脊髓性肌萎縮癥新生兒篩查研究進展

鐘玉杭 黃小玲 孫志豪

南方醫科大學附屬東莞婦幼保健院東莞市新生兒疾病篩查中心 (廣東 東莞 523000)

1891年，奧地利病理學家GuidoWerdnig首次報告了脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)[1]，是由于脊髓前角運動神經元變性，引起以肌無力、肌萎縮為臨床特征的常染色體隱性遺傳病(AR)。有研究報道新生兒時期發病率為1/6000～1/10000[2]，人群攜帶率約為1/42[3]，是嬰幼兒期致死性最高的遺傳性疾病。

近10年，隨著藥物治療取得重大突破[4]，SMA成為有藥可醫的罕見病。2019年2月，國家藥品監督管理局(NMPA)正式批準了諾西那生鈉(活性成分：諾西那生)上市，開啟國內SMA精準治療新時代[5]，2021年6月，第二款SMA治療藥物利司普蘭口服液在中國上市。隨后，2款藥物于2022，2023年納入醫保，使得SMA治療有保可依，減輕了患者家庭負擔。

國內，SMA篩查主要集中于育齡人群攜帶者[6-8]，尚未普及開展新生兒期SMA篩查，幾乎所有患兒就診時已有明顯的肌無力癥狀[9]。新生兒篩查是保證SMA早診早治，獲得良好預后的關鍵。截止2022年，SMA新生兒篩查已在美國(篩查數量：2395718，發病率：1/13,310)、日本(篩查數量：22209，發病率：0)、澳大利亞(篩查數量：202388，發病率：1/10,652)、加拿大(篩查數量：139810，發病率：1/27,962)、意大利(篩查數量：58558，發病率：1/4880)、俄羅斯(篩查數量：12000，發病率：0)、德國(篩查數量：297163，發病率：1/6911)、比利時(篩查數量：127329，發病率：1/14,148)等[10-13]國家開展。中國臺灣[14]、浙江杭州[15]率先開展新生兒SMA篩查的臨床方法學探索研究，為我國SMA新生兒篩查開展積累了經驗。但針對新生兒篩查體系，如何選擇滿足新篩原則的技術方法學仍然需要不斷的積累經驗和創新[16]。例如基于DBS樣本的極微量DNA檢測方法學開發，不同實驗環境的結果判讀參考區間制定及穩定性，準確性評估等。本文對SMA新生兒篩查的相關研究進行綜述，為廣大臨床工作者了解新生兒人群SMA篩查技術提供幫助。

1 SMA分子病理及臨床表現

SMA是脊髓前角a-運動神經元退化變性引起的肌無力、肌萎縮為主要特征的疾病。運動神經元主要是將脊髓及大腦的信號傳輸至肌肉和內分泌腺，通過一系列的神經傳導支配身體的效應器官活動。運動神經元存活基因1(SMNl;OMIM 600354)雙等位基因發生致病變異影響運動神經元存活蛋白表達，導致信號傳導異常。SMN1位于染色體5q13，該區域500kb范圍內還存在1個高度同源的SMN2(SMNc)基因，二者僅相差5個堿基，其中2個堿基位于外顯子7(c.840C/T)和8(c.＊239G/A)中，另外3個位于第6、7內含子。SMN基因終止密碼子位于外顯子7的3’末端，外顯子8不編碼氨基酸，因此，SMN1和SMN2的編碼區序列僅在外顯子7中存在1個差異堿基(c.840C/T)。c.840T破壞了剪接增強子(ESE)活性,使得SMN2基因外顯子7被剪接掉，產物為截短體，導致有功能的SMN蛋白只占10%[17]。正常人群中兩條染色體上各有一個等位SMN1拷貝，在肯定者人群中約有4%的頻率會出現兩個SMN1拷貝存在于同一條染色體上,形成[2+0]型攜帶者，SMN2修飾基因拷貝數可以0～5不等。5%～10%的正常人同源缺失SMN2基因，因此普遍認為SMN2基因不是運動神經元生存所必須的。研究顯示，95%～98%SMA患者存在SMN1基因純合缺失，主要是SMN1基因第7號外顯子的純合缺失，另有2%～5%SMA患者存在復合雜合突變。此外，SMN1基因啟動子區域的異常也會影響基因表達及蛋白功能。

