泡椒鳳爪溶爛腐敗菌的鑒定及其致腐能力分析

尹含靚，劉 洋,2,*，譚益升，孫軍華,，蔣立文,2,*，杜 秋

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.鹽津鋪子食品股份有限公司，湖南 長沙 410000）

泡椒鳳爪是川渝特色風味小吃，是將濕態發酵工藝與肉制品加工技術結合的產品[1]。鳳爪是雞肉加工的副產品[2]，經過解凍、切分、漂洗、煮制、鹵水泡制、調味、真空包裝和輻照殺菌后制得泡椒鳳爪，其口感酸鮮爽脆，含有豐富的蛋白質，脂肪含量低，是一種深受消費者喜歡的休閑制品。但由于泡椒鳳爪營養豐富，有利于微生物生長繁殖，使其在貯藏及銷售過程中容易出現溶爛、脹包等品質劣變的現象[3]。

為保持泡椒鳳爪的脆度，產品不能高溫或巴氏殺菌處理，以免膠原蛋白析出影響產品脆度和外觀。傳統泡椒鳳爪加工中通常使用過氧化氫對原料進行預處理殺菌，但自2015年國家規定不能使用過氧化氫作為加工助劑（食藥監辦食監一函〔2015〕609號）后，輻照殺菌和添加復合防腐保鮮劑便成為了泡椒鳳爪保質的主要方法[4-5]。然而，由于輻照劑量的限制和不同防腐劑的抑菌范圍有限，導致部分腐敗微生物依然可以存活，使泡椒鳳爪產品出現溶爛及漲袋等腐敗現象。楊琴[6]發現導致泡椒鳳爪漲袋的主要產氣微生物為解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和產朊假絲酵母（Candida utilis）。馬含笑[7]從發軟的泡椒鳳爪中分離得到1 株小鱒魚大洋芽孢桿菌（Oceanobacillus oncorhynchi）。國內外已有許多研究對肉制品中特定腐敗菌的致腐能力進行探究，Liu Xiaochang等[8]通過測定腐敗菌作用于鳙魚產生的腐敗代謝產物，研究了腐敗希瓦氏菌、溫和氣單胞菌、波西米亞不動桿菌和薩拉曼卡假單胞菌的致腐能力。王筱夢等[9]通過腐敗代謝產物產量因子發現Bacillussp.M1對熟制羊肉的致腐能力最強。然而泡椒鳳爪中特定腐敗菌致腐能力的相關研究還鮮見報道。

本研究通過高通量測序及傳統培養法對溶爛泡椒鳳爪中的微生物進行菌相分析及分離鑒定，將優勢腐敗菌接種于泡椒鳳爪中判斷其致腐能力，旨在為后期防控泡椒鳳爪的腐敗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡椒鳳爪樣品來自湖南某食品公司，為不同生產批次的溶爛樣品（YC0411、YC0507、YC0610、YC0623、YC0729、YC0811、YC0917、YC0921）及新鮮（ZC0921）樣品，所有樣品均按生產時間編號。

硫代巴比妥酸、三氯乙酸、無水乙醇、氯化鈉、硼酸、氧化鎂、鹽酸（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉 天津市化學試劑研究所有限公司；1,1,3,3-四乙氧基丙烷 上海麥克林生化科技有限公司；平板計數肉湯（plate count broth，PCB）青島海博生物技術有限公司；平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）廣東環凱微生物科技有限公司；核酸定量分析試劑盒（Qubit dsDNA HS Assay Kit）美國英杰生命技術有限公司；AxyPre聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒 美國愛思進公司；RStool DNA試劑盒 美國Omega公司。

1.2 儀器與設備

ReadMax 1900全波長掃描酶標儀 上海閃譜生物科技公司；K9840型自動凱式定氮儀 海能未來技術集團股份有限公司；LDZX-50 KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；S W-C J-1 F D 型無菌操作臺蘇州凈化設備有限公司；SPX-250BIII型恒溫培養箱天津泰斯特儀器有限公司；Centrifuge 5424型常溫離心機德國Eppendorf公司；Microfuge R 22R Centrifuge冷凍離心機 上海鵬儀電子科技有限公司；A200型PCR儀 杭州朗基科學儀器有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司；Tanon EPS300型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀 上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1 高通量測序

DNA提?。翰捎肊.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒提取泡椒鳳爪樣品中細菌總DNA。并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。

