單核細胞增生李斯特氏菌內化素InlJ對噬菌體敏感性及生物被膜形成的影響

劉半紅，胡梁斌，陸 睿，吳立婷，包紅朵，周 艷，王 冉，張 輝,

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

李斯特菌屬（Listeriaspp.）是一類能夠引起動物和人李斯特菌病的革蘭氏陽性細菌（G+），其中單核細胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes，Lm）是最重要的食源性人獸共患病原菌，感染者主要表現為腸胃炎、流產、腦炎及腦膜炎等，住院率可達91%，死亡率20%～30%，在新生兒中死亡率高達50%[1]。Lm在自然界中廣泛分布，常存在于人和蠕蟲類動物的腸道、土壤、水以及新鮮蔬菜中[2]，據美國FoodNet數據顯示，2017—2020年間，Lm在全美共引發食品中毒事件553 起，病死率高達16.25%[3]。作為一種胞內寄生菌，Lm在感染過程中，侵入細胞的主要毒力因子是其表面的內化素引發的，通過內化素進入、生存并在吞噬和非吞噬細胞內呈指數增殖[4]。此外，Lm為了在環境中生存，通過形成豐富的生物被膜黏附于生物或非生物表面[5]，由于生物被膜具有特殊的多層立體結構，可作為細菌的保護機制，幫助細菌逃避機體免疫系統的清除和藥物的殺滅[6]。

已有研究表明，約80%細菌感染與生物被膜形成有關，60%食源性食物中毒暴發事件均是由食源性致病菌生物被膜引起[7]。內化素InlA是最早鑒定出與宿主細胞特異性受體結合介導Lm進入非吞噬細胞的毒力因子[8]，比較基因組學發現內化素InlJ與內化素InlA結構相同[9]，C-末端包含Leu-ProX-Thr-Gly（LPXTG）基序元件，N-末端為LRR，通過分選酶Sort A識別共價結合到細胞壁肽聚糖上[10]。但有關InlJ功能的研究報道相對較少，目前僅有研究表明inlJ基因缺失可導致其毒力降低[9]，因而明確InlJ功能將有助于揭示擁有LPXTG及LRR結構域蛋白的新功能。Capestany等[11]發現牙齦卟啉單胞菌inlJ基因的缺失減少了生物被膜的形成，表明inlJ基因對生物被膜形成具有重要作用。噬菌體被視為細菌克星之一，能夠有效裂解宿主菌并抑制生物被膜形成。研究表明，噬菌體能夠很好地抑制和清除銅綠假單胞菌[12]、沙門氏菌[13]和大腸桿菌等生物被膜的形成，并在生物被膜相關的尿路感染、骨科感染和口腔感染[14]等得到很好地應用。肽聚糖是在革蘭氏陽性細菌的細胞壁上發現的最豐富的糖聚合物，其介導噬菌體的相互作用[15]。InlJ是Lm細胞壁表面蛋白家庭成員，能夠共價結合到細胞壁肽聚糖上，從而可能參與噬菌體與宿主的相互作用。為了進一步解析inlJ基因功能，本研究利用同源重組方法構建inlj基因缺失菌株，并對缺失株的生物學特性、噬菌體敏感性以及生物被膜形成進行研究，以期更有效地揭示inlJ基因在噬菌體與Lm相互作用中的調節功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LmNJ05（1/2a血清型）和噬菌體vB-LmoM-NJ05均由江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地保存和鑒定分離鑒定并保存；pKSV7溫度敏感型穿梭載體由揚州大學朱國強教授惠贈。

瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒、細菌總RNA提取試劑盒生工生物工程（上海）股份有限公司；T4DNA連接酶、限制性核酸內切酶 美國Thermo Fisher公司；DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒 北京擎科生物科技股份有限公司；氯霉素 上海源葉生物公司；牛腦心浸出液（brian heart infusion，BHI）養基 海博生物技術公司；逆轉錄試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SM830立式壓力蒸汽滅菌器 日本Yamato公司；SW-CJ-1F超凈臺 蘇州真田潔凈設備有限公司；Ultrospec-10-pro細胞密度計 美國Amersham Biosciences公司；PowerPac HC電泳儀、MicroPulserTM電穿孔儀、Universal Hood II凝膠成像系統、C1000Touch梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；多功能酶標儀 美國Thermo公司；5810R高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取LmNJ05基因組DNA。

