砧木對(duì)歐亞種葡萄‘小味多’果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的影響

周曉航，王雯染，李惠清，王 軍，何 非

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

香氣是構(gòu)成葡萄果實(shí)及葡萄酒感官品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[1]。香氣物質(zhì)在葡萄果實(shí)中通常以游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)2 種形式存在，其中游離態(tài)形式對(duì)葡萄果實(shí)和葡萄酒香氣的呈現(xiàn)有直接貢獻(xiàn)，而結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)則在葡萄酒釀造和陳釀過(guò)程中通過(guò)水解釋放出游離態(tài)的苷元，通過(guò)累加、協(xié)同、抑制等相互作用賦予葡萄酒豐富而獨(dú)特的香氣輪廓[2]。

葡萄果實(shí)和葡萄酒中的香氣物質(zhì)主要包括萜烯類(lèi)、C13-降異戊二烯類(lèi)、甲氧基吡嗪類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)、揮發(fā)性酸類(lèi)物質(zhì)和含硫化合物等。萜烯是葡萄中一類(lèi)重要的次生代謝產(chǎn)物[3]，目前在釀酒葡萄果實(shí)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了70多種萜烯類(lèi)物質(zhì)[4]，其中對(duì)葡萄和葡萄酒香氣有重要貢獻(xiàn)的物質(zhì)主要是單萜、倍半萜及其衍生物[5]。C13-降異戊二烯類(lèi)化合物是由類(lèi)胡蘿卜素及含40 個(gè)碳原子的萜類(lèi)物質(zhì)氧化降解產(chǎn)生[6]，在葡萄酒中呈現(xiàn)令人愉悅的花果香氣味[7]。甲氧基吡嗪是一類(lèi)含氮的六元雜環(huán)化合物[8]，被認(rèn)為是葡萄和葡萄酒中青椒、蘆筍、青豆等生青氣味的主要來(lái)源[9]。酯類(lèi)物質(zhì)主要賦予葡萄和葡萄酒果香，對(duì)葡萄酒的香氣感官品質(zhì)起著積極作用。醇類(lèi)物質(zhì)主要包括C6/C9醇和其他高級(jí)醇，其中C6/C9醇賦予葡萄和葡萄酒青草味和植物味，而高級(jí)醇則賦予了葡萄酒化學(xué)味，通常被認(rèn)為對(duì)葡萄酒的感官有負(fù)面影響。揮發(fā)性酸類(lèi)物質(zhì)賦予葡萄酒脂肪味和酸腐味，一般認(rèn)為它們會(huì)對(duì)葡萄酒的香氣產(chǎn)生不利影響[10]。含硫化合物通常是在發(fā)酵或陳釀過(guò)程中產(chǎn)生[11]，特別是硫醇類(lèi)物質(zhì)會(huì)賦予葡萄酒獨(dú)特的香氣[12]。

因?yàn)榫哂锌垢鲅痢⒖咕€(xiàn)蟲(chóng)、抗旱、抗鹽堿、耐寒、耐濕等優(yōu)良特性[13-16]，葡萄砧木在葡萄栽培中廣泛使用。Cheng Jing等[17]分析了5 種砧木嫁接對(duì)‘霞多麗’葡萄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)特征的影響，發(fā)現(xiàn)砧木‘1103P’能顯著提高果實(shí)中游離和結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)含量。Wang Yu等[18]通過(guò)比較8 個(gè)砧木品種對(duì)‘赤霞珠’葡萄揮發(fā)性物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)砧木‘110R’、‘Riparia Gloire’和‘SO4’可以顯著降低‘赤霞珠’葡萄果實(shí)中酯類(lèi)物質(zhì)的含量。韓曉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，砧木‘1103P’可以顯著提高‘丹娜’葡萄果實(shí)中C6/C9類(lèi)物質(zhì)的含量，‘SO4’則可以顯著提高‘丹娜’葡萄果實(shí)中C13-降異戊二烯類(lèi)物質(zhì)的含量。李敏敏等[20]以8 個(gè)砧木品種分別嫁接‘小味多’，研究其對(duì)‘小味多’葡萄生長(zhǎng)、結(jié)果和果實(shí)品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，‘101-14’、‘3309C’為砧木嫁接的主干粗度顯著小于其自根苗，其余6 種砧木嫁接的‘小味多’主干粗度與自根苗無(wú)顯著差異。顯然，砧木對(duì)接穗品種果實(shí)品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響取決于氣候-土壤條件。

