氣質聯用法測定苯胺靈殘留量實驗教學

張璐薇， 李珂嘉， 王鴻偉， 趙 宏， 彭錦峰

（西安交通大學儀器科學與技術學院，西安 710049）

0 引言

“食品化學”是食品科學與工程專業最主要的專業基礎課和相關學科的骨干課程之一［1］。就我校開設的食品測控技術與儀器專業方向而言，食品化學課程為多學科交叉中——食品工程專業模塊的核心課程。該課程主要從化學和分子水平角度講述與食品有關的化學知識，包括食品中的營養素、添加劑、風味成分、有害物質等相關知識，是一門理論聯系實際較強的課程［2］。隨著我國在2016 年正式加入國際工程聯盟的“華盛頓協議”，國內工科高校的本科教學更加重視創新能力和工程實踐能力的培養，而實驗教學是培養學生創新意識和實踐能力的重要環節［3］。根據本專業方向培養學生的要求和目標，將食品化學和現代儀器分析兩門專業課程進行緊密結合，特開設了蔬菜中農藥苯胺靈殘留量的測定——氣相色譜-串聯質譜法實驗。

農藥是農業生產中必不可少的生產資料，在生物災害防治和糧食增產中發揮著重要作用［4］。農藥的濫用和過量使用會造成環境污染與農藥殘留超標，進而對人類產生急性或慢性的毒害作用［5］。苯胺靈（N-苯氨基甲酸異丙酯）是一種土壤除草劑，主要用于大豆、甜菜、棉花、蔬菜、煙草地中防、除一年生禾本科雜草。作為苯胺類的除草劑，它的毒性比較大，若進入人體，易通過血腦屏障而與含大量類脂質的神經系統發生作用，從而損害神經系統［6］。開展農產品中的農藥殘留分析及相應的監管是保障消費者食品安全的重要手段，受到各國政府及公眾的廣泛關注［7］。因此，采用氣相色譜-串聯質譜法對農藥苯胺靈進行殘留量的測定，為評估帶有苯胺靈的膳食攝入風險提供科學依據。實驗過程包括樣品制備、提取、凈化、濃縮、上機測定及數據處理等復雜流程，耗時長，步驟繁瑣。如何讓學生在實驗過程中做到心中有數、有條不紊是實驗教學過程中需要關注的重點問題，既使學生掌握了分析儀器的原理及實驗操作規范，又加強對食品安全法規的理解及運用。基于此，本文建立了詳細的標準操作規程，對關鍵步驟進行了總結歸納，提出了“4-3-2-1”的樣品前處理流程，從試劑耗材清單準備到樣品前處理、上機分析測定及實驗數據處理，進行了全方位的規定，在實際操作過程中，重點講授學生應特別注意的關鍵步驟，結合最終實驗結果，分析關鍵步驟對實驗結果的影響，從而使學生養成“粗細結合，關注核心”的食品測控技術實驗習慣。

1 實驗內容與步驟

1.1 實驗主要內容

為建立氣相色譜-質譜聯用法測定蔬菜中苯胺靈（除草劑）殘留量的分析方法，采用Rtx-5 色譜柱（30 m×0.25 mm ×0.25 μm）進行分離，質譜以選擇離子掃描模式進行檢測，同位素外標法定量，對100 mg／L的標準品進行加標回收實驗。在優化的條件下，苯胺靈在0.5 ～10 mg／mL范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.9997。樣品加標平均回收率為75% ～110%。本實驗的開設不但可簡便、快速、準確對蔬菜中苯胺靈殘留量進行測定，也可使學生掌握樣品前處理過程與氣相色譜質譜聯用技術及方法，加深對這一新型分析儀器與檢測原理的認知。

1.2 樣品前處理規程

樣品前處理需按“4-3-2-1”流程進行，即4 份樣品制備（2 份平行樣+2 份加標樣）、3 次提取、2 次氮吹濃縮、1 次凈化。這些環節相對獨立又相輔相成，每個環節都很重要，如果其中某個步驟出現失誤，則會影響整個實驗的準確性，造成實驗加標回收率過高或過低，從而無法驗證實驗方法的可靠性。學生雖然有生命科學導論、無機與分析化學、有機化學等基礎實驗操作經驗，但第一次接觸專業實驗，存在實驗試劑、儀器較陌生，基礎操作薄弱等問題，實驗中又涉及農藥、揮發性有機溶劑等，相較之前的基礎科學類實驗，本實驗更復雜、操作步驟繁瑣、注意事項較多且具有一定危險性，加上操作不熟悉，很容易在實驗過程中出現人為因素導致的數據不準確，從而對實驗結果有影響。為了培養學生具備扎實的食品質量與安全理論基礎，降低失誤率，保證實驗教學質量，促進實操素質提升，需要對實驗進行合理統籌規劃，嚴格按照實驗規范——標準操作規程（Standard Operating Procedures，SOP）進行，易出錯環節進行重點講解與提醒，使學生主觀上更細心，有條不紊地合理構思，有利于培養嚴謹認真的科學實驗態度，為培養高素質的應用型人才奠定必要的實驗操作基礎，從而實現培養具有國際視野的食品安全領軍人才及卓越工程師這一目標。

