性成分。如圖2A所示，超濾篩選前BRA提取物高效液相色譜圖中第3個(gè)樣品峰的出峰時(shí)間為13.250 min，與圖2B中C3G標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致，表明C3G是BRA的主要組分。此外，由圖2C可知，BRA中C3G與α-淀粉酶發(fā)生特異性結(jié)合后，活性酶組所捕獲的配體所對(duì)應(yīng)的波峰的強(qiáng)度與面積均大于失活酶組。因此，可以通過比較波峰面積反映C3G與α-淀粉酶的結(jié)合率。高效液相色譜圖數(shù)據(jù)顯示Aa=3421.62549、Ab=353.69589、Ac=48.32920，通過式（1）計(jì)算得C3G與α-淀粉酶的結(jié)合率為8.9%。由此可知，BRA中的C3G是對(duì)α-淀粉酶發(fā)揮抑制作用的主要活性成分。

圖2 BRA的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of BRA

2.3 α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析

對(duì)酶抑制劑的C3G單體進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究，以揭示C3G對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制。通過Lineweaver-Burk和Dixon圖確定C3G對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制模式[20-21]。如圖3A、C所示，所有直線都經(jīng)過原點(diǎn)，并且所有直線的斜率隨著C3G質(zhì)量濃度增加而減小，這表明C3G作為兩種酶蛋白的可逆抑制劑發(fā)揮作用。圖3B、D顯示，不同反應(yīng)體系的抑制曲線交點(diǎn)無限收斂于x正半軸。此外，Vmax持續(xù)下降，而Km值幾乎沒有變化，這表明C3G作為兩種酶蛋白的非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制劑起到了抑制作用（表1、2）。對(duì)于非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制，以Lineweaver-Burk方程中1/Vmax對(duì)相應(yīng)的抑制劑濃度I進(jìn)行二次繪圖得到直線的橫軸截距，可求出抑制常數(shù)Kiu[22-23]。1/Kiu值被用來衡量抑制劑與酶的親和力程度[24]。Dixon圖結(jié)果表明，α-葡萄糖苷酶與C3G（Kiu=0.05）間的相互作用比α-淀粉酶與C3G（Kiu=3.723）間的相互作用更強(qiáng)，這與酶活性抑制的結(jié)果保持一致（圖3）。因此，C3G以可逆非競(jìng)爭(zhēng)性的方式抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，且與兩種酶蛋白的親和程度有差異。

表1 C3G抑制α-淀粉酶的Vmax和Km值Table 1 Vmax and Km values of C3G against α-amylase

表2 C3G抑制α-葡萄糖苷酶的Vmax和Km值Table 2 Vmax and Km values of C3G against α-glucosidase

圖3 C3G對(duì)α-葡萄糖苷酶（A）與α-淀粉酶（C）的可逆抑制作用以及對(duì)α-葡萄糖苷酶（B）與α-淀粉酶（D）的雙倒數(shù)曲線圖Fig.3 Reversible inhibition of α-glucosidase (A) and α-amylase (C) by C3G and double-reciprocal curves for α-glucosidase (B) and α-amylase (D)

2.4 α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的紫外吸收光譜分析

如圖4所示，復(fù)合物體系在295 nm處有吸收峰且發(fā)生紅移現(xiàn)象（295～305 nm）。此外，固定α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶濃度，吸光度隨著C3G溶液質(zhì)量濃度的增大而增大。因此，這表明C3G與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用，使α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的肽鍵C＝O基團(tuán)的π-π*發(fā)生躍遷，導(dǎo)致酶的能量與活性降低。

圖4 C3G質(zhì)量濃度對(duì)α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）紫外吸收光譜的影響Fig.4 Effect of different concentrations of C3G on the UV absorption spectra of α-amylase (A) and α-glucosidase (B)

2.5 C3G對(duì)α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅效應(yīng)

熒光光譜通過測(cè)量熒光強(qiáng)度和最大發(fā)射波長(zhǎng)的變化監(jiān)測(cè)α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶中色氨酸殘基的微環(huán)境變化[25-26]。如圖5A所示，隨著C3G質(zhì)量濃度增大，α-淀粉酶中色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度顯著降低，熒光光譜發(fā)生明顯猝滅現(xiàn)象。在添加不同質(zhì)量濃度C3G（0～6 mg/mL）的過程中，最大發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)明顯的藍(lán)移現(xiàn)象（375～350 nm），這意味著C3G與α-淀粉酶的結(jié)合引起了色氨酸殘基周圍的疏水性變化。同樣地，C3G質(zhì)量濃度增大導(dǎo)致α-葡萄糖苷酶熒光強(qiáng)度呈規(guī)律性降低。此外，明顯的紅移（339～390 nm）現(xiàn)象表明，C3G會(huì)引起α-葡萄糖苷酶疏水鍵的斷裂，導(dǎo)致色氨酸等非極性氨基酸殘基暴露于極性環(huán)境中。