‘小味多’原產(chǎn)于法國(guó)，是法國(guó)波爾多六大法定品種之一，其果實(shí)有機(jī)酸和單寧含量較高，所釀葡萄酒香氣馥郁，酒體豐滿(mǎn)而強(qiáng)勁，適宜陳釀，多用于紅葡萄酒的混釀以加強(qiáng)葡萄酒的結(jié)構(gòu)感。近些年來(lái)，‘小味多’葡萄在我國(guó)一些產(chǎn)區(qū)開(kāi)始試種和推廣[21]。關(guān)于‘小味多’葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)已有相關(guān)報(bào)道，但是關(guān)于不同砧木嫁接對(duì)‘小味多’葡萄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的影響目前報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（head space solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，以‘小味多’自根苗葡萄為對(duì)照，比較5 個(gè)砧木品種嫁接對(duì)商業(yè)成熟期‘小味多’葡萄果實(shí)游離態(tài)和結(jié)合態(tài)香氣化合物組分和含量的影響，以期為實(shí)際生產(chǎn)中‘小味多’嫁接砧木的選擇與應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)于2016—2017年連續(xù)2 a在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站（40.14°N，116.19°E）進(jìn)行。葡萄園為平地，海拔高度為49 m，年平均氣溫12.5 ℃，年平均降雨量約630 mm，年日照時(shí)數(shù)2662 h，無(wú)霜期211 d。2016—2017年連續(xù)2 a的氣象數(shù)據(jù)來(lái)源于中國(guó)氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)（http://data.cma.cn/），觀(guān)測(cè)點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)地的直線(xiàn)距離約為45.2 km。

實(shí)驗(yàn)所用的5 個(gè)砧木品種分別為‘101-14’、‘1103P’、‘Beta’、‘5BB’、‘SO4’。接穗品種為‘小味多’（記為PV）。砧木苗于2010年定植，當(dāng)年綠枝嫁接‘小味多’，以自根苗作為對(duì)照。葡萄園南北行向，行距2.5 m、株距1.2 m。每5 株葡萄為1 個(gè)單元，每個(gè)單元栽植同一個(gè)砧穗組合的苗木；每種砧穗組合設(shè)置3 個(gè)單元，計(jì)為3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。葡萄葉幕形為改良的VSP（M-VSP），留梢量為12～15 支/m（行），葉幕高度和寬度分別保持在約1.2 m和0.7 m。灌溉方式為滴灌。采用常規(guī)葡萄園管理方法按照相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行滴溉、施肥和病蟲(chóng)害防控等田間操作。于每年商業(yè)采收期進(jìn)行樣品采集，每個(gè)處理每次重復(fù)隨機(jī)采集300 粒葡萄漿果。采集后放入冰盒，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。隨機(jī)選取100 粒漿果用于葡萄果實(shí)理化指標(biāo)的測(cè)定，其余樣品液氮速凍后保存于-40 ℃冰箱中以備后續(xù)香氣物質(zhì)的分析。

二氯甲烷、酒石酸（均為分析純）、葡萄糖北京化工廠(chǎng)；己醇、(E)-3-己烯醇、(Z)-3-己烯醇、(E)-2-己烯醇、(Z)-2-己烯醇、己醛、壬醛、(E)-2-己烯醛、月桂烯、檸檬烯、里那醇、α-萜品醇、香茅醇、檸檬醛、香葉基丙酮、香葉醇、橙花醇、茶螺烷、β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮和4-甲基-2-戊醇（內(nèi)標(biāo)）等香氣標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1手持糖度計(jì) 日本ATAGO公司；PB-10 pH計(jì)、BSA223S天平 賽多利斯有限公司；FD-1C-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；S63300HBT超聲波儀 上海冠特超聲儀器有限公司；Micro 17R離心機(jī)美國(guó)賽默飛世爾公司；6890-5975 GC-MS聯(lián)用儀美國(guó)Agilent公司；Cleanert PEP-SPE固相萃取柱（150 mg/6 mL）美國(guó)Bonna-Agela科技公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維 美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 果實(shí)理化指標(biāo)檢測(cè)