1.3.2 引物設計

參考Gen Bank 中標準菌株EDG-e 基因組序列（NC_003210.1），并比對同源性及分析最大開放閱讀框后，利用Primer 6.0軟件設計引物和分子鑒定引物（表1），引物P1和P2用于擴增inlJ基因片段確定上下游同源臂，分別于引物P3和P4的5’端及3’端加BamHI和KpnI酶切位點和保護性堿基。實驗引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列Table l Primer sequences designed in this study

1.3.3 重組穿梭質粒pKSV7-ΔinlJ的構建

以LmNJ05 DNA為模板，通過引物P1和P2擴增，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序鑒定。經Overlap PCR擴增上、下游同源臂純化產物，將融合產物與pUC57載體，命名為pUC57-ΔinlJ，通過大腸桿菌DH5α感受態細胞轉化后測序；以引物P3和P4擴增陽性克隆并測序鑒定。將穿梭質粒pKSV7和ΔinlJ目的條帶分別用BamHI和KpnI于37 ℃酶切，然后用T4DNA連接酶16 ℃連接過夜，將連接產物用熱激轉化法（42 ℃），轉化至DH5α感受態細胞，涂布含有氨芐青霉素（50 μg/mL）的LB平板，37 ℃過夜培養。隨機挑取疑似陽性轉化子，經PCR鑒定陽性菌，并送公司測序進一步驗證以獲得構建成功的重組質粒pKSV7-ΔinlJ。

1.3.4LmNJ05-ΔinlJ缺失株的構建、篩選和鑒定

根據Parsons等[16]方法制備LmNJ05感受態細胞。取1 μg pKSV7-ΔinlJ加入100 μLLmNJ05感受態細胞中并混勻，隨后電擊轉化（2.5 kV/cm、4.8 ms），涂布到含有氯霉素（10 μg/mL）的BHI固體平板上，30 ℃恒溫靜置培養48 h，隨機挑取單菌落接種到含氯霉素（10 μg/mL）的BHI液體培養基中，在氯霉素和溫度（42 ℃）雙重壓力下進行同源重組，并以P3和P4為引物，PCR擴增（反應條件同上）篩選陽性轉化子。在30 ℃無氯霉素壓力條件下傳代培養約10 代完成質粒pKSV7消殺過程，將末代菌液涂布BHI平板，挑取單菌落再次進行PCR及測序鑒定，最終獲得無氯霉素抗性的LmNJ05-ΔinlJ缺失株。

1.3.5LmNJ05-ΔinlJ缺失株生長特性

將LmNJ05、LmNJ05-ΔinlJ劃線于BHI固體平板，37 ℃倒置過夜培養。次日，挑取單菌落到BHI液體培養基，37 ℃、200 r/min振蕩培養至對數期（OD600nm約為0.6），再按體積比為1∶100接入到新鮮BHI液體培養基中，置于37 ℃培養箱中靜置培養，每隔30 min取出測定OD600nm，用OriginPro 8.5軟件繪制生長曲線。

1.3.6LmNJ05-ΔinlJ缺失株對細胞的黏附和侵襲性

將培養的小鼠巨噬細胞RAW264.7經胰蛋白酶消化后移至48 孔細胞培養板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養至細胞密度約為5.0×105Cell/mL。棄去培養液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將細胞漂洗3 遍，加入無抗改良Eagle培養基（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco，DMEM）。每孔加入LmNJ05-ΔinlJ缺失株培養液0.5 mL（5×107CFU/mL）培養1 h，PBS洗滌細胞3 次，加入300 μL 0.2% Triton X-100和胰蛋白酶作用15 min，吸取各孔懸液，稀釋后涂板計數測定黏附細菌的數量。每孔中細胞用PBS洗滌2 次，并重新懸浮在含有慶大霉素（100 μg/mL）的1 mL DMEM培養基中，以測定侵襲細菌的數量。每個實驗重復3 次。

1.3.7LmNJ05-ΔinlJ缺失株噬菌體成斑率（efficiency of plaquing，EOP）分析

取過夜培養LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ菌液，調整各菌液OD600nm值為1.0（108CFU/mL），分別與相同濃度的vB-LmoM-NJ05噬菌體進行雙層平板EOP實驗，記錄噬菌斑數量，計算LmNJ05-ΔinlJ突變體的EOP，判斷噬菌體與突變體的反應敏感性。計算公式如下：