圖5 C3G質(zhì)量濃度對(duì)α-淀粉酶（A）和α-葡萄糖苷酶（B）熒光猝滅強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of different concentrations of C3G on the fluorescence quenching spectra of α-amylase (A) and α-glucosidase (B)

因此，C3G是α-淀粉酶/α-葡糖苷酶熒光的猝滅劑，并改變了α-淀粉酶/α-葡糖苷酶的特定結(jié)構(gòu)變化，這與高效液相色譜得出的結(jié)果保持一致。利用熒光色譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析得出α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅速率常數(shù)Kq=1.3×1012L/（mol·s），α-淀粉酶的熒光猝滅速率常數(shù)Kq=3.8×1011L/（mol·s）。此外，兩種糖苷酶的熒光猝滅速率常數(shù)Kq大于2×1010L/（mol·s），進(jìn)一步得出C3G熒光猝滅α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的過程不是由分子擴(kuò)散和動(dòng)態(tài)碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。總而言之，C3G在疏水作用力驅(qū)動(dòng)下可與兩種酶結(jié)合生成復(fù)合物，從而引發(fā)酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶的活性降低。

2.6 分子對(duì)接分析

分子對(duì)接被應(yīng)用于通過非共價(jià)鍵形成雙分子復(fù)合物的分析，主要包括疏水力和氫鍵[27]。通過該分析方法，獲得化合物與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合親和力和氨基酸殘基。經(jīng)線性擬合計(jì)算后，發(fā)現(xiàn)C3G與α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶可能存在1 個(gè)最佳結(jié)合位點(diǎn)（表3）。結(jié)合能Eb表示測(cè)試化合物對(duì)酶蛋白的結(jié)合親和力[28]。由表3可知，C3G與α-淀粉酶的電離能Eb為-7.8 kcal/mol，而與α-葡萄糖苷酶為-9.8 kcal/mol。此外，C3G與α-葡萄糖苷酶之間的結(jié)合親和力比α-淀粉酶高，這與熒光猝滅常數(shù)Kq和抑制常數(shù)Kiu結(jié)果一致。此外，Eb值均為負(fù)值，表明C3G-淀粉酶結(jié)合的相互作用是一個(gè)放熱過程。

表3 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的熒光參數(shù)Table 3 Fluorescence parameters of α-glucosidase and α-amylase

分子對(duì)接結(jié)果預(yù)測(cè)C3G與位于α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶非催化位點(diǎn)的氨基酸殘基相互作用，可能擾亂蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并以非競(jìng)爭(zhēng)方式抑制酶活性，進(jìn)而改變酶活力。如圖6E所示，C3G與α-淀粉酶結(jié)合位點(diǎn)附近對(duì)結(jié)合作用貢獻(xiàn)較大的氨基酸殘基為ASP316、LEU181、ALA214、TRP77和GLN81。與此同時(shí)，C3G和α-葡萄糖苷酶之間形成了4 個(gè)氫鍵（THR445、ARG429、ASP441、ASN46）相互作用。圖6F顯示，當(dāng)與α-葡萄糖苷酶結(jié)合時(shí)，C3G主要被氨基酸殘基HIS348、THR445、ARG429、HIS515、ASN46、GLU432、GLN438和ASP441包圍。此外，這些氨基酸殘基增加了抑制劑-酶復(fù)合物的穩(wěn)定性。總而言之，C3G可能是α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的潛在配體，通過非共價(jià)力與關(guān)鍵氨基酸殘基相互作用，發(fā)揮其對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

圖6 C3G與α-淀粉酶（A、C、E）和α-葡萄糖苷酶（B、D、F）的分子對(duì)接結(jié)果Fig.6 Molecular docking results of C3G with α-amylase (A,C and E) and α-glucosidase (B,D and F)

3 結(jié)論

本研究揭示BRA中的C3G對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制機(jī)制。結(jié)果表明，C3G與兩種酶的結(jié)合過程是自發(fā)的，生成酶-抑制劑復(fù)合物，導(dǎo)致α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的內(nèi)在熒光猝滅。此外，該抑制作用屬于非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制。C3G與ASP441、TRP等殘基以氫鍵結(jié)合，并與周圍眾多的疏水殘基存在疏水作用，共同維持復(fù)合物的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。本研究對(duì)于開發(fā)新型的食源性α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶抑制劑，推動(dòng)C3G在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定的參考價(jià)值。