骨髓增生異常綜合征患者治療效果的影響因素及與MTHFR基因多態(tài)性的關(guān)系

梅書(shū)豪,邢玉,劉璐,王鵬遠(yuǎn)

(許昌市中心醫(yī)院 a.血液內(nèi)科;b.腫瘤科,河南 許昌 461000)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)以細(xì)胞分化、形態(tài)異常、血細(xì)胞減少為主要特征,是一種異質(zhì)性造血疾病,具有進(jìn)展轉(zhuǎn)化為急性白血病的高風(fēng)險(xiǎn)[1]。依國(guó)際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)(the international prognostic scoring system,IPSS)危險(xiǎn)度,臨床MDS治療過(guò)程中,針對(duì)低危患者往往以支持療法為主,并給予免疫調(diào)節(jié)輔助;針對(duì)高危患者,則給予傳統(tǒng)療法聯(lián)合化療或干細(xì)胞移植,達(dá)到多克隆造血重建、有效延長(zhǎng)患者生存期的目的[2]。然而,雖然干細(xì)胞移植是目前為止MDS治愈唯一方法,但受年齡、配型等諸多限制,多數(shù)患者均無(wú)接受此項(xiàng)治療的機(jī)會(huì)。近年來(lái),MDS疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中DNA甲基化異常發(fā)揮的關(guān)鍵性作用愈發(fā)受到關(guān)注,與此同時(shí)去甲基化治療也成為臨床研究熱點(diǎn)之一。地西他濱為5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶核苷,具雙重作用機(jī)制,高濃度時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用,而低濃度時(shí)則可發(fā)揮腫瘤胞嘧啶替代作用,使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶失活,加強(qiáng)抑癌基因表達(dá),達(dá)到抗腫瘤的目的[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)是葉酸代謝限速酶,催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸,前者參與DNA合成修復(fù),后者則是機(jī)體主要甲基供體,參與DNA甲基化過(guò)程。MTHFR對(duì)于DNA合成、活化、修復(fù)具有重要調(diào)控作用[4]。本研究分析MDS患者療效的影響因素,探討MTHFR基因多態(tài)性與疾病療效的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年2月至2022年6月許昌市中心醫(yī)院收治的82例中高危MDS患者,均接受地西他濱治療。其中男49例,女33例;年齡34～78歲,平均(58.14±9.77)歲;其中難治性貧血(refractory anemia,RA)3例,難治性血細(xì)胞減少伴多系發(fā)育異常(refractory cytopenia with multilineage dysplasia,RCMD)37例,難治性貧血伴原始細(xì)胞增多(refractory anemia with excess blasts,RAEB)1型與2型分別18、24例;IPSS危險(xiǎn)分級(jí)中危1者39例,中危2者19例,高危者24例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]MDS診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)符合IPSS危險(xiǎn)分層中高危診斷;(3)年齡≥18歲;(4)患者和家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他部位惡性腫瘤;(2)合并嚴(yán)重器質(zhì)性疾病;(3)入組前接受過(guò)放化療治療;(4)3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)細(xì)胞毒性類藥物或激素類藥物;(5)合并傳染性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1治療方法

所有患者均接受止吐、護(hù)胃、保肝等常規(guī)支持治療,并接受地西他濱(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20120067)治療,給藥劑量為每日20 mg·m-2,微量泵泵注,1 h泵注完畢,第1～5天不間斷給藥,每28日為1個(gè)周期,持續(xù)治療4個(gè)周期。

1.3.2一般資料收集

收集患者入院時(shí)基礎(chǔ)資料,包括性別、年齡、疾病分型、IPSS危險(xiǎn)分級(jí)、7號(hào)染色體異常、粒細(xì)胞缺乏、貧血情況以及血紅蛋白、血細(xì)胞計(jì)數(shù)水平等。

