組織特異性基因敲除小鼠生產(chǎn)的動物遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

熊 燕， 熊顯榮， 李志雄， 付 偉， 王 利， 林亞秋

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041）

0 引言

在“雙一流”高等教育背景下，學(xué)生對課程知識的掌握程度只是評價(jià)教學(xué)質(zhì)量好壞的標(biāo)準(zhǔn)之一，學(xué)生的應(yīng)用能力和創(chuàng)新思維培養(yǎng)才是關(guān)鍵［1］。實(shí)驗(yàn)教學(xué)是理工農(nóng)醫(yī)等學(xué)科專業(yè)課教學(xué)必不可少的實(shí)踐環(huán)節(jié)［2］。高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)教學(xué)不僅要實(shí)現(xiàn)對理論教學(xué)內(nèi)容的內(nèi)化，而且更要注重學(xué)生實(shí)踐能力、創(chuàng)新能力及解決復(fù)雜問題綜合能力的培養(yǎng)［3］。目前動物遺傳學(xué)課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)主要以“教師演示+學(xué)生照做”的教學(xué)模式進(jìn)行授課［4-5］。教師提前準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑耗材；按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書給學(xué)生進(jìn)行講解和指導(dǎo)，缺乏多元化和現(xiàn)代化教學(xué)手段，學(xué)生的參與度有限，較難提高學(xué)生對實(shí)驗(yàn)的興趣和主動性。隨著信息技術(shù)的快速發(fā)展，針對上述實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的普遍存在的問題，融合線上線下的教學(xué)平臺［6］，教學(xué)設(shè)計(jì)體現(xiàn)學(xué)生的主體地位，采用混合式教學(xué)模式將極大提高學(xué)生的參與度和積極性。

高等教育教學(xué)活動和科學(xué)研究相輔相成，2019 年教育部發(fā)布《關(guān)于深化本科教育教學(xué)改革全面提升人才培養(yǎng)質(zhì)量的意見》，鼓勵(lì)教師將最新科研成果轉(zhuǎn)化為教學(xué)內(nèi)容［7-8］。可見高校科研與教學(xué)相結(jié)合進(jìn)行創(chuàng)新人才培養(yǎng)是時(shí)代的需要，也是高校堅(jiān)持“以本為本”的體現(xiàn)，同時(shí)亦是提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平的有效途徑［9］。本教學(xué)團(tuán)隊(duì)成員長期圍繞組蛋白去甲基化酶KDM2A基因探索其在胚胎發(fā)育、骨骼肌生長和脂肪沉積中的生物學(xué)功能［10］，構(gòu)建了KDM2Aflox／-基因編輯小鼠，保存有卵母細(xì)胞［11］、骨骼肌（Pax7）［12］和脂肪組織（Adipoq）特異表達(dá)基因啟動子介導(dǎo)Cre 表達(dá)的工具鼠［13］。以教研團(tuán)隊(duì)的基因編輯小鼠（KDM2Aflox／-）和Adipoq-Cre工具鼠科為材料，通過設(shè)計(jì)3 代雜交實(shí)驗(yàn)方案，提取小鼠基因組DNA，采用PCR 技術(shù)檢測KDM2A和Cre 的基因型，旨在獲得脂肪組織特異的KDM2A基因敲除小鼠。該實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)采用線上線下混合的模式，融入經(jīng)典遺傳學(xué)與本學(xué)科前沿知識與技能，具有綜合性、設(shè)計(jì)性、研究性及趣味性的特點(diǎn)；教學(xué)設(shè)計(jì)以學(xué)生為中心，充分提高學(xué)生的參與度及主動性，真正培養(yǎng)了學(xué)生實(shí)踐能力、創(chuàng)新能力及解決復(fù)雜問題的綜合能力。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展及應(yīng)用優(yōu)勢的不斷突顯，該技術(shù)已加入最新版《動物遺傳學(xué)》教材中，在生物技術(shù)其他相關(guān)課程作為獨(dú)立章節(jié)進(jìn)行介紹。在動物生產(chǎn)中，研究者利用該技術(shù)制備了基因編輯豬、羊等家畜動物，在生物醫(yī)學(xué)和動物分子育種領(lǐng)域取得了重大突破［14］。因此緊密結(jié)合學(xué)科發(fā)展前沿及產(chǎn)業(yè)需求，本實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)了基于基因編輯技術(shù)及檢測手段的綜合實(shí)驗(yàn)（見圖1），實(shí)驗(yàn)內(nèi)容豐富、新穎有趣；在教學(xué)方式上，融合線上和線下實(shí)踐平臺，在課前、實(shí)踐課堂和課后多個(gè)維度調(diào)動學(xué)生的積極性及參與度。