式中：A為測試菌株（LmNJ05-ΔinlJ）噬菌斑形成量/（PFU/mL）；B為標準菌株（LmNJ05）噬菌斑形成量/（PFU/mL）。

1.3.8 噬菌體對LmNJ05-ΔinlJ缺失株裂解活性

分別調整LmNJ 05 和LmNJ 05-ΔinlJ菌液至OD600nm=1.0，取500 μL菌液加入48 孔板中，以最佳感染復數為1加入500 μL噬菌體，并設置相應菌株對照組，每隔30 min通過酶標儀測定OD600nm值，直至10 h。

1.3.9 噬菌體對生物被膜抑制和清除能力測定

噬菌體vB-LmoM-NJ05對LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ生物被膜的抑制和清除能力實驗方法如下：BHI瓊脂平板劃線復蘇菌株，分別挑取單菌落至5 mL BHI肉湯，37 ℃振蕩過夜培養16 h，調整到OD600nm至0.1，加入100 μL菌液到96 孔板中，分成兩組：A組抑制生物被膜實驗，加入100 μL不同濃度的噬菌體vB-LmoM-NJ05（105、106、107、108PFU/mL），37 ℃靜置培養48 h，之后結晶紫染色；B組清除生物被膜實驗，菌液培養48 h后，除去各孔的浮游菌，并用PBS洗滌3 次，加入100 μL不同滴度的噬菌體vB-LmoM-NJ05（104、105、106、107、108PFU/mL）與生物被膜在37 ℃孵育12 h，然后結晶紫染色，酶標儀測定OD590nm。

1.3.10 RNA提取、cDNA合成及逆轉錄實時PCR（reverse transcription real-time PCR，RT-real-time PCR）

為了闡明內化素InlJ在生物被膜形成及其在噬菌體敏感性中的作用，利用RT-real-time PCR分析生物被膜相關基因（hpt、agrD、yneA、agrA、degU、luxS、flaA和recA）轉錄表達水平，引物信息建表2。簡而言之，將1 mLLmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ（108CFU/mL）分別與1 mL噬菌體vB-LmoM-NJ05（108PFU/mL）37 ℃靜置2 h，將混合物10000×g離心5 min，將LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ作為對照組。根據產品說明提取總RNA，逆轉錄試劑盒進行cDNA合成。real-time PCR體系[17]：2 μL cDNA、0.5 μL上下游引物、10 μL SYBR Green qPCR Supermix和7.5 μL RNase-free H2O進行real-time PCR，反應終體積為20 μL。real-time PCR的循環參數如下：95 ℃預變性30 s、95 ℃變性10 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，40 個循環。

表2 RT-real-time PCR引物Table 2 RT-real-time PCR primers

1.4 數據處理與統計分析

運用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析，組間差異采用t檢驗。采用OriginPro 8.5和GraphPad Prism 9.0.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 重組穿梭質粒pKSV7-ΔinlJ的鑒定

對穿梭載體pKSV7和基因片段ΔinlJ酶切，T4DNA連接酶連接，轉化至DH5α，挑選陽性克隆，測序結果表明，ΔinlJ缺失序列分別由上游222 bp和下游239 bp組成，全長共461 bp。電泳結果和預期大小相符，測序結果比對一致，表明重組穿梭質粒pKSV7-ΔinlJ構建成功（圖1）。

圖1 重組質粒pKSV7-ΔinlJ鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pKSV7-ΔinlJ

2.2 Lm NJ05-ΔinlJ構建、篩選與鑒定

如圖2所示，pKSV7-ΔinlJ質粒和inlJ基因缺失株擴增產物均為332 bp，未擴增出inlJ序列；而LmNJ05野生株擴增產物為2888 bp的inlJ基因序列（圖2），表明inlJ基因完全缺失，成功構建穩定的inlJ基因缺失株，命名為LmNJ05-ΔinlJ。

圖2 缺失株Lm NJ05-ΔinlJ鑒定Fig.2 Identification of Lm NJ05-ΔinlJ

2.3 Lm NJ05-ΔinlJ生長曲線測定

將LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ在37 ℃條件下培養10 h，通過酶標儀檢測其OD600nm值，根據結果繪制生長曲線見圖3，顯示缺失株LmNJ05-ΔinlJ與野生株LmNJ05在0～3 h時間段內均處于適應期，3～7 h時間段內處于對數期，生長趨勢無顯著差異，由此可見，inlJ基因的缺失對其生長特性無顯著影響。