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定[22]。每個(gè)砧穗組合每次重復(fù)隨機(jī)選取100 粒葡萄漿果用于理化指標(biāo)分析。首先稱(chēng)量100 粒漿果的百粒質(zhì)量，再將100 粒葡萄漿果壓榨取汁，8000 r/min條件下離心10 min，取上清液用手持糖度儀測(cè)定總可溶性固形物含量（以°Brix表示）；用pH計(jì)測(cè)定pH值；用酸堿滴定法測(cè)定可滴定酸含量，以酒石酸當(dāng)量表示，單位為g/L。

1.3.2 游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的提取

參考Wen Yaqin等[23]的實(shí)驗(yàn)方法，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)取葡萄果實(shí)50 g，用液氮冷凍，除梗去種子，加入0.5 gD-(+)-葡萄糖酸δ-內(nèi)酯，在液氮保護(hù)下研磨成粉末。然后在4 ℃條件下靜置浸提4 h，之后離心得到澄清葡萄汁，其中一部分直接用于游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)，另外一部分葡萄汁用于糖苷結(jié)合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的提取。每個(gè)樣品進(jìn)行2 次重復(fù)。

1.3.3 結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的提取

固相萃取柱依次加入10 mL甲醇和10 mL水進(jìn)行活化，然后加入1 mL上述澄清葡萄汁，之后加入5 mL蒸餾水洗脫去除糖、酸等低分子質(zhì)量的極性化合物，加入5 mL二氯甲烷洗脫去除游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的干擾，最后用20 mL色譜純甲醇將結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)洗脫。收集洗脫液至50 mL的圓底燒瓶?jī)?nèi)，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入10 mL檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 2.5）重新溶解，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，置于100 ℃恒溫油浴鍋中1 h以水解糖苷態(tài)香氣物質(zhì)。反應(yīng)結(jié)束后用于糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的檢測(cè)。

1.3.4 揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)

參考Wu Yuwen等[24]的方法，取5.0 mL上述澄清葡萄汁或酸解溶液于20 mL香氣進(jìn)樣小瓶中，加入1.00 g NaCl，準(zhǔn)確加入10 μL的4-甲基-2-戊醇溶液（內(nèi)標(biāo)，1.0018 mg/mL），用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊，置于CTC-PAL自動(dòng)進(jìn)樣裝置上加熱攪拌30 min，然后將已活化的SPME萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）插入進(jìn)樣小瓶的頂空部分，在40 ℃條件下繼續(xù)加熱攪拌30 min，隨后取出SPME萃取頭自動(dòng)插入GC-MS進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解吸8 min。

G C-MS 條件：HP-INNOWAX 毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純度氦氣，流速為1 mL/min。升溫程序如下：50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min升溫至220 ℃，最后保持5 min。電子電離源；進(jìn)樣口溫度250 ℃，采取不分流模式；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)譜接口溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍為30～350 u。

揮發(fā)性物質(zhì)的定性根據(jù)NIST11標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中的保留指數(shù)和質(zhì)譜信息進(jìn)行。揮發(fā)性物質(zhì)定量根據(jù)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)葡萄果實(shí)的糖、酸含量，配制葡萄汁模擬液（200 g/L葡萄糖、7 g/L酒石酸，pH值用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)至3.4），然后用模擬液溶解揮發(fā)性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（混標(biāo)），再用模擬液進(jìn)行15 個(gè)梯度稀釋?zhuān)珿C-MS檢測(cè)前加入10 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，使用同樣的萃取方法和GC-MS分析條件，檢測(cè)并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣物質(zhì)利用具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)或相近碳原子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)化合物進(jìn)行定量。揮發(fā)性物質(zhì)的含量以mg/kg（果實(shí)鮮質(zhì)量）表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS（V23.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan多重比較進(jìn)行年份與砧木的雙因素方差分析（P＜0.05）；采用SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣象數(shù)據(jù)