PCR 擴增：利用16 SrDNA V3～V4 區引物341F～805R進行擴增。PCR擴增體系總體積為25 μL，其中包含25 ng模板DNA，2×Taqmaster Mix 12.5 μL，上下游引物各2.5 μL，ddH2O補齊至25 μL。PCR擴增條件為：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32 個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產物10 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將檢測合格樣品送至杭州聯川生物技術有限公司進行高通量測序。

數據處理：對下機數據首先根據樣品的條形碼（barcode）信息對數據進行拆分，再根據雙端序列的重疊（overlap）關系，將序列拼接成長的tags，并將序列上建庫引入的barcode和引物序列去除。使用Vsearch（V2.3.4）軟件過濾掉質量值低的序列以及嵌合體序列[10]，再將具有97%以上相似性的序列分配給相同的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。每個OTU選擇代表性序列，然后使用核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）分類器將數據歸類到每個代表性序列[11]。利用MAFFT（V7.310）軟件對不同類群優勢種群的差異進行多序列比對，研究不同OTU間的系統發育關系。以Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數和Observed OTUs為指標，用QIIME（1.8.0版）計算所有樣品的各項指標并進行聚類，再通過α及β多樣性分析單個樣本中物種的多樣性以及樣本間菌群結構之間的差異[12-13]，根據每個OTU代表序列與RDP數據庫和Unite數據庫的比對，得到各個樣本所有OTU的物種注釋，對OTU進行物種分類統計后獲得門水平和屬水平上的物種豐度。

1.3.2 優勢腐敗菌分離鑒定

取泡椒鳳爪樣品25 g于225 mL生理鹽水中，充分振蕩搖勻，并進行梯度稀釋。取合適稀釋梯度的菌懸液100 μL涂布至PCA培養基上，放置于37 ℃培養箱中培養24～48 h，挑選平板中的不同形態典型菌落，在平板上劃線2～3 次，直至得到純化的單個菌落。挑取單菌落，進行革蘭氏染色鏡檢觀察。并對菌種進行DNA提取，使用細菌通用引物（27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行擴增測序，將所得序列在NCBI上進行序列比對。

1.3.3 優勢腐敗菌酶活性測定

按1%的接種量將種子液接種到液體培養基中，37 ℃、140 r/min培養48 h后，4 ℃、8000 r/min離心10 min后取上清液，即為粗酶液。

蛋白酶活性：參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林-酚法進行測定。

脂肪酶活性：參照GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》進行測定。

1.3.4 優勢腐敗菌致腐能力測定

1.3.4.1 菌懸液制備與接種

供試腐敗菌菌株接種于PCB培養基中37 ℃培養12 h，用無菌生理鹽水將其濃度調至107CFU/mL。

將泡椒鳳爪樣品分為6 組。4 個處理組：分別吸取0.5 mL腐敗菌菌液，接種至裝有10 g無菌樣品的真空塑封袋中，真空包裝，放置于37 ℃恒溫培養箱中貯藏；對照組1：吸取0.5 mL無菌水，接種至裝有10 g無菌樣品的真空塑封袋中，真空包裝，放置于37 ℃ 恒溫培養箱中貯藏；對照組2：吸取0.5 mL無菌水，接種至裝有10 g無菌樣品的真空塑封袋中，真空包裝，放置于-20 ℃冰箱中貯藏。在貯藏1 個月時，處理組樣品均出現溶爛腐敗現象，對其進行理化指標測定。

1.3.4.2 pH值測定

使用pH計（Testo 205）插入泡椒鳳爪中測定其pH值。

1.3.4.3 揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值測定

參照GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》進行測定。

1.3.4.4 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值測定

參照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》進行測定。

1.4 數據處理與分析

理化指標數據為3 次平行實驗的平均值，細菌群落數據分析均有4 個生物學重復，以表示。通過SPSS 26.0進行單因素方差分析（ANOVA）后進行Duncan多重比較，P＜0.05時均值差異顯著。采用Origin 2021和Excel繪制數據圖。使用MEGA-X軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 高通量測序法分析優勢腐敗菌

2.1.1α多樣性分析

α多樣性通常用來表示樣品微生物群落組成的豐富度和多樣性[14]。Observed OTUs和Chao1指數用來反映物種豐富度，而Simpson指數和Shannon指數主要反映物種多樣性[15]。由表1可知，所有樣品的覆蓋率均達到0.99以上，說明本次測序的結果能代表樣品中細菌群落組成的真實情況。新鮮樣品（ZC0921）的Observed OTUs和Chao1指數比大部分異常樣品高，說明溶爛樣品中的細菌群落種類相較正常樣品下降。同時，異常樣品中的Simpson指數和Shannon指數較低，可能是優勢腐敗菌抑制了其他微生物的增殖。江楊陽等[16]在小龍蝦腐敗實驗中發現，貯藏時間延長，微生物種類降低，與本研究結果相似。