圖3 Lm NJ05-ΔinlJ缺失株生長曲線Fig.3 Growth curve of Lm NJ05-ΔinlJ

2.4 黏附性與侵襲性

通過RAW264.7細胞分析缺失株LmNJ05-ΔinlJ對細胞黏附和侵襲活性的變化，由圖4可知，LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ對RAW264.7細胞的黏附率分別為33.5%和20.05%（圖4），LmNJ05-ΔinlJ的黏附能力顯著降低（P＜0.05）。對RAW264.7細胞的侵襲性結果表明，LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ對RAW264.7細胞的侵襲力分別為8.25%和4.42%（圖5），缺失株侵襲力顯著下降（P＜0.01）。綜上所述，inlJ基因缺失對細胞的黏附和侵襲性均減弱。

圖4 Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ對細胞的黏附能力Fig.4 Cell adhesion of Lm NJ05 and Lm NJ05-ΔinlJ

圖5 Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ對細胞的侵襲能力Fig.5 Cell invasion of Lm NJ05 and Lm NJ05-ΔinlJ

2.5 Lm NJ05-ΔinlJ對噬菌體vB-LmoM-NJ05敏感性

通過EOP分析LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ對噬菌體的敏感性。結果表明，LmNJ05-ΔinlJEOP較LmNJ05高至2.72 倍（表3），表明inlJ基因缺失會影響噬菌體和宿主菌株之間的敏感性，成斑效果增強。此外，與野生株LmNJ05相比，缺失株LmNJ05-ΔinlJ形成的噬菌體斑更加清晰透明（圖6），進一步表明缺失inlJ基因能夠增強其與噬菌體的敏感性。

圖6 Lm NJ05（A）和Lm NJ05-ΔinlJ（B）EOP分析Fig.6 EOP analysis of Lm NJ05 (A) and Lm NJ05-ΔinlJ (B)

表3 噬菌體vB-LmoM-NJ05的EOPTable 3 EOP of phage vB-LmoM-NJ05

2.6 Lm NJ05-ΔinlJ對噬菌體vB-LmoM-NJ05裂解活性

由圖7可知，噬菌體vB-LmoM-NJ05對LmNJ05-ΔinlJ抑制效果更顯著。在作用2 h內，噬菌體對LmNJ05和LmNJ05-ΔinlJ作用效果相似，但在2 h后至10 h，噬菌體對LmNJ05-ΔinlJ的敏感性明顯增強，與LmNJ05相比呈顯著差異。由此可見，inlJ基因缺失能夠增強其對噬菌體vB-LmoM-NJ05裂解活性。

圖7 噬菌體對Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ體外裂解活性Fig.7 Lytic activity of phage on Lm NJ05 and Lm NJ05-ΔinlJ

2.7 噬菌體對Lm生物被膜抑制及清除效果

由圖8可知，inlJ基因缺失之后，LmNJ05-ΔinlJ生物被膜形成能力顯著降低（P＜0.01），當噬菌體vB-LmoM-NJ05以105PFU/mL作用Lm，能夠有效抑制生物被膜的形成，且對LmNJ05-ΔinlJ抑制能力更強（P＜0.05），同樣以106～108PFU/mL噬菌體作用后，能夠完全抑制生物被膜形成。利用噬菌體清除生物被膜的結果表明，當以108PFU/mL噬菌體作用時，能夠完全清除LmNJ05-ΔinlJ形成的生物被膜，與LmNJ05呈顯著差異（圖9，P＜0.001）。由此可見，inlJ基因的缺失，使其生物被膜的形成能力減弱，從而使噬菌體對其清除力更為顯著。

圖8 噬菌體對Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ生物被膜抑制能力Fig.8 Biofilm inhibitory effect of phage against Lm NJ05 and Lm NJ05-ΔinlJ

圖9 噬菌體對Lm NJ05和Lm NJ05-ΔinlJ生物被膜清除能力Fig.9 Biofilm removal capacity of phage against Lm NJ05 and Lm NJ05-ΔinlJ

2.8 生物被膜形成相關基因的轉錄分析

flaA、degU、agrA、agrD和luxS等基因參與早期生物被膜形成，而yneA、recA和hpt等基因作用于生物被膜成熟階段[18]。RT-real-time PCR的結果表明，與LmNJ05相比，LmNJ05-ΔinlJ編碼生物被膜相關基因degU、agrA、agrD、luxS、yneA、recA和hpt的轉錄水平均下降（圖10）。當噬菌體vB-LmoM-NJ05作用缺失株后，生物被膜相關基因轉錄水平下降極為明顯，均呈下調趨勢。由此可見，inlJ基因缺失負調控生物被膜形成相關基因的表達，降低生物被膜的形成能力。此外，當噬菌體作用后，生物被膜形成相關基因轉錄下調極為顯著，從而缺失株生物被膜形成能力減弱，噬菌體對其更具清除能力。