根據(jù)葡萄果實(shí)發(fā)育物候期，計(jì)算各個(gè)物候階段所經(jīng)歷的日數(shù)、有效積溫、日照時(shí)數(shù)、日平均溫度、日平均溫差和降雨量（表1）。由表1可知，2 個(gè)年份的生長(zhǎng)季降雨量差異顯著，其余氣象指標(biāo)無(wú)顯著差異。2016年的降雨量小于2017年，兩年的降雨量分別為538.7 mm和653.6 mm，在轉(zhuǎn)色期，2016年的降雨量是2017年的1.8 倍，而在成熟期，2017年的降雨量是2016年的2.13 倍。

表1 2016—2017年生長(zhǎng)季氣象數(shù)據(jù)Table 1 Meteorological indices during the growing seasons of ‘Petit Verdot’ grapes in two vintages (2016-2017)

2.2 砧木對(duì)‘小味多’葡萄果實(shí)理化指標(biāo)的影響

如表2所示，‘小味多’嫁接苗的漿果百粒質(zhì)量均高于自根苗；砧木‘101-14’、‘1103P’、‘Beta’嫁接的‘小味多’果實(shí)，其可溶性固形物含量高于自根苗，而砧木‘5BB’、‘SO4’嫁接的‘小味多’果實(shí)可溶性固形物含量低于自根苗；‘小味多’嫁接苗果實(shí)的pH值均略高于自根苗；PV/1103P組合葡萄果實(shí)的可滴定酸含量高于自根苗，而砧木‘101-14’、‘Beta’、‘5BB’、‘SO4’嫁接的‘小味多’果實(shí)的可滴定酸含量低于自根苗。雙因素方差分析結(jié)果表明，砧木對(duì)‘小味多’葡萄果實(shí)理化指標(biāo)無(wú)顯著影響，年份對(duì)果實(shí)百粒質(zhì)量、可溶性固形物、pH值有顯著影響。

2.3 砧木對(duì)‘小味多’果實(shí)游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的影響

由表3可知，2016年‘小味多’各砧穗組合和自根苗采收期葡萄果實(shí)中游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)相同，共檢測(cè)到52 種物質(zhì)。‘小味多’各砧穗組合葡萄果實(shí)中游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的含量與自根苗相比存在顯著差異。

與自根苗相比，‘101-14’、‘Beta’和‘SO4’嫁接顯著增加了葡萄果實(shí)游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的含量。其中砧木‘5BB’嫁接的‘小味多’果實(shí)中游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)濃度增加量最顯著，其次為PV/SO4組合。5 種砧穗組合中，C6/C9類(lèi)物質(zhì)增加量最顯著；相比而言，PV/SO4組合增加量最顯著，PV/101-14組合增加量顯著低于其他砧穗組合。PV/5BB組合酸類(lèi)物質(zhì)增加量最顯著，PV/Beta組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/5BB組合醇類(lèi)物質(zhì)增加量最顯著，PV/1103P組合增加量顯著低于其他砧穗組合。PV/5BB組合苯類(lèi)物質(zhì)增加量最顯著，PV/101-14組合增加量顯著低于其他砧穗組合。PV/5BB組合羰基化合物類(lèi)物質(zhì)增加量最顯著，PV/Beta組合增加量顯著低于其他砧穗組合。PV/5BB組合C13-降異戊二烯類(lèi)物質(zhì)增加量最顯著，PV/1103P組合增加量顯著低于其他砧穗組合。PV/5BB組合萜烯類(lèi)物質(zhì)增加量最顯著，PV/Beta組合增加量顯著低于其他砧穗組合。

2017年‘小味多’各砧穗組合和自根苗采收期葡萄果實(shí)中游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)相同，共檢測(cè)到51 種物質(zhì)，與2016年結(jié)果略有差別。‘小味多’各砧穗組合葡萄果實(shí)中游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的含量與自根苗相比存在顯著差異。

