銀杏內酯鼻噴制劑對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

錢欣穎 梁學亞 蔣 薇 李志勇

（成都百裕制藥股份有限公司創新藥研究院生物部，四川 成都，610000）

缺血性中風，是腦血管疾病中比較常見的一種疾病，致殘率和致死率很高，是為患者和社會帶來沉重負擔的疾病之一[1-2]。大腦動脈（尤其是大腦中動脈）閉塞會導致缺血性中風，引起一系列神經毒性事件，包括氧化損傷[3]、自噬[4]、血腦屏障通透性增加和功能障礙[5]、炎癥途徑[6]及鈣超載[7]等，最終導致神經元和腦細胞的死亡。鼻腔給藥是一種便捷的給藥方式，活性成分可經鼻黏膜迅速吸收，作用于鼻腔局部和全身，此外，還可直接將藥物傳遞至大腦[8]。與口服或靜脈給藥相比，鼻腔給藥具有包括非侵入性、自我給藥以及高生物利用度等優點，是近些年來制劑學領域研究的熱點之一[9-10]。許多中樞神經系統相關疾病已經通過鼻腔給藥治療，如帕金森、阿爾茲海默癥、癲癇、成癮等[11]。鼻腔給藥治療腦缺血已有一定研究基礎。YANG J P 等[12]證實了鼻內給藥重組人VEGF 可減少梗死體積，改善行為恢復，并增強腦血管生成。楊開清[13]用腦醒噴鼻劑治療急性缺血型中風，該藥能顯著改善腦缺血，減輕自由基損傷，保護腦細胞。銀杏內酯和白果內酯的神經保護作用已在多個臨床前研究中得到驗證[14-17]。金閣萊?（銀杏內酯注射液）是由白果內酯、銀杏內酯A、B、C等組成的天然藥物注射液，是唯一兼具拮抗血小板活化因子及保護神經血管單元的分子復方藥物，其安全性和有效性已在臨床得到證實。為了進一步提高金閣萊有效藥物成分的臨床使用便利性、增加患者依從性，因此，本研究主要探究鼻內給予銀杏內酯鼻噴制劑在腦缺血再灌注損傷方面發揮的保護作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級6～8 周齡的SD 大鼠，雄性，體質量220～250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK（浙）2019-0001，合格證編號：20210316Aazz0619000800]提供。大鼠飼養在屏障內，內部環境溫度為（22±2）℃，環境濕度范圍為40%～70%，12 h 晝夜循環，動物自由飲用水和飼料，適應環境1 周左右開始實驗。

1.2 藥品與試劑

銀杏內酯鼻噴制劑由成都百裕制藥股份有限公司與健喬信元醫藥生技股份有限公司（中國臺灣）合作研究和開發。陽性藥物依達拉奉（生產企業：先聲藥業集團有限公司，生產批號：86-200802）。氯化三苯基四氮唑（生產企業：北京西濃科技，生產批號：409E033）。多聚甲醛（生產企業：科隆化工，生產批號：2019052001）。甲醇(HPLC 級)購自Merck kGaA。

1.3 儀器設備

電子天平（生產企業：德國賽多利斯，型號：SECURA225D-1CN）、小動物安樂死系統（生產企業：上海玉研科學儀器廠，型號：LC-500-S1）、高速冷凍離心機（生產企業：四川蜀科儀器廠，型號：TGL-16）、高效液相色譜系統（生產企業：日本 SHIMADZU，型號：LC-20AD）、四極桿離子阱質譜儀（生產企業：美國 Applied Biosystem，型號：API 4000）。

2 實驗方法

2.1 藥代動力學測定

通過高效液相色譜-質譜(LC-MS/MS)法檢測大鼠血漿含有的銀杏內酯鼻噴制劑的藥物濃度。SD 大鼠鼻腔滴注（IN）10 mg/kg 銀杏內酯鼻噴制劑，分別在0、0.25、0.5、1、2、4、8 h 各時間點麻醉取全血，離心得到血漿，向含25 μL 的空白血漿（標準曲線樣品、質控樣品）或待測血漿樣品的96 孔板中加入25 μL 標準樣品系列溶液、質控溶液或甲醇，再加25 μL 內標工作液，最后加200 μL 甲醇，渦旋震蕩3 min，在3 800 rpm/min 條件下進行15 min 離心處理，用移液槍吸取上清液200 μL 進行LC-MS/MS 檢測藥物濃度。

2.2 動物藥效實驗

2.2.1 動物分組及給藥方式

篩選35 只健康狀態良好的雄性SD 大鼠，按照體質量對其進行分組，設置假手術組（5 例），腦缺血再灌注模型組（10例）、依達拉奉陽性對照組（6 mg/kg）（10 例）、銀杏內酯鼻噴制劑組（10 例）。所有動物在復灌后即刻首次給藥，陽性對照依達拉奉組尾靜脈注射，連續給藥3 d；銀杏內酯鼻噴制劑組滴鼻給藥，造模當天給藥1 次，之后給藥2 次/d，共給藥3 d，具體操作為將動物保持仰臥姿勢，藥物通過右鼻孔滴注100 μL，左鼻孔不給藥[18]。模型組與假手術組經鼻給予同體積的溶媒。