SMA臨床表現為進行性、對稱性肌無力與肌萎縮，近端比遠端嚴重，下肢無力重于上肢，通常不累及眼外肌、膈肌、心肌、面部表情肌，亦無中樞神經系統異常[18]。神經肌電圖顯示為典型的神經源性損害，靜息時可見纖維顫動波和正銳波，規律自發性運動單元活動單位是SMA的肌電圖的特征性改變[19]。血清酶學檢測可以檢測到肌酸激酶的異常升高。

根據起病年齡、運動里程碑及病情進展程度將脊髓性肌萎縮癥分為0～Ⅳ型，發病年齡越早病情越重[20]。脊髓性肌萎縮癥0型患兒一般在出生前發病，若不治療，一般存活不超過1個月；脊髓性肌萎縮癥I型(Werdnig-Hoffman病)，[OMIM253300]，亦稱嚴重型，患兒于6月齡以內發病，全身出現嚴重肌無力和肌張力減弱，腱反射消失或減退，沒有倚托不能坐，通常在2歲前因肺部感染而死亡，是臨床類型最嚴重類型；脊髓性肌萎縮癥Ⅱ型[OMIM 253550]，又稱中間型，患兒于出生后6～18個月發病，肢體的近端對稱無力為主，下肢比上肢重，能坐卻不能站立、行走，大多數患兒能存活到青少年;脊髓性肌萎縮癥Ⅲ型(Kugelburg-Welander病)，[OMIM253400]，多數兒童期或青春期發病，患兒可以獨立走動，病情緩慢，能存活到成年;脊髓性肌萎縮癥Ⅳ型[OMIM271150]，亦稱為成年型，臨床表現較輕，發病和進展隱匿，生存時間與常人相近，但患者可有行走困難[21]。

2 SMA篩查技術

2.1 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析(PCR-restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP)PCR-RFLP基本原理是通過PCR擴增目標序列，利用限制性內切酶切割擴增產物形成長短不一的DNA片段，經過瓊脂糖凝膠電泳進行區分。可以根據SMN1與SMN2基因第7和8 外顯子間堿基不同，形成限制性內切酶位點差異，對SMN1存在的缺失進行區分。白晉麗等[22]統計了2004年1月至2017年12月采用不同基因診斷技術出具的診斷報告人數和構成比，結果表明PCR-RFLP是常用于早期診斷SMA的技術，但由于不能檢測SMN1基因單拷貝數狀態，會導致對致病變異是復合雜合型的患者產生漏診或誤診現象[23]。2012年，金煜煒等[24]使用PCRRFLP與MLPA技術對339例疑似病例開展分析，結果顯示PCR-RFLP發現194例SMN1純合缺失，MLPA發現196例，兩種技術的一致性達到98.9%，無顯著差異(χ2=0.2,P=0.88)。PCR-RFLP僅發現4例SMN1疑似雜合缺失，而MLPA驗證有17例，二者一致性為23.5%，存在顯著差異(χ2=8.29，P＜0.01)。因此，PCR-RFLP盡管特異性高，但對于SMN1雜合缺失并存在點突變的病例仍存在局限性。

2.2 多重連接探針擴增(multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)MLPA方法是目前SMN基因拷貝數檢測的金標準。以SMN基因的外顯子7及外顯子8作為靶標，利用外顯子上的差異位點設計雜交探針，對每段靶序列/靶位點設計一對寡核苷酸探針。將待測DNA樣品變性后與探針進行雜交，當左右兩側的探針都雜交到目標區域時，探針可以被連接酶連接然后進行PCR擴增。MLPA與一般PCR方法的不同之處在于，被擴增的并非靶序列本身，而是被連接起來的探針。此外，還需要使用參考探針，引入多個管家基因作為內參基因進行定量。目前基于MLPA 技術已經開發了穩定的SMA拷貝數檢測商品化試劑盒，能檢測SMN1第7和8外顯子拷貝數，明確區分患者、攜帶者及正常人，同時可檢測患者SMN2拷貝數，SMN2作為修飾基因能為臨床干預策略制定提供有用的信息[25-26]。由于該方法對DNA的實驗操作復雜，周期較長，成本高、對雜質比較敏感，不適合大規模篩查，也不能用于鑒定SMN1的微小突變及[2+0]型攜帶者[27]，通常被用作技術對比和驗證。