與自根苗相比，砧木‘101-14’、‘Beta’、‘1103P’和‘SO4’嫁接顯著增加了葡萄果實(shí)游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的含量。其中砧木‘101-14’嫁接的‘小味多’果實(shí)中游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)濃度增加量最顯著，其次為PV/SO4組合。5 種砧穗組合中PV/SO4組合C6/C9類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/101-14組合C6/C9類(lèi)物質(zhì)增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/101-14組合酸類(lèi)物質(zhì)增加量最顯著，PV/Beta組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/101-14組合醇類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/SO4組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/SO4組合苯類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/1103P組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/101-14組合羰基化合物類(lèi)物質(zhì)增加量最顯著，PV/Beta組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/101-14組合C13-降異戊二烯類(lèi)物質(zhì)增加量最顯著，PV/Beta組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/5BB組合萜烯類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/SO4組合增加量顯著低于其他砧穗組合。

砧木‘5BB’可以提高果實(shí)中游離態(tài)萜烯類(lèi)化合物和游離態(tài)C13-降異戊二烯類(lèi)化合物的含量，砧木‘SO4’可以提高果實(shí)中游離態(tài)C6/C9類(lèi)化合物的含量。砧木‘101-14’可以提高果實(shí)中游離態(tài)羰基化合物類(lèi)物質(zhì)的含量。砧木‘SO4’可以提高果實(shí)中游離態(tài)C13-降異戊二烯類(lèi)、游離態(tài)萜烯類(lèi)物質(zhì)的含量。對(duì)‘小味多’葡萄果實(shí)中的游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行雙因素方差分析，結(jié)果如表3所示。砧木對(duì)游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的含量有顯著影響，對(duì)萜烯類(lèi)、苯類(lèi)、C13-降異戊二烯類(lèi)、醇類(lèi)、C6/C9類(lèi)、羰基化合物類(lèi)、酸類(lèi)和總游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的含量均有極顯著影響。年份對(duì)萜烯類(lèi)、C13-降異戊二烯類(lèi)、苯類(lèi)、羰基化合物類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)、C6/C9類(lèi)化合物、酸類(lèi)和總游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的含量均有極顯著影響。且年份和砧木的交互作用對(duì)C13-降異戊二烯類(lèi)、羰基化合物類(lèi)、醇類(lèi)、C6/C9類(lèi)化合物、酸類(lèi)和總游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的含量有顯著影響。綜上，年份和砧木都對(duì)游離態(tài)揮發(fā)性化合物有較大影響。

2.4 砧木對(duì)‘小味多’果實(shí)結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的影響

2016年‘小味多’各砧穗組合和自根苗采收期葡萄果實(shí)中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的種類(lèi)相同，共檢測(cè)到53 種物質(zhì)。由表4可知，‘小味多’各砧穗組合葡萄果實(shí)中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量與自根苗相比存在顯著差異。

表4 采收期‘小味多’不同砧穗組合和自根苗葡萄果實(shí)結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)含量Table 4 Contents of bound volatile compounds in ‘Petit Verdot’ grape berries from self-rooted and grafted vines during harvest period

與自根苗相比，5 個(gè)砧穗組合均顯著增加了葡萄果實(shí)結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量。其中砧木‘5BB’嫁接的‘小味多’果實(shí)中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)增加最顯著，其次為PV/Beta組合。5 種砧穗組合中PV/5BB組合酸類(lèi)物質(zhì)含量增加最顯著，PV/101-14組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/5BB組合醇類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/101-14組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/5BB組合苯類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/101-14組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/5BB組合羰基化合物類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/101-14組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/5BB組合酯類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/1103P組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/5BB組合C13-降異戊二烯類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/101-14組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/5BB組合萜烯類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/101-14組合增加量顯著低于其他砧穗組合。

2017年‘小味多’各砧穗組合和自根苗采收期葡萄果實(shí)中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的種類(lèi)相同，共檢測(cè)到53 種物質(zhì)。‘小味多’各砧穗組合葡萄果實(shí)中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量與自根苗相比存在顯著差異。