1.3.3基因多態(tài)性檢測(cè)方法

患者入院后采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法檢測(cè)MTHFR基因位點(diǎn)多態(tài)性。抽取患者靜脈血4 mL,提取樣本基因組(血液基因組提取試劑盒:貝克曼,AMPurea XPDNA),以雙蒸水溶解,檢測(cè)純度,-80 ℃保存,引物合成由蘇州泓迅生物科技有限公司。基因位點(diǎn):rs1801131上游5’-CTGTGCTGTGCTGTTGGAAG -3’,下游5’-ACGATGGGGCAAGTGATG-3’;rs1801133上游5’-TCCTCTTCCCCTGCCTTTG -3’,下游5’-CCACTCCAGCATCACTCACTTT -3’。應(yīng)用Sequenom MassAR-RAY 技術(shù)分型。目的基因擴(kuò)增:取基因組DNA,加入96孔板,取DNA(5 ng )、引物(2.5 pmol)、Taq聚合酶(0.1 U) 、10 mmol·L-1dNTP(0.5 μL)。PCR擴(kuò)增:96 ℃ 15 min,96 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,76 ℃ 45 s,循環(huán)40次,76 ℃ 5 min。SAP反應(yīng):去除剩余dNTP,36 ℃ 40 min,86 ℃ 5 min。單堿基延伸:延伸引物(5.4 pmol)、混合物l dNTP、ddNTP(50 μmol )、DNA聚合酶(0.5 U) ,96 ℃ 2 min,96 ℃ 5 s,56 ℃ 5 s,76 ℃ 5 s,循環(huán)35次,74 ℃ 3 min。樹(shù)脂脫鹽,轉(zhuǎn)移至芯片檢測(cè)。

1.4 療效評(píng)估方法

參照《骨髓增生異常綜合征診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)(2014年版)》[6]評(píng)估療效。(1)完全緩解:骨髓系細(xì)胞成熟正常,原始細(xì)胞≤5%,允許血細(xì)胞異常發(fā)育;外周血血紅蛋白、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、血小板計(jì)數(shù)水平分別在110 g·L-1、1.0×109L-1、100×109L-1及以上,原始細(xì)胞消失。(2)部分緩解:與治療前相比,骨髓原始細(xì)胞減少幅度達(dá)到50%及以上,但仍超過(guò)5%;外周血同完全緩解。(3)骨髓完全緩解:與治療前相比,骨髓原始細(xì)胞減少幅度超過(guò)50%且≤5%;外周血若達(dá)血液學(xué)改善,需予注明。(4)血液學(xué)改善(療效維持8周及以上):與治療前相比紅細(xì)胞的輸注減少,血紅蛋白升高達(dá)15 g·L-1及以上;對(duì)于治療前血小板水平在20×109L-1及以上者,凈增值需達(dá)30×109L-1及以上,治療前水平在20×109L-1以下者,增高達(dá)20×109L-1以上且與治療前相比增高值至少增達(dá)100%。(5)疾病穩(wěn)定:未達(dá)部分緩解標(biāo)準(zhǔn),疾病無(wú)進(jìn)展維持8周以上。(6)治療失敗:治療過(guò)程中疾病出現(xiàn)進(jìn)展甚至死亡。治療有效為完全緩解、骨髓完全緩解、部分緩解、血液學(xué)改善之和。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)[n(%)]表示,組間通過(guò)χ2檢驗(yàn)比較,通過(guò)logistic分析MDS患者療效的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有效組與無(wú)效組一般資料

有效組與無(wú)效組性別、年齡、疾病分型、IPSS危險(xiǎn)分級(jí)、血紅蛋白水平及是否粒細(xì)胞缺乏、重度貧血比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);7號(hào)染色體異常、血小板計(jì)數(shù)≥100×109L-1患者治療有效率高于7號(hào)染色體無(wú)異常、血小板計(jì)數(shù)<100×109L-1患者(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 有效組與無(wú)效組患者M(jìn)THFR基因型以及基因頻率分布

有效組與無(wú)效組MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);有效組MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)CC基因型以及C頻率低于無(wú)效組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 有效組與無(wú)效組MTHFR基因型以及基因頻率分布

2.3 影響療效的危險(xiǎn)因素分析

將上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義項(xiàng)作為自變量并進(jìn)行賦值,7號(hào)染色體異常(否=0,是=1)、血小板計(jì)數(shù)水平(<100×109L-1=0,≥100×109L-1=1)、MTHFR-rs1801131(A/C)(AA或AC型=0,CC型=1)。logistic回歸分析結(jié)果顯示7號(hào)染色體異常、血小板計(jì)數(shù)≥100×109L-1的MDS患者治療有效率更高,MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)CC基因型是療效不佳的危險(xiǎn)基因型,OR=1.508(95% CI:1.111～2.048)。見(jiàn)表3。

表3 影響MDS患者療效的相關(guān)因素分析

3 討論

研究顯示,臨床MDS發(fā)病率達(dá)3/10萬(wàn)～5/10萬(wàn),老年人群中達(dá)20/10萬(wàn)～50/10萬(wàn),是常見(jiàn)的惡性血液病之一,病因尚不十分明確,可能與烷化劑、有機(jī)毒物、放射線暴露等有關(guān)[7]。