2.3 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR) qPCR主要原理是基于PCR擴增技術，利用Taqman探針法或SYBR Green熒光素染料實現目標序列相對定量，是SMA新生兒篩查以及攜帶者篩查最經濟有效的方法。周成等[28]利用qPCR法對19297名孕婦進行攜帶者篩查，對攜帶者孕婦配偶進行相應檢測，如果雙方同為攜帶者對胎兒進行產前診斷。共檢出SMA攜帶者286例，攜帶率為1.48%，其中6對夫婦同為SMA攜帶者，經產前診斷確診純合缺失患兒1例，SMN1基因E7、E8 雜合缺失胎兒4例，正常基因型胎兒1例，qPCR結果與MLPA驗證一致。qPCR技術實驗周期短、實驗操作簡便、實驗成本低、結果準確可靠、技術靈敏度高等優勢，非常適合SMA攜帶者篩查以及新生兒篩查。但其特異性略遜于MLPA方法[23]，為了確保SMN1的特異性并避免SMN2基因的影響，2018年，Fran?ois Boemer等[29]設計了一種使用錨定核酸探針的定量聚合酶鏈反應 (qPCR) 技術，在比利時列日地區啟動了一項為期三年的試點項目，對136,339名新生兒進行SMN1第7外顯子缺失檢測，旨在特異性識別SMN1基因中外顯子7純合缺失[30]。結果顯示本地區SMA發病率為1/13634，純合子缺失的發生率為1/15149[31]，共發現了9例SMA，對于有神經肌肉疾病癥狀的患兒均被轉診到NMRC進行MLPA復檢確診，確診提示qPCR在最初的DBS檢測中無假陽性。2018年10月，美國紐約州使用qPCR方法開展新生兒SMA篩查，結果顯示34名新生兒呈陽性，經過驗證發現qPCR用于SMN1拷貝數檢測結果準確可靠[32-33]。Jennifer L Taylor等[34]研究發現qPCR不僅能進行新生兒血斑篩查，同時可用于篩查脊髓性肌萎縮癥和嚴重聯合免疫缺陷。

2.4 數字PCR(digitalpolymerase chain reaction，dPCR) 近年來，微滴式數字PCR(ddPCR)方法發展迅速，原理是以單分子PCR技術為基礎，結合統計學方法對DNA進行絕對定量[35]。實驗過程中通過稀釋法將樣本分到獨立區室，每個區室最多包含1拷貝模板，DNA被分配到數千個液滴進行擴增，通過記錄每個液滴的熒光信號判斷陽性或陰性，隨后根據柏松分布推算模版DNA的濃度或基因拷貝數。該方法擺脫了對標準曲線的依賴，非特異性擴增少，對SMN1和SMN2基因拷貝數檢測的CV值明顯優于qPCR技術[36-37]，Noemi Vidal-Folch[38]對1530名嬰兒和12名SMA患者進行濾紙干血斑SMN1和SMN2外顯子7拷貝數檢測，開發了一種適用于新生兒篩查、攜帶者狀態和脊髓肌萎縮評估的多重微滴數字PCR方法，可以同時檢測DBS和其他組織中的SMN1缺失和SMN2拷貝數變化，證實ddPCR可用于拷貝變異檢測[39-40]。2016年，鄒洋等[41]使用微滴式數字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)對138例樣本(來自56個SMA家系，其中產前診斷樣本17例)開展SMN1基因外顯子7拷貝數的檢測。ddPCR與MLPA技術檢測結果的一致率為100%，ddPCR技術可滿足臨床 SMN1基因檢測及產前診斷的需求，但是目前數字PCR儀的普及率不高，在臨床應用上暫時還無法替代qPCR方法。

2.5 測序法(sequencing)

2.5.1 Sanger測序，上世紀70年代末由美國生物化學家Frederick Sanger提出[42]，因其堿基測序準確度高，被稱為基因檢測“金標準”。2013年，曹延延等[43]評價了Sanger測序技術用于診斷缺失型脊髓性肌萎縮癥的可行性。通過識別樣本擴增片段中SMN1及SMN2的4個差異位點判讀SMN1純合缺失，100例確診患者和110例對照樣本測試結果與MLPA結果一致性為100%。證實Sanger測序技可以用于缺失型脊肌萎縮癥的分子診斷。2017年，同一課題組對52例患者采用PCR-Sanger測序來檢測SMN1基因純合或雜合缺失以及復合雜合突變，并對診斷效率進行評估，結果顯示該方法與MLPA一致性100%，不僅可以用于SMN1基因拷貝數純合或雜合缺失，還可以篩選SMN1基因上的點突變，進行SMN1基因復合雜合變異病例診斷[44]。此外，王逸群等[45]對疑似復合雜合突變患者進行Sanger測序，結果發現有2例患兒分別在第5外顯子、第1外顯子兩處非固有差異的堿基位點處發生基因突變，而且均為已報道的SMA致病突變[44]，突變均源于患者母親。研究提示Sanger測序能檢測SMA突變位點，驗證突變類型，為疾病及早診斷提供依據，具有重要的臨床意義。