1.3 實驗材料與儀器

（1）原材料。新鮮青菜（市售）。

（2）試劑。苯胺靈、乙酸乙酯、正己烷、ProELut CARB石墨化碳黑小柱、氯化鈉等。

（3）實驗儀器與設備。氣相色譜儀（聚光科技GC-2000）、質譜儀（聚光科技MS-6100）、離心機（湘儀H1850R）、超聲波提取機（KQ-500 VDE 型）、固相萃取儀（AG-SPE-12D）、氮吹濃縮儀（MD 200）、渦旋混勻儀（SCILOGEX MX-S）等。

1.4 實驗操作步驟

實驗檢測流程如圖1 所示。

圖1 實驗檢測流程圖

（1）配制標準樣品。稱取適量苯胺靈標準品，用乙酸乙酯定容至10 mL，得到1000 mg／L 的苯胺靈標準儲備液，用乙酸乙酯稀釋至質量濃度為100 mg／L標準工作液，再空白基質溶液逐級稀釋至10、5、1、0.5、0 mg／L，制得標準品STD（standard的縮寫），并分別標注STD 100、STD 10、STD 5、STD 1、STD 0.5 及STD 0，待測。以苯胺靈質量濃度為橫坐標，對應的質譜峰面積為縱坐標，繪制基質標準曲線［8］。標準液配制過程中，注意移液器的使用方法及注意事項，在添加溶液后需及時更換槍頭以及渦旋混勻。該環節使用移液槍嚴格按規定添加，即實驗要求中的“細”即細心、仔細。

（2）樣品前處理。將市售青菜制樣加工成漿狀，制備成試樣甲、試樣乙（留樣、冰箱冷藏）。試樣甲放入離心管中，加入NaCl進行鹽析。由于僅對試樣中的有機相進行萃取提取，在稱樣時，允許一定誤差，即“粗”環節，達到有的放矢。

（3）樣品中農藥殘留的提取。包含添加提取液、渦旋、超聲、離心、提取有機相等步驟，該過程較復雜且重復3 次，對操作要求較高，需耐心、謹慎在通風櫥內進行，最后對提取液進行加溫氮吹濃縮。

（4）樣品凈化。需使用固相萃取儀及真空泵，利用固相萃取小柱對目標分析物進行分離、純化后，進行二次氮吹將濃縮液轉移至GC-MS 進樣瓶（GC-MS 氣相色譜質譜聯用儀），編輯進樣程序并選擇分析方法進行上樣測定。

（5）上樣測定，數據處理。氣相色譜儀將復雜混合物試樣各組分分離后，依次流入氣相色譜儀，并順序進入質譜系統，經質譜分析檢測后，計算機控制系統進行數據采集、處理、傳遞并存儲［9］。儀器分析結束后，生成質譜圖，借助美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）標準庫匹配檢索得到目標物的保留特征及特征碎片離子。

2 實驗過程及保障措施

2.1 實驗教師課前準備

GC-MS是一種結合氣相色譜和質譜的特性，用于復雜和痕量樣品的檢測，其主要應用于工業檢測、食品安全、環境保護等眾多領域，如農藥殘留、食品添加劑等。氣相色譜-質譜技術可以準確有效地完成復雜樣品的定性與定量分析，在檢測過程中依托進樣系統、質量分析器、檢測器等組件的應用，強化對目標物的檢測效果，排除相關因素的干擾，提升檢測工作的有效性［10］。農藥在樣品中的殘留是痕量水平，待測樣品的成分復雜，如何去除背景值的干擾、保證目標化合物的響應以及保護分析儀器是農藥殘留分析的核心問題［11］。實驗教師需要根據目標分析物，參照國家標準及實驗條件，建立氣相色譜-串聯質譜測定農藥中苯胺靈殘留量的分析方法并對實驗結果進行分析，對方法可靠性進行驗證。