表1 泡椒鳳爪樣品細菌α多樣性比較Table 1 Comparison of bacterial α diversity of chicken feet with pickled peppers

2.1.2 細菌群落組成分析

如圖1a 所示，溶爛泡椒鳳爪樣品（YC0411、YC0507、YC0610、YC0623、YC0729、YC0811、YC0917、YC0921）中的優勢腐敗菌門為厚壁菌門（Firmicutes），而正常樣品（ZC0921）中的優勢菌門為藍藻菌門（Cyanobacteria）。YC0921中的厚壁菌門相對豐度在所有異常樣品中最低（50.08%），其次為YC0917（85.10%），而2020年8月11日前的樣品（YC0411～YC0811）厚壁菌門相對豐度均大于95%，說明隨著貯藏時間延長，優勢腐敗菌門逐漸占據主導地位。

圖1 泡椒鳳爪樣品細菌在門（a）及屬水平（b）群落組成Fig.1 Bacterial community composition at the phylum (a) and genus (b)levels in chicken feet with pickled peppers

泡椒鳳爪樣品中細菌群落在屬水平上的組成情況如圖1b 所示。正常樣品ZC 0921 中的優勢菌屬為Oxyphotobacteria_unclassified（71.27%），Oxyphotobacteria屬于藍藻菌門（Cyanobacteria），其廣泛分布于湖泊、土壤等生態環境中[17]，因此Oxyphotobacteria_unclassified可能來源于環境中。而異常樣品中的優勢菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus），YC0921中不動桿菌屬（Acinetobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）等也具有較高的相對豐度。隨著貯藏時間延長（生產時間越早），芽孢桿菌屬的相對豐度增加（從34.68%增加至99.90%），而其他細菌屬的相對豐度均下降，說明芽孢桿菌屬為導致樣品溶爛的主要腐敗微生物，其抑制了其他微生物生長，使樣品中的微生物種類呈降低趨勢[16]。芽孢桿菌屬被確定為多種肉制品中的腐敗菌，如鮑魚[18-19]和鹽水鵝[20]。泡椒鳳爪產生溶爛現象可能是由于芽孢桿菌具有產蛋白酶和脂肪酶活性[21]，導致泡椒鳳爪中蛋白質和脂肪降解。

2.2 優勢腐敗菌的分離鑒定

根據高通量測序結果，對溶爛泡椒鳳爪樣品的潛在腐敗菌進行分離純化，共得到4 株典型菌株，其菌落形態及菌體形態如圖2所示。菌株623-4表面隆起，質地黏稠；菌株811-2表面扁平有褶皺；菌株917-1表面干燥凸起，有褶皺，邊緣不規則；菌株921-4表面光滑，呈放射狀。4 株菌株革蘭氏染色均為陽性，呈桿狀，有芽孢。

圖2 分離菌株的菌落形態及其菌體形態（×100）Fig.2 Colony morphology and cell morphology of the isolated strains (× 100)

根據16S rDNA建立系統發育樹（表2），可知菌株623-4為甲基營養型芽孢桿菌（B.methylotrophicusL01），相似度達98%；菌株811-2為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensisstrain 2586）,相似度達96%；菌株917-1為枯草芽孢桿菌（B.subtilisisolate BS-1），相似度達100%；菌株921-4為沙福芽孢桿菌（B.safensisstrain HNS004），相似度達98%。

表2 分離菌株的16S rDNA鑒定結果Table 2 Results of 16S rDNA identification of the isolates

2.3 優勢腐敗菌的酶活特性

對優勢腐敗菌株進行蛋白酶及脂肪酶活測定。結果顯示，所有菌株均具有一定的蛋白酶及脂肪酶活性（圖3）。菌株921-4蛋白酶活性最強（51.19 U/mL），其次為623-4（28.81 U/mL）、917-1（7.36 U/mL）和811-2（5.20 U/mL）。而脂肪酶活性最強的菌株為623-4（3.75 U/mL），其次為811-2（2.92 U/mL），921-4（2.83 U/mL）和917-1（2.08 U/mL）。研究表明，芽孢桿菌通常具有較高的產蛋白酶能力[22]。曹紅等[23]從魷魚中篩選出1 株蛋白酶活性高達（257.67±2.44）U/mL的甲基營養型芽孢桿菌。沙福芽孢桿菌在優化的發酵培養基中蛋白酶活可達69.26 U/mL[24]。此外，芽孢桿菌也是重要的產脂肪酶菌株[25]，徐偉芳等[26]從土壤中篩選出的甲基營養型芽孢桿菌在最適條件下脂肪酶活性達21.22 U/mL。本研究分離得到的4 株菌可能對泡椒鳳爪中的蛋白質和脂肪均具有一定的降解作用。因此，將分離菌株接種于泡椒鳳爪中，進一步驗證其對泡椒鳳爪的致腐能力。