圖1 KDM2A基因脂肪組織特異敲除小鼠獲得及基因型鑒定實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

1.1 課前學(xué)習(xí)

通過小規(guī)模專有在線課程（Small Private Online Course，SPOC）平臺學(xué)習(xí)基因編輯、Cre-Loxp 等實(shí)驗(yàn)相關(guān)前沿技術(shù)原理、熟悉實(shí)驗(yàn)操作手冊、發(fā)布獲得脂肪組織特異KDM2A敲除小鼠的任務(wù)，引導(dǎo)學(xué)生利用KDM2Aflox／-和Adipoq-Cre 小鼠設(shè)計(jì)雜交原理獲得Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox小鼠的實(shí)驗(yàn)方案，滿足學(xué)生的個(gè)性化學(xué)習(xí)的需求［15］；小鼠雜交實(shí)驗(yàn)操作相對簡單，但整個(gè)周期較長，鑒于本教學(xué)團(tuán)隊(duì)在科研項(xiàng)目實(shí)施過程中已獲得F3 代的小鼠，教師僅需課前準(zhǔn)備F3 代小鼠即可。

1.2 課堂學(xué)習(xí)

首先實(shí)驗(yàn)小組以PPT形式匯報(bào)小鼠雜交方案，學(xué)生互動，教師給予點(diǎn)評指導(dǎo)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，以期快速高效、最低成本獲得脂肪組織特異KDM2A 基因敲除小鼠；然后教師解析小鼠DNA純化及基因型分型關(guān)鍵步驟，并強(qiáng)調(diào)注意事項(xiàng)；學(xué)生正式開始實(shí)驗(yàn)，教師及時(shí)指導(dǎo)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)過程，并做好學(xué)生實(shí)踐情況的詳細(xì)記錄，作為實(shí)驗(yàn)成績的評價(jià)指標(biāo)之一。

1.3 課后學(xué)習(xí)

學(xué)生完成實(shí)驗(yàn)后，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并按要求撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告；將實(shí)驗(yàn)報(bào)告上傳至SPOC的作業(yè)模塊，每份實(shí)驗(yàn)報(bào)告至少由5 位同學(xué)進(jìn)行互評，系統(tǒng)自動去掉最高分與最低分，獲得平均分；教師根據(jù)實(shí)驗(yàn)課的過程記錄、結(jié)果討論及分析，對實(shí)驗(yàn)成績進(jìn)行確認(rèn)；最后反思整個(gè)教學(xué)設(shè)計(jì)及實(shí)施過程，線上補(bǔ)充薄弱知識點(diǎn)，進(jìn)行線上互動和討論。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

（1）深入理解基因編輯技術(shù)的原理及在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用；

（2）正確設(shè)計(jì)動物雜交實(shí)驗(yàn)方案，獲得基因敲除動物；

（3）熟練運(yùn)用PCR 技術(shù)對動物進(jìn)行基因分型及個(gè)體鑒定。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物、儀器及試劑

實(shí)驗(yàn)動物 KDM2A 基因編輯雜合小鼠（KDM2Aflox／-）和Adipoq-Cre小鼠。

試劑 組織DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）、引物、Rapid Taq PCR Master Mix、瓊脂糖、TAE、核酸染料、DNA Marker等。

儀器組織超聲破碎儀、離心機(jī)、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR 儀、超微量紫外分光光度計(jì)（NanoPhotometer）。

2.3 KDM2A基因編輯純合小鼠雜交方案設(shè)計(jì)

根據(jù)現(xiàn)有兩個(gè)品系小鼠基因型分別為KDM2Aflox／-和Adipoq-Cre小鼠，利用孟德爾的基因分離定律和自由組合定律原理，通過設(shè)計(jì)3 代的雜交實(shí)驗(yàn)，最后獲得基因型為Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox，并畫出遺傳圖譜。

2.4 小鼠耳組織基因組DNA純化

小鼠耳組織的DNA 純化按照天根生化科技有限公司（貨號：DP304）的操作手冊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，關(guān)鍵步驟如下：

（1）小鼠耳組織超聲打碎為細(xì)胞懸液，然后10000 r／min離心1 min，去上清，加入200 μL 的GA緩沖液，振蕩至徹底懸浮。

（2）加入Proteinase K混勻后，在56 ℃放置，直至組織溶解。

（3）加入200 μL 緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10 min，溶液應(yīng)變清亮。