與自根苗相比，5 個(gè)砧穗組合均顯著增加了葡萄果實(shí)結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量。其中砧木‘1103P’嫁接的‘小味多’果實(shí)中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)含量增加最顯著，其次為PV/5BB組合。5 種砧穗組合中PV/5BB組合酸類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/SO4組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/5BB組合醇類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/SO4組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/101-14組合苯類(lèi)物質(zhì)含量增加最顯著，PV/Beta組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/1103P組合羰基化合物類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/SO4組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/1103P組合酯類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/SO4組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/5BB組合C13-降異戊二烯類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/SO4組合增加量顯著低于其他砧穗組合；PV/1103P組合萜烯類(lèi)物質(zhì)增加最顯著，PV/SO4組合增加量顯著低于其他砧穗組合。

砧木‘5BB’可以提高果實(shí)中結(jié)合態(tài)C6/C9類(lèi)化合物、酯類(lèi)、羰基化合物類(lèi)、萜烯類(lèi)化合物和C13-降異戊二烯類(lèi)化合物的含量。砧木‘1103P’可以提高果實(shí)中結(jié)合態(tài)羰基化合物類(lèi)物質(zhì)的含量；砧木‘Beta’可以提高果實(shí)中結(jié)合態(tài)C13-降異戊二烯類(lèi)、結(jié)合態(tài)萜烯類(lèi)物質(zhì)的含量；砧木‘SO4’可以提高果實(shí)中結(jié)合態(tài)羰基化合物類(lèi)物質(zhì)的含量。對(duì)‘小味多’葡萄果實(shí)中的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)進(jìn)行雙因素方差分析，結(jié)果如表4所示。砧木對(duì)結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量有顯著影響，對(duì)萜烯類(lèi)、C13-降異戊二烯類(lèi)、醇類(lèi)、羰基化合物類(lèi)、酸類(lèi)和總結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量有極顯著影響。年份對(duì)結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量均有顯著影響，對(duì)萜烯類(lèi)、C13-降異戊二烯類(lèi)、醇類(lèi)、羰基化合物類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)和總結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量有極顯著影響。且年份和砧木的交互作用對(duì)C13-降異戊二烯類(lèi)、羰基化合物類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)和總結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量有顯著性影響。綜上，年份和砧木都對(duì)結(jié)合態(tài)香氣化合物有較大影響。

2.5 ‘小味多’砧穗組合差異揮發(fā)性化合物的篩選

為了進(jìn)一步明確不同砧穗組合之間的相似性和差異性，對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行PCA（圖1），前兩個(gè)PC解釋了總方差的95%，其中PC1為52.2%，PC2為41.1%，PC1可將2016年和2017年的樣品明顯區(qū)分開(kāi)，2016年各砧穗組合差異大，而2017年各砧穗組合差異相對(duì)較小。

圖1 采收期‘小味多’不同砧穗組合和自根苗葡萄香氣物質(zhì)的PCA圖Fig.1 PCA scatter and loading plots of volatile compounds in ‘Petit Verdot’ grape berries from self-rooted and grafted vines during harvest period

盡管PCA對(duì)年際間的差異有很好的區(qū)分度，但是仍無(wú)法將各個(gè)砧穗組合區(qū)分，其差異性化合物也不能明確。由此可見(jiàn)，年份顯著影響揮發(fā)性物質(zhì)含量。為了進(jìn)一步明確砧木對(duì)‘小味多’葡萄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的影響，消除年份的干擾，采用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）對(duì)6 組樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，OPLS-DA可以很好地將2 個(gè)年份的結(jié)果區(qū)分開(kāi)，并且不同砧穗組合與自根苗也能很好地區(qū)分。如表5所示，PV/1103P和PV/Beta與自根苗的差異化合物最多，PV/101-14組合與自根苗差異物質(zhì)最少。整體來(lái)看，(E)-2-己烯醛、(Z)-2-己烯醛、己醛等C6/C9類(lèi)化合物是區(qū)分嫁接苗和自根苗的共性差異化合物。