作為去甲基化藥物,地西他濱可抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,重新激活抑癌基因,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,促使其向正常細(xì)胞分化,延緩急性白血病轉(zhuǎn)化[8]。腫瘤細(xì)胞內(nèi),地西他濱被磷酸化后與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ結(jié)合,抑制胞嘧啶甲基化,激活沉默的抑癌基因,促進(jìn)造血細(xì)胞分化。在中國(guó)上市后,關(guān)于地西他濱應(yīng)用于MDS中療效的報(bào)道相繼出現(xiàn)。Ma等[9]回顧性分析87例MDS地西他濱治療患者,中位治療4個(gè)療程后,治療有效率達(dá)58.6%;Lee等[10]研究發(fā)現(xiàn)中高危MDS患者經(jīng)地西他濱治療后的總有效率達(dá)62.5%。本研究將地西他濱應(yīng)用于中高危MDS患者的臨床治療中,有效率達(dá)到71.95%,略高于上述研究結(jié)果[10],這可能與納入患者基線資料以及用藥療程等存在差異有關(guān)。IPSS危險(xiǎn)分級(jí)是目前應(yīng)用廣泛的MDS預(yù)后評(píng)估方法,且中低危患者生存期長(zhǎng)于高危患者。Liu等[11]研究中治療有效與無(wú)效的MDS患者IPSS危險(xiǎn)分級(jí)比較無(wú)明顯差異,并認(rèn)為中低危患者并不比高危患者更易得到疾病緩解,而是與反應(yīng)維持時(shí)間有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,IPSS分級(jí)對(duì)患者療效無(wú)顯著影響。7號(hào)染色體異常是MDS預(yù)后不良危險(xiǎn)因素之一,然而研究證實(shí),7號(hào)染色體異常者往往對(duì)于地西他濱治療獲益更大[12]。本研究也顯示7號(hào)染色體異常者可獲得更高的治療有效率,與上述研究結(jié)果[12]一致,這可能是由于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂7q22、7q34-q36區(qū)域含2個(gè)腫瘤抑制基因,并與去甲基化藥物耐藥性有關(guān)。既往研究顯示,血小板反應(yīng)是MDS患者臨床地西他濱反應(yīng)獲得的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)之一[13]。本研究也顯示血小板計(jì)數(shù)大于100×109L-1的患者可獲得更高的治療有效率,與上述研究結(jié)果[13]一致。

MTHFR基因位于1p36.3染色體,具有外顯子11個(gè),可將5,10-亞甲基四氫葉酸還原轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸,在DNA修復(fù)與甲基化中發(fā)揮重要作用。5-亞甲基四氨葉酸可轉(zhuǎn)化為S-腺普甲硫氨酸,S-腺普甲硫氨酸為DNA甲基化甲基來(lái)源。MTHFR基因rs1801131、rs1801133位點(diǎn)為該基因常見(jiàn)突變位點(diǎn)。既往相關(guān)研究顯示MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)突變是直腸癌RO切除術(shù)后輔助化療預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14]。本研究中rs1801131位點(diǎn)CC基因型是MDS患者療效不佳的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一,CC基因型患者療效不佳風(fēng)險(xiǎn)是AA及AC基因型患者的1.508倍,rs1801131位點(diǎn)A向C突變可使丙氨酸替代谷氨酸,CC基因型酶活性僅為AA型的40%,從而引起S-腺普甲硫氨酸與葉酸缺乏,導(dǎo)致DNA甲基化受阻,影響地西他濱藥物利用率。白小紅等[15]研究顯示rs1801133位點(diǎn)的基因多態(tài)性與兒童急性淋巴細(xì)胞白血病臨床療效無(wú)關(guān),但與患者化療相關(guān)不良反應(yīng)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示有效組與無(wú)效組rs1801133位點(diǎn)基因多態(tài)性比較無(wú)明顯差異。本研究不足之處在于未排除種族等混雜因素,研究結(jié)果不能擴(kuò)展到本域外,同時(shí)未對(duì)患者不良反應(yīng)、生存期等資料行進(jìn)一步分析,后續(xù)將擴(kuò)大樣本量作進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

7號(hào)染色體異常、血小板計(jì)數(shù)≥100×109L-1的MDS患者接受地西他濱治療的有效率較高,MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)CC基因型是療效不佳的危險(xiǎn)基因型。