（4）加入200 μL 無水乙醇，充分振蕩混勻15 s，此時(shí)可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。

（5）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3 中，12000 r／min離心30 s，棄廢液。

（6）向吸附柱CB3 中加入500 μL 緩沖液GD，12000 r／min離心30 s，棄廢液。

（7）向吸附柱CB3 中加入600 μL 漂洗液PW，12000 r／min離心30 s；并重復(fù)洗滌一次；棄廢液后，吸附柱室溫放置數(shù)分鐘晾干。

（8）將吸附柱CB3 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50 ～200 μL 洗脫緩沖液TE，室溫放置2 ～5 min，12000 r／min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

2.5 基因組DNA的質(zhì)量檢測

以洗脫緩沖液TE 為空白，用NanoPhotometer 分光光度計(jì)測純化DNA溶液的濃度和吸光度值，OD260／OD280比值應(yīng)該在1.8 ～2.0。超過該范圍意味著DNA樣品中可能存在蛋白質(zhì)或RNA污染。將DNA質(zhì)量符合要求的樣品，稀釋到濃度為50 ng／μL。

2.6 KDM2Aflox／flox和Adipoq-Cre基因型PCR檢測

以提取的基因組DNA 為模板，采用KDM2Aflox／flox和Adipoq-Cre的檢測引物（見表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對KDM2Aflox／flox、KDM2Aflox／-、KDM2A-／-、Adipoq-Cre+和Adipoq-Cre-的基因型進(jìn)行鑒定。PCR 擴(kuò)增體系25 μL：2 ×Rapid Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA 3 μL，ddH2O 7.5 μL，PCR反應(yīng)程序見表2。

表1 基因分型檢測的引物序列

表2 KDM2Aflox／flox和Adipoq-Cre的PCR反應(yīng)程序

2.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取10 μL PCR反應(yīng)的擴(kuò)增溶液，加入2%的瓊脂糖凝膠（含核酸染料）的點(diǎn)樣孔，設(shè)置DNA maker（點(diǎn)樣5 μL）孔，用1 ×TAE 緩沖液進(jìn)行電泳，120 V 下電泳30 min，電泳結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。

3 結(jié)果與分析

3.1 雜交方案及遺傳圖譜

利用Cre-Loxp系統(tǒng)獲得脂肪組織特異敲除小鼠，即Cre 重組酶特異識別KDM2A 基因兩側(cè)的Loxp 位點(diǎn)，切除KDM2A 基因序列［見圖2（a）］。現(xiàn)有KDM2Aflox／-和Adipoq-Cre 小鼠品系，設(shè)計(jì)可行的雜交方案，獲得脂肪組織特異的KDM2A敲除小鼠，即基因型為Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox（見圖3）。如圖2（b）所示，首先選擇KDM2Aflox／-的公母小鼠交配獲得KDM2Aflox／flox純合小鼠（F1 代）；然后將KDM2Aflox／flox純合小鼠與Adipoq-Cre+雜交篩選Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／-小鼠（F2 代）；最后將Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／-小鼠與KDM2Aflox／flox純合小鼠交配，篩選Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox小鼠（F3 代）。

圖2 獲得Adipoq-Cre +-KDM2Aflox／flox小鼠的雜交方案

圖3 Adipoq-Cre +-KDM2Aflox／flox為KDM2A脂肪組織特異敲除小鼠

3.2 DNA純化質(zhì)量檢測

提供20 只F3 代小鼠的耳組織樣品，按照試劑盒操作手冊純化DNA，采用微量分光光度計(jì)測定其濃度及純度。首先用洗脫緩沖液TE 校正儀器，吸取1 μL樣品進(jìn)行測定。如表3 所示DNA 的濃度在50 ng／μL左右，OD260／OD280比值均在1.8 ～2.0 之間，測定峰值為單峰（見圖4），說明提取的DNA質(zhì)量滿足后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)的需求。

表3 DNA樣品濃度及純度檢測

圖4 純化DNA濃度測定結(jié)果

3.3 瓊脂糖凝膠電泳圖譜

根據(jù)設(shè)計(jì)引物目的條帶大小，判斷小鼠基因型。針對KDM2A 小鼠的基因型，擴(kuò)增片段大小僅510 bp為KDM2Aflox／flox，出現(xiàn)510 bp和397 bp 兩條帶為雜合小鼠（KDM2Aflox／-），擴(kuò)增片段大小僅397 bp為野生型小鼠（KDM2A-／-）。針對Adipoq-Cre 小鼠的基因型，出現(xiàn)410 bp 的條帶，即為Adipoq-Cre+小鼠，否則為Adipoq-Cre-小鼠。如圖5 所示，3、5、10、12、19 號是Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox小鼠，也是本實(shí)驗(yàn)所需要獲得的脂肪組織KDM2A 基因特異敲除的小鼠。2、9、11、16、17 號是Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／-小鼠；1、13、14號為KDM2A 雜合小鼠（KDM2Aflox／-），4、6、7、8、15、18、20 為KDM2A 純合小鼠（KDM2Aflox／flox）。表明通過3 代的雜交實(shí)驗(yàn)可獲得組織組織KDM2A基因特異敲除小鼠，其比例為25%。