圖2 不同砧穗組合‘小味多’葡萄揮發(fā)性物質(zhì)的OPLS-DA分布圖Fig.2 OPLS-DA distribution of volatile compounds in the grape berries of ‘Petit Verdot’ vines from different scion-rootstock combinations

表5 ‘小味多’中通過(guò)OPLS-DA模型識(shí)別的主要差異化合物Table 5 Primary biomarker compounds identified by the OPLS-DA model in ‘Petit Verdot’ grape berries

3 討論

‘小味多’葡萄果實(shí)中的揮發(fā)性物質(zhì)包括酸類(lèi)、酯類(lèi)、C6/C9類(lèi)、羰基化合物、C13-降異戊二烯類(lèi)、萜烯類(lèi)以及呋喃類(lèi)。本實(shí)驗(yàn)中游離態(tài)C6/C9類(lèi)是‘小味多’葡萄果實(shí)中的主要揮發(fā)性物質(zhì)，C6/C9類(lèi)的醛、醇和酯來(lái)源于酶促脂質(zhì)氧化路徑，可賦予葡萄和葡萄酒典型的草本植物味和青草味，也被稱(chēng)為綠葉氣味物質(zhì)，對(duì)葡萄酒的感官有重要作用[25]。有研究指出，砧木等因素均會(huì)影響葡萄果實(shí)中的揮發(fā)性物質(zhì)積累[26]。

本研究中，2017年酸類(lèi)、醇類(lèi)、C6/C9類(lèi)物質(zhì)顯著高于2016年；2016年C13-降異戊二烯類(lèi)、酯類(lèi)物質(zhì)顯著高于2017年，其他物質(zhì)無(wú)顯著差異。結(jié)合氣象數(shù)據(jù)，2017年總降水量比2016年高114.9 mm，特別是2017年成熟期降水量較大。從開(kāi)花到采收的其他氣象指標(biāo)，包括日照時(shí)數(shù)、日平均氣溫和晝夜溫差等，2017年略高于2016年。有研究表明，一定程度的高溫有利于揮發(fā)性物質(zhì)的積累[27]，而過(guò)度的水分虧缺會(huì)影響葡萄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的積累，從而影響揮發(fā)性物質(zhì)的含量[28]。C6/C9類(lèi)物質(zhì)是葡萄和葡萄酒“綠葉味”的主要來(lái)源[29]，有研究表明，高溫會(huì)導(dǎo)致葡萄果實(shí)中“綠葉味”增加[30]，一定程度減少土壤含水量能夠增加C13-降異戊二烯類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)的含量[31]。

砧木可以改變‘小味多’葡萄果實(shí)某些揮發(fā)性化合物的含量，但一般不會(huì)改變其揮發(fā)性物質(zhì)的組成。本研究表明，5 種砧木均顯著增加‘小味多’采收期葡萄果實(shí)中游離態(tài)C6/C9類(lèi)物質(zhì)的含量。不同砧木對(duì)游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的含量影響不同，與自根苗相比，PV/5BB、PV/SO4組合顯著增加果實(shí)游離態(tài)C13-降異戊二烯類(lèi)、呋喃類(lèi)、萜烯類(lèi)物質(zhì)的含量，PV/1103P組合、PV/Beta組合顯著增加果實(shí)游離態(tài)呋喃類(lèi)物質(zhì)的含量，PV/101-14組合顯著增加果實(shí)游離態(tài)羰基化合物類(lèi)物質(zhì)的含量。