圖10 生物被膜形成相關基因的表達分析Fig.10 Relative expression levels of biofilm formation-related genes

3 討論

Lm表面蛋白是細菌代謝、群體感應、生物被膜形成和毒力基因表達調控的重要調節因子，與細菌致病性密切相關。由于表面蛋白的存在使Lm能夠在低溫環境中[19]復制增殖，并且侵染多種真核細胞[20]。迄今為止，在Lm基因組中發現了41 個編碼LPXTG蛋白的基因[21]，inlA是最早被發現的介導Lm入侵宿主細胞的LPXTG表面蛋白基因，其主要作用機制是與宿主細胞上的特異性受體結合，誘導非吞噬細胞將菌體內吞進入細胞內部寄生，許多研究表明inlA在穿透腸道屏障的過程中發揮重要作用[22]。inlJ是編碼LPXTG蛋白的基因之一，任靜靜等[23]發現，inlJ缺失株對小鼠的感染能力和毒力均降低。本研究中，LmNJ05-ΔinlJ對RAW264.7細胞侵襲和黏附均顯著降低，由此表明，inlJ參與了Lm的毒力作用機制。

噬菌體作為天然生物抑菌劑已在食品及醫藥領域受到越來越多的關注[24]，由于其在去除致病菌污染[25]和消除生物被膜[26]的形成的優勢，已被嘗試用于水果、即食食品[27]、奶酪和牛奶[28]等食品的保鮮抑菌和人類疾病的臨床治療中[29]。細菌可以通過多種方式避免被噬菌體感染[30]，例如吸附阻斷和阻礙噬菌體DNA的進入。在本研究中，重點分析了食源性LmNJ05中inlJ基因作用特性，結果表明inlJ基因缺失使其對噬菌體vB-LmoM-NJ05的敏感性增強。缺失株LmNJ05-ΔinlJ對噬菌體的EOP增加到2.72 倍，噬菌斑更清晰透明，且噬菌體對LmNJ05-ΔinlJ抑制活性更強。由此可見inlJ基因參與Lm與噬菌體的相互作用。

生物被膜能夠保護微生物在不利環境中持續生長，使環境各介質之間反復交叉污染[31]。王少輝等[32]研究表明，inlK基因的缺失會導致Lm生物被膜形成能力顯著降低。本研究中inlJ基因的缺失降低了Lm生物被膜的形成，這可能是InlJ與InlK一樣同屬于Lm表面蛋白，與細菌胞外蛋白或組織表面的物質發生相互作用，有利于Lm黏附在物體表面促進生物被膜的形成。此外，本研究發現噬菌體vB-LmoM-NJ05也能夠很好地抑制和清除Lm生物被膜，特別是對于LmNJ05-ΔinlJ缺失株，抑制效果更為明顯，這可能與InlJ表面蛋白的缺失導致生物被膜的形成能力降低，噬菌體vB-LmoM-NJ05對LmNJ05-ΔinlJ敏感性增強相關。Lm生物被膜的形成與很多因素相關，例如鞭毛糖蛋白相關因子FlaA、DegU，群體感應系統相關因子Agr、LuxS和胞外基質相關因子yneA、Hpt等[33-36]。本研究發現inlJ基因的缺失導致參與生物被膜形成的相關基因表達降低，并且在LmNJ05-ΔinlJ與噬菌體vB-LmoMNJ05相互作用后，使這些基因幾乎無應答。由此表明，inlJ基因缺失影響生物被膜基因表達，降低Lm生物被膜的形成能力，與噬菌體作用之后，生物被膜形成相關基因表達持續降低，以此抑制和清除生物被膜。綜上所述，LPXTG蛋白會參與噬菌體與Lm間的識別及互作，目前暫未見相關報道，但其為LPXTG蛋白在噬菌體敏感性中的功能揭示將為噬菌體對抗菌和治療中提供重要的理論支撐。

4 結論

通過同源重組技術成功構建了缺失株LmNJ05-ΔinlJ，inlJ基因缺失對細胞的黏附和侵襲性下降，減弱了生物被膜形成能力，但對噬菌體的敏感性顯著增強，進而使噬菌體對缺失株LmNJ05-ΔinlJ生物被膜的抑制和清除能力得到了顯著提高，生物被膜形成相關基因的表達呈下調趨勢。由此可見，作為LPXTG蛋白成員的InlJ參與噬菌體與Lm間的識別及相互作用，這為LPXTG蛋白新功能的揭示奠定了重要依據，為噬菌體的生物防治提供了新的理論依據。