圖5 瓊脂糖凝膠檢測小鼠基因分型的結(jié)果

4 實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果

“KDM2A基因脂肪組織特異敲除小鼠生產(chǎn)及基因型鑒定”實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)及教學(xué)過程具有高階性、創(chuàng)新性和挑戰(zhàn)度，充分調(diào)動學(xué)生的積極性與參與度，提高學(xué)生解決復(fù)雜問題的綜合能力，培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐和創(chuàng)新能力。

4.1 “三個(gè)維度”調(diào)動學(xué)生的積極性與參與度

該實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)在課前、實(shí)踐課堂及課后體現(xiàn)了“以學(xué)生為中心”的教學(xué)理念。課前學(xué)習(xí)內(nèi)容緊扣學(xué)科發(fā)展前沿及行業(yè)需求，小鼠雜交方案設(shè)計(jì)的任務(wù)驅(qū)動環(huán)節(jié)具有探究性，提高了學(xué)生的主動性及課程的趣味性。實(shí)踐課堂教學(xué)，小組成員全程參與雜交方案匯報(bào)、方案優(yōu)化研討及實(shí)驗(yàn)操作，教師加強(qiáng)每個(gè)小組的過程記錄，及時(shí)給予反饋；此外，所提供小鼠的基因型教師亦未知，實(shí)驗(yàn)具有挑戰(zhàn)性與研究性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使學(xué)生更有獲得感。課后，學(xué)生積極參與同學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的互評及討論交流。以上教學(xué)設(shè)計(jì)與實(shí)施充分利用線上線下平臺融合，從多個(gè)維度讓學(xué)生忙起來，提高學(xué)生的參與度。

4.2 提高學(xué)生解決復(fù)雜問題的綜合能力

該實(shí)驗(yàn)涉及遺傳學(xué)的多個(gè)經(jīng)典與前沿知識，包括孟德爾分離定律和自由組合定律、分子遺傳學(xué)的基本理論、分子生物學(xué)檢測技術(shù)、基因編輯技術(shù)、Cre-loxp組織特異性基因敲除技術(shù)等。實(shí)驗(yàn)本身具有很強(qiáng)的綜合性與設(shè)計(jì)性，加上檢測小鼠的基因型事先未知，提高實(shí)驗(yàn)的挑戰(zhàn)度與探究性。在整個(gè)雜交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作過程中，需要學(xué)生有理論聯(lián)系實(shí)際、化繁為簡、有機(jī)整合的工作與學(xué)習(xí)思路，鍛煉了學(xué)生解決復(fù)雜問題的綜合能力。

4.3 培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐與創(chuàng)新能力

該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容源于本教學(xué)團(tuán)隊(duì)的科研成果，KDM2Aflox／-基因編輯小鼠由團(tuán)隊(duì)首次構(gòu)建［16］，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容具有前沿性；在雜交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)，每組的設(shè)計(jì)方案不拘一格，鍛煉了學(xué)生的創(chuàng)新思維；課前、課中和課后都有不同形式的討論環(huán)節(jié)及作業(yè)互評，極大地鍛煉學(xué)生的辯證與批判思維。

5 結(jié)語

“脂肪組織KDM2A 基因特異敲除小鼠獲得及基因型鑒定”的綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，已在動物遺傳學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)取得較好的教學(xué)效果。鑒于該實(shí)驗(yàn)動物為小鼠、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容前沿，實(shí)驗(yàn)具有綜合性、挑戰(zhàn)性及創(chuàng)新性，同樣可作為生物技術(shù)、生物工程、醫(yī)學(xué)等專業(yè)遺傳學(xué)課程的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行推廣。此外，本實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)基于線上線下混合的教學(xué)模式，融合線上線下平臺資源，體現(xiàn)學(xué)生的主體地位，極大提高學(xué)生的主動性及參與度，這種模式為其他實(shí)驗(yàn)課教學(xué)提供了借鑒。