與自根苗相比，PV/5BB、PV/Beta組合顯著增加果實(shí)結(jié)合態(tài)C13-降異戊二烯類(lèi)、呋喃類(lèi)、萜烯類(lèi)物質(zhì)的含量，PV/1103P組合顯著增加‘小味多’采收期葡萄果實(shí)結(jié)合態(tài)羰基化合物類(lèi)、醇類(lèi)物質(zhì)的含量，PV/101-14組合顯著降低果實(shí)結(jié)合態(tài)C13-降異戊二烯類(lèi)物質(zhì)的含量，PV/SO4組合顯著增加果實(shí)結(jié)合態(tài)C13-降異戊二烯類(lèi)、羰基化合物類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)的含量。孫磊等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，‘1103P’、‘110R’和‘SO4’可顯著增加‘瑞都香玉’的游離態(tài)揮發(fā)性化合物總量，‘5BB’則對(duì)‘瑞都香玉’各類(lèi)游離態(tài)揮發(fā)性化合物的含量表現(xiàn)出顯著的抑制作用，‘1103P’、‘110R’和‘SO4’3 種砧木均能顯著提高葡萄的玫瑰香味。本實(shí)驗(yàn)中供試砧木均顯著增加各類(lèi)游離揮發(fā)性化合物積累，這可能與氣候差異有關(guān)。李善菊等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，砧木‘貝達(dá)’可顯著提高‘陽(yáng)光玫瑰’中的醇類(lèi)物質(zhì)和酯類(lèi)物質(zhì)含量，砧木‘5BB’可提高‘陽(yáng)光玫瑰’中醛類(lèi)物質(zhì)的含量。本研究中，與自根苗相比，PV/5BB組合顯著增加果實(shí)C13-降異戊二烯類(lèi)、呋喃類(lèi)、萜烯類(lèi)物質(zhì)的含量，這可能與氣候間差異造成的年份影響有關(guān)。同樣有研究發(fā)現(xiàn)，不同年份間葡萄果實(shí)中揮發(fā)性物質(zhì)的組成與比例具有顯著不同[34]。鄭秋玲等[35]研究發(fā)現(xiàn)，砧木‘5BB’和‘Beta’對(duì)‘赤霞珠’葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)有促進(jìn)作用，可以作為‘赤霞珠’適宜的砧木。劉萬(wàn)好等[36]在研究不同砧木對(duì)‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的影響中發(fā)現(xiàn)，砧木‘SO4’嫁接的‘陽(yáng)光玫瑰’揮發(fā)性物質(zhì)總含量最高，砧木‘Beta’嫁接的‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄果實(shí)中萜類(lèi)物質(zhì)最高。本實(shí)驗(yàn)中砧木‘5BB’嫁接的‘小味多’揮發(fā)性物質(zhì)總含量和萜類(lèi)物質(zhì)含量均最高，這可能與砧穗之間的互作有關(guān)。

OPLS-DA對(duì)6 組砧穗組合自根苗之間進(jìn)行差異分析結(jié)果中，揮發(fā)性物質(zhì)中(E)-2-己烯醛、(Z)-2-己烯醛、己醛等C6/C9化合物均是區(qū)分嫁接苗和自根苗的共性差異化合物。相關(guān)研究[19,37]也發(fā)現(xiàn)，C6/C9類(lèi)化合物可以作為嫁接苗和自根苗的差異化合物。孫磊等[32]用5 種砧木嫁接‘瑞都香玉’葡萄發(fā)現(xiàn)，與自根苗相比，2-己烯醛、里那醇、己醛、萜品油烯和β-月桂烯是‘瑞都香玉’/1103P組合的特征化合物。在本研究中也發(fā)現(xiàn)己醛是PV/1103P與自根苗中的差異化合物。可見(jiàn)，盡管接穗品種不同，但相同砧木對(duì)接穗揮發(fā)性物質(zhì)的影響仍然存在一定的共性。

4 結(jié)論

嫁接砧木品種的差異會(huì)對(duì)‘小味多’成熟期葡萄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的積累起到重要影響，但年份間氣候差異對(duì)其造成的影響往往會(huì)超過(guò)砧木品種的影響。(E)-2-己烯醛、(Z)-2-己烯醛、己醛等C6/C9類(lèi)化合物是區(qū)分嫁接苗和自根苗的共性差異揮發(fā)性化合物。總體而言，在北京地區(qū)使用砧木‘5BB’嫁接有利于‘小味多’葡萄采收期果實(shí)萜烯類(lèi)和C13-降異戊二烯類(lèi)物質(zhì)的積累，對(duì)葡萄果實(shí)的釀酒品質(zhì)有正面影響。