2.1.1 實驗儀器的調試、預實驗

由于氣相色譜質譜聯用儀屬于大型精密儀器，每次開課前，實驗教師需要進行預實驗，建立檢測方法，熟悉操作，調試設備及實驗結果驗證等工作。此外還需制作原理簡單明了、知識點清晰、注意事項明確的PowerPoint（PPT）課件以及參照國家標準《GB 23200.61-2016 食品安全國家標準食品中苯胺靈殘留量的測定氣相色譜-質譜法》，編寫實驗步驟明確的標準操作規程（SOP）以保障學生實驗順利進行。

2.1.2 實驗耗材準備及化學品的配制

購買市售新鮮蔬菜（青菜）；提供給學生足夠的實驗耗材如一次性吸管、固相萃取小柱（Solid Phase Extraction，SPE）、2 mL GC-MS進樣瓶等。所用不同種類試管需要提前超聲洗滌，超純水沖洗后，烘箱烘干，置于試管架上，應準備1.5 倍的試管數量備用。除此之外，實驗需要的試劑量較大，包括苯胺靈標準品、乙酸乙酯、乙酸乙酯-正己烷（1 +1，V／V）等，實驗指導教師需提前配制備用。

2.2 按小組進行實驗

為保證教學效果及規范操作，實驗分組進行，每組為5 人，給予每組人員足夠的實驗空間，實驗教師1∶1組進行指導確保實驗質量，同時也提高了實驗的安全性。此外，實驗中樣品制備（平行樣與加標樣）及標準品配制同時進行，需要同學們相互配合；超聲、離心配平也需互相提醒注意事項；2 次氮吹濃縮因時間較長，輪流操作，從而共同協作完成實驗，發揮團隊合作精神。

2.3 教師示范關鍵實驗步驟

扎實的實驗基本技能是保證學生安全完成實驗的條件，也是學生在以后工作中實現新突破的基礎［12］。實驗開始前，進行系統安全培訓教育，特別強調規范操作及噴淋、洗眼裝置、消防器材及逃生通道具體位置，以確保實驗過程中人身安全。

有機相提取和目標分析物富集是整個實驗的重點部分，也是難點，對學生操作技術要求較高，實驗也有一定的危險性，這就要求實驗指導教師要熟悉操作，并就實驗過程中可能出現的問題提前叮囑學生，關鍵步驟要親自示范，避免不必要事故的發生［13］。

離心機初次使用，由指導教師示范配平、對位擺放、離心轉子及程序選擇原則；對固相萃取小柱預淋洗活化過程、固相萃取儀的使用、初次氮吹過程由實驗教師親自示范，氣瓶、減壓閥等進行詳述，使學生加深理解，隨后進行實際操作。提取及氮吹步驟均在通風櫥內進行，特別強調通風櫥活動擋板拉至離臺面15 cm以下，避免易揮發氣體對人體的傷害。

2.4 落實實驗安全措施

本實驗使用苯胺靈農藥標準品、大量有機溶劑等，具有揮發性，因此要求所有實驗環節，盡可能在通風櫥中進行。強調實驗安全，不要近距離吸入有機揮發性氣體。

標準品配制前，需要學習并反復練習移液槍的使用及移液操作，操作熟練后方可進行移液進行5 個標準品的配制。特別強調每配制完一份標準品務必注意移液槍槍頭的更換以及使用渦旋混勻儀以保證標準品準確、均勻、徹底混合。

提取溶劑的選擇苯胺類除草劑易揮發、難溶于水、易溶于有機試劑［14］。本實驗采用乙酸乙酯-正己烷（1∶1，V／V）進行提取，3 次提取過程，每次盡可能收集、提取全部有機相后，超聲時水溫升高使離心管內有機相揮發氣化體積膨脹，易使離心管蓋崩開，因此嚴格要求學生佩戴個人防護用品（Personal Protect Equipment，PPE）如實驗服、丁腈手套、護目鏡等，同時超聲機中放入適量冰袋，降低樣品溫度以減少氣體揮發。取出離心管置于離心管架時，要求輕拿輕放，切勿瓶口對人。

由于是初次使用離心機，需特別注意離心機轉子不同所對應程序不同，設置對應的轉子程序、帶蓋配平、對位放置，設置所需轉速、時間、離心溫度等條件后啟動，以保證離心機正常工作運轉。

由于初次接觸氮氣氣瓶，學生會有些許畏懼，教師演示如何開啟、關閉氣瓶及講述減壓閥的作用、氮吹儀的原理及使用，鼓勵學生實際動手操作，將理論聯系實際加深印象。

使用固相萃取儀及無油真空泵進行萃取時，注意先進行石墨化碳黑固相萃取小柱的預淋洗活化以及萃取后待分析物的洗脫，實驗中注意吸管的使用，保證所有提取的有機相都通過SPE小柱后收集至試管中。