2.2.2 大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注（MCAO）模型構建

給藥組與模型組大鼠按7 mL/kg 腹腔注射6%的水合氯醛麻醉，在手術臺上保持仰臥姿勢。大鼠頸部正中偏右剪開皮膚，做大約1.5 cm 長的切口，分離暴露右側頸總動脈，沿頸總動脈遠心端將頸內外動脈分離，在頸外動脈處做切口，沿頸內動脈插入線栓，有明顯阻力感立即停止插入，缺血2 h后，將線栓完全取出，實現缺血再灌注。假手術組動物用6%水合氯醛麻醉后，僅分離暴露頸總動脈，不做中動脈栓塞處理。在整個操作過程中，使用加熱墊和加熱燈將大鼠體溫保持在（37.0±0.5）℃。

2.2.3 觀察指標

（1）神經功能評分：通過Longa 評分法對大鼠在經過24 h 的缺血再灌注后的神經癥狀進行評分[18]。評分結果劃分成5 個級別，級別越高，代表神經功能受損越嚴重，詳細的評分標準，見表1。

表1 Longa 評分表

（2）腦梗死面積檢測：大鼠缺血再灌注72 h 后，將大鼠置于二氧化碳安樂死箱中進行安樂死，將提前預冷的PBS 溶液灌注心臟，迅速取各組動物腦組織，除去小腦、嗅球、低位腦干部分，沿冠狀切面切成厚度約2 mm 的6 片腦部切片，輕輕置于1%的TTC 溶液中，37 ℃水浴30 min，期間用鑷子輕輕翻動，經染色后正常腦組織呈現紅色，梗死組織區域不會被染色（呈現蒼白色），用圖像分析軟件對每個切片上的梗死區域進行劃分和分析，計算腦梗死面積百分比，腦梗死面積百分比（%）= 腦右側梗死面積/全腦面積×100%。

（3）相對腦含水量檢測：大鼠缺血再灌注后72 h 后進行安樂死，取腦組織，即上述腦梗死面積檢測組織，在TTC 染色前準確稱取腦組織濕重，TTC 染色后將組織放于60 ℃恒溫干燥箱中烘烤24 h，干燥后準確稱取腦組織干重，按照干濕重法對大鼠的相對腦含水量進行計算，公式為：相對腦含水量測試組=［（腦組織濕重-腦組織干重）測試組-（腦組織濕重-腦組織干重）假手術組］

3 統計學分析

采用EXCEL 和SPSS 22.0 進行數據統計分析，計數資料以（±s）表示，采用Graph Pad Prism 8 軟件對不同組別動物給藥后的參數進行繪圖。數據進行方差齊性檢驗，當方差齊時P＞0.05，采用單因素方差分析（ANOVA）中的Dunnett's &LSD 法對組間差異進行比較。當方差不齊時P＜0.05，通過Kruskal-Wallis H 秩和檢驗（K-W 法）里面的Mann-Whitney U 檢驗（M-W 法）完成組間差別分析。通過WinNonlin 8.3 軟件對藥動學參數進行求取。

4 實驗結果

4.1 鼻腔滴注藥代動力學

SD 大鼠鼻腔給予10 mg/kg 銀杏內酯鼻噴制劑后在不同時間點進行采血，對銀杏內酯鼻噴制劑內含的主要成分，即白果內酯與銀杏內酯B 進行檢測，具體藥代動力學參數見表2。其中，白果內酯和銀杏內酯B 的半衰期t1/2分別為2.70 h 和8.04 h，給藥時曲線下面積AUCall分別為3 046 ng/mL 和1 257 ng/mL，藥物達峰時間tmax分別為2 h 和0.333 h，結果表明藥物可通過鼻腔系統迅速吸收進入全身，且具有較好的藥代特征。

表2 大鼠鼻腔給藥銀杏內酯鼻噴制劑10 mg/kg 的藥代動力學參數(n=10)

4.2 銀杏內酯鼻噴制劑對大鼠Longa 神經行為學評分的影響

建模24 h 之后，假手術組大鼠除因外科手術創口導致活動略微減少外，未見明顯異常癥狀；其余各組動物出現不同程度的體質量下降，活動減緩，對側前爪屈曲、行走時身體向對側偏倒或者無法自發行走，對所有組大鼠進行Longa 神經行為學評分。Longa 評分結果見表3 和圖1，模型組評分為（2.92±0.19）分，依達拉奉組為（2.20±0.25）分，銀杏內酯鼻噴制劑組為（2.09±0.09）分。與假手術組相比較，模型組評分顯著升高（P＜0.001），動物表現出明顯的運動行為缺陷，表明建模成功。與模型組相比，依達拉奉組、銀杏內酯鼻噴制劑組運動行為缺陷減少，神經功能缺損評分降低，差異有統計學意義（P＜0.05），且銀杏內酯鼻噴制劑組與依達拉奉組評分相當或更低。