2.5.2 二代測序技術(next-generation sequencing，NGS) 是基于PCR和芯片技術發展而來的高通量測序技術，臨床上常用于基因組微小變異和拷貝數檢測。2017年，Feng等[46]利用雜交捕獲和NGS技術對6738例臨床樣本進行SMA攜帶者篩查。結果顯示與qPCR或MLPA比較，該方法對于攜帶者檢出靈敏度為100% (CI: 95.9-100%; n=90) ，特異性為99.6% (95% CI: 99.4-99.7%; n=6,648)，而且可以同時檢測SMN1拷貝數和SMN基因微小變異，但微小變異在SMN1和SMN2上的定位還無法明確[47-48]。2019年，Chen等[49]使用NGS技術以及新開發的生物信息學方法對12747例樣本SMN1和SMN2的拷貝數進行攜帶者篩查，經數字PCR驗證顯示SMN1和SMN2拷貝數結果一致性分別為100% (48/48) 和98% (47/48)，該方法提示利用SMN1與SMN2基因8個基因組參考信息的差異，通過NGS技術和信息學可以對2個基因的拷貝數進行精確鑒定。2020年，Zhao等[50]采用NGS對來自中國南方5省34個民族的10585對正常夫婦進行SMA攜帶者篩查泛種族研究，研究揭示了不同民族間攜帶率的差異(0.3～4.3%)，可為未來的大規模篩查應用提供數據參考，但不同民族采集的數據規模差異可能會影響攜帶率的統計。

2.6 其他方法除上述篩查技術外，還有DNA質譜法[15]、液體微珠陣列[51]、高分辨熔解曲線分析(HRMA)[52]等方法被應用于SMA突變檢測。這些方法各有優缺點，其中HRMA發展迅速，在SMA新生兒篩查中具備較大潛力，目前可區分9種SMN拷貝數組合，但仍需繼續研究區分更多拷貝數組合[53]。

3 總 結

SMA是嚴重致死性神經系統疾病，中國人群攜帶率高達1/42，95%是由SMN1基因的外顯子7純合缺失引起的。目前已批準用于治療的三種藥物分別是nusinersen、onasemnogene abeparvovec和risdiplam，也有幾種藥物正處于臨床前或早期臨床開發階段。

隨著諾西那生鈉和利司普蘭被納入醫保，推動了國內SMA新生兒篩查的開展。臨床試驗證實在患兒出現癥狀前開始治療，患兒在存活率、運動里程碑達成等方面均有更大獲益。目前臨床上常用于SMA新生兒篩查的技術是qPCR和MLPA。在大多數程序中，首先通過qPCR完成篩查，對于疑診SMA進行MLPA復核/驗證。而數字PCR法、高分辨熔解曲線分析法、NGS等新興技術方法在臨床SMA新生兒篩查中具有巨大的潛力。新療法的開發讓SMA攜帶者和新生兒篩查在許多國家得以普及，攜帶者篩查有可能降低人群疾病發病率，但無法針對整個人群，并且明顯具有社會導向性，同時攜帶者篩查無法識別新突變，也不能完全涵蓋父親未知或父母一方或雙方缺席的嬰兒。而新生兒篩查具有普遍性，適用于所有兒童，無論其父母的狀況如何，都能使患者和社會從創新藥物中獲得最大利益。目前SMA的新生兒篩查已在國外多個國家開展，為我國開展大規模新生兒篩查提供了經驗。吳莉萍等[54]基于濾紙干血斑建立的基因組DNA自動化提取方法及流程，為在現有新生兒篩查體系增加SMA篩查提供了技術基礎。新生兒篩查和攜帶者篩查同時實施將有效降低SMA發病率，對減輕家庭和社會負擔、提高人口素質具有重要意義。