圖3 不同菌株的蛋白酶及脂肪酶活性比較Fig.3 Comparison of protease and lipase activity of the isolates

2.4 優勢腐敗菌對泡椒鳳爪的致腐性驗證

通常，微生物代謝會產酸或產堿性物質，因此pH值是評價食品品質的一個重要指標[27]。由表3可知，接種不同腐敗菌株的泡椒鳳爪樣品組pH值均高于C組（37 ℃貯藏空白對照），說明4 株菌均具有一定的致腐能力，其分泌的酶類物質可以降解泡椒鳳爪中的蛋白質產生氨基酸、胺類等堿性物質[28-29]。

表3 接種不同腐敗菌的泡椒鳳爪理化指標Table 3 Physicochemical properties of chicken feet with pickled peppers inoculated with each of the spoilage bacteria

TVB-N值升高主要是由于微生物和內源酶作用于蛋白質產生氨、胺類等揮發性含氮物質[27]。4 個處理組的TVB-N值均高于同樣貯藏溫度下的對照C組（表3），表明4 株芽孢桿菌均對泡椒鳳爪具有一定的致腐能力。鄭瑞生等[18]研究發現蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）可以分解鮑魚中的蛋白質而導致貯藏18 d TVB-N值達到362.32 mg/100 g。接種623-4菌株的泡椒鳳爪TVB-N值最高（25.10 mg/100 g），接種811-2菌株的樣品TVB-N值最低（12.08 mg/100 g）。盡管921-4菌株產蛋白酶能力最強，但接種921-4菌株的樣品TVB-N值并不高（18.57 mg/100 g），這可能是由于921-4菌株在鳳爪中生長能力較弱導致的。張若煜[30]和Wang Guangyu[31]等研究亦發現具有較強蛋白酶活性的假單胞菌在肉中生長能力較低，使TVB-N值較低，與本研究結果相似。此外，C組（6.50 mg/100 g）的TVB-N值比N組（-20 ℃貯藏空白對照）（3.13 mg/100 g）高，可能是泡椒鳳爪中的內源酶降解蛋白質導致，說明低溫可以抑制蛋白質的降解。

油脂中的多不飽和脂肪酸氧化分解會產生醛、酮等物質，其衍生物丙二醛（malondialdehyde，MDA）通常被用來表示脂質氧化程度[32]。TBARS值越大，說明MDA含量越高，脂質氧化程度也越高[33]。由表3可知，811-2組（0.83 mg/kg）和623-4組（0.82 mg/kg）的TBARS 值最高，而917-1 組（0.41 mg/kg）的TBARS 值比C 組（0.45 mg/kg）略低，表明菌株917-1對泡椒鳳爪脂質氧化的影響較小，與體外脂肪酶活性實驗（圖3）結果一致。有研究表明，肉制品的品質在TBARS值大于0.6 mg/kg時會發生變化[34]，產生不愉悅的氧化風味[35]，因此菌株623-4、811-2和921-4對泡椒鳳爪的品質均有一定的影響，可能導致產品脂肪降解并產生異味。C組（0.45 mg/kg）的TBARS值比N組（0.33 mg/kg）高，這可能是由于低溫抑制了脂肪氧化[36]。

3 結論

本研究通過高通量測序技術與傳統培養法對溶爛泡椒鳳爪樣品進行菌相分析及腐敗菌分離，發現溶爛泡椒鳳爪中的優勢菌屬為芽孢桿菌屬，優勢菌株為甲基營養型芽孢桿菌623-4、貝萊斯芽孢桿菌811-2、枯草芽孢桿菌917-1、沙福芽孢桿菌921-4。菌株921-4蛋白酶活性最強（51.19 U/mL），而菌株623-4脂肪酶活性最強（3.75 U/mL）。此外，將4 株菌分別接種于泡椒鳳爪中，測定樣品的pH值、TVB-N值和TBARS值判斷其致腐能力。結果表明，分離得到的4 株菌均具有一定的致腐能力，其中菌株811-2對泡椒鳳爪的pH值（5.48）和TBARS值（0.83 mg/kg）影響最大，菌株623-4對泡椒鳳爪TVB-N值（25.10 mg/kg）影響最大。