圖1 銀杏內酯鼻噴制劑對大鼠Longa 神經行為學評分的影響

表3 各組動物Longa 神經行為學評分統計結果 （±s，分）

表3 各組動物Longa 神經行為學評分統計結果 （±s，分）

注：與假手術組相比，***P＜0.001；與模型組相比，#P＜0.05。

4.3 銀杏內酯鼻噴制劑對大鼠腦梗死面積的影響

造模72 h 后，模型組大鼠右腦部位出現了明顯的梗死灶，依達拉奉組和銀杏內酯鼻噴制劑組出現不同程度的梗死灶。TTC 染色結果顯示，模型組動物腦梗死面積百分比為（24.78±1.72）%，與假手術組（0.00±0.00）%相比顯著升高（P＜0.001）；給予依達拉奉后，腦梗死面積明顯減小，百分比為（10.89±1.57）%，差異有統計學意義（P＜0.001）；銀杏內酯鼻噴制劑組腦梗死面積百分比為（20.57 ±1.40）%，與模型組相比雖差異無統計學意義（P＞0.05），但仍表現一定降低腦梗死面積的作用，見圖2。

圖2 銀杏內酯鼻噴制劑對大鼠腦梗死面積的影響

4.4 銀杏內酯鼻噴制劑對大鼠腦水腫的影響

實驗終點，檢測各組動物相對腦含水量（g），結果顯示，模型組大鼠與假手術組的相對腦含水量分別是（0.20±0.03）g與（0.00±0.03）g，模型組明顯更高，兩者相比差異有統計學意義（P＜0.001）；給予銀杏內酯鼻噴制劑和依達拉奉可明顯減少相對腦含水量，腦相對含水量分別為（0.12±0.03）g 和（0.13±0.03）g，與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。實驗結果表明銀杏內酯鼻噴制劑對大鼠MCAO 模型中的腦水腫有良好的改善作用，在該指標上與陽性依達拉奉相當，見圖3。

圖3 銀杏內酯鼻噴制劑對大鼠腦水腫的影響

5 討論

許多臨床前研究已經驗證了銀杏內酯與白果內酯對于缺血性中風的細胞和信號事件的作用，包括炎癥途徑和神經保護。本研究中的銀杏內酯鼻噴制劑主要成分為銀杏內酯A/B/C/J（總占比為52%～64%）、白果內酯（占比為36%～48%）。以往研究結果表明，對小鼠tMCAO 模型腹腔注射給予3.5 mg/kg 銀杏內酯注射液，能顯著改善模型急性期臨床癥狀，主要機制為通過抑制模型發展過程中的炎癥因子和炎癥小體進而發揮保護作用[19]。同樣，在大鼠MCAO 模型上同樣證明了銀杏內酯注射液和其內部主要成分銀杏內酯B 與白果內酯在急性腦缺血性腦損傷方面的治療作用，其機理可能和突觸后致密蛋白的濃度發生改變有關[20]。

為了提高臨床的使用便利性和患者的依從性，我們探索開發銀杏內酯的鼻噴制劑。由于鼻噴劑用藥方便、適合擴展國際市場等多方面優勢，在中風、創傷后應激綜合征、鎮靜抗焦慮及血管性癡呆等適應證方向具有較高的應用價值。基于相關制劑體系，采用不同比例和類型的增溶劑、抗菌防腐劑、陽離子螯合劑、增稠劑、助懸劑、滲透壓調節劑、表面活性劑和溶劑等，制備了多種制劑配方，最終篩選得到的鼻噴劑處方可以達到10 mg/mL 的載藥濃度。大鼠鼻腔滴注銀杏內酯鼻噴制劑的藥代動力學數據也很好證明了藥物可通過鼻黏膜吸收迅速進入體內，具有一定的暴露，且銀杏內酯B 的半衰期可達到8 h。

在實驗性中風研究中，大腦中動脈閉塞（MCAO）被認為是模擬人類缺血性中風的最佳模型之一，并在大鼠和沙鼠上有大量研究[21]。本研究中，采用線栓法構建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，以依達拉奉為陽性對照，缺血再灌注后，鼻內滴注銀杏內酯鼻噴制劑能改善神經功能損傷，減小腦梗死面積，改善腦水腫，表明銀杏內酯鼻噴制劑對實驗性的局灶性腦缺血再灌注模型在急性發作期間的受損具有顯著的保護作用，是一種潛在的治療方案。