以上各環節，需要實驗指導教師對每個細節反復強調，加深印象，稍有不慎，高靈敏的實驗結果數據會產生誤差。實驗整個過程，嚴格遵守食品化學實驗室各項安全規章制度，并按SOP 標準操作規程嚴格操作。

2.5 重視實驗過程

本實驗將先進儀器技術轉化為實驗教學資源，把科研意識的培養融入實驗教學過程，實現科研與教學的交互和融合，一方面使學生在實驗過程中充分了解前沿的科研成果及實驗方法；另一方面還鍛煉了學生的科學思維能力及探索創新能力［15］。實驗涉及農藥等化學品，且實驗操作較為繁瑣，細節等所需注意事項較多，且使用造價昂貴的大型精密儀器進行實驗，學生有所畏懼，不敢著手進行操作實施。第一步即使用移液槍進行標準品配制，由于不熟悉操作，失誤頻繁發生，學生心理上負擔較重，更易手忙腳亂，影響實驗進程。此時，教師應以鼓勵為主，語氣平緩，耐心并合理解釋該實驗難度，強調熟能生巧，逐漸緩解學生緊張情緒。每完成一個標準品的配制，方式方法上鼓勵學生為主，以增強自信心，熟悉操作后，實驗順利進行，充分激發了學生的成就感，對后續操作更加細致認真投入。

4 個樣品（2 平行樣+2 加標樣）通過二次氮吹濃縮制備完成后（過程約5 h），需使用自動進樣器、氣相色譜質譜聯用儀進行進樣及分析檢測。進樣前，實驗教師再次講授GC-MS 原理及設備，對照實物講解，極大地提升學習興趣，加深印象。學生通過GC-MS數據采集軟件，自行編寫進樣序列，邏輯上得到充分鍛煉，進樣器按照所編序列自動進樣，學生也獲得極大成就感。GC-MS運行后，學生也認真仔細觀察進樣口溫度、駐溫箱升溫過程、保留時間及譜圖等儀器分析過程。

2.6 養成良好的實驗習慣

實驗結束后，養成良好的習慣，主動打掃衛生，進行實驗室清理工作；廢液分別入有機、無機廢液桶，實驗室固體廢物如使用過的槍頭、一次性吸管等投入危險廢物垃圾，增強環保意識，提高自身的素質，提升科學實驗觀。設備使用完畢所有器材歸位，拔掉設備電源插頭等，減少安全隱患的同時，培養學生實驗室安全意識，為今后研究生階段實驗室安全操作打下良好的基礎。

2.7 加強對實驗結果分析能力的培養

由于每個樣本需要分析測試30 min，標準品5 個，樣品4 個，再加上降溫程序，設備單次運行5 h 左右，學生對結果進行分析并獨立完成實驗報告。實驗要求學生獨立使用GC-MS數據分析軟件，操作并讀取離子譜圖數據，根據標準品濃度及積分峰面積值制作校正曲線，通過外標法對樣本進行定量分析并計算相應加標回收率；從實驗操作人員自身（人）、測試過程中用到的儀器設備（機）、所用到的試劑與耗材（料）、所選擇的檢測方法（法）、實驗操作各個環節（環）5 個方面對影響樣品中農藥殘留量檢測準確性因素進行分析；儀器分析測定流程中在儀器裝置、方法等方面提出改進與創新的建議。若實驗加標回收率偏差較大，還需加以分析，總結實驗失敗的原因。實驗報告要求填寫實驗關鍵性證據、數據分析、質譜圖、思考題等，任務布置上結構合理，加強實驗知識的掌握。

3 結語

氣相色譜-質譜法測定蔬菜中苯胺靈殘留量，該實驗時間長、流程復雜、步驟多、綜合性強、實驗難度較大，但可以大大提升學生動手實操能力、統籌規劃能力、團結協作能力，以及邏輯能力等。對實驗指導教師要求較高，不僅具備專業知識，還需有愛心，耐心、細心和責任心，實驗中不僅指導學生還要鼓勵學生，以增強學生自信心。通過該實驗，認識、使用并了解色譜儀、質譜儀等大型儀器的工作原理，在之后的專業實習過程中，再次接觸到此類設備時，學生們普遍反映熟悉設備操作并加深了對分析儀器原理的理解。通過該實驗，促進了學生實驗技能提升的同時，也加強了實驗室安全意識，提高分析及解決問題的能力并學會對實驗進行總結，為今后科研階段打下堅實的實驗操作基礎。