分泌性中耳炎患兒miR-495水平與免疫失衡及炎癥狀態的相關性

閔春芳

(開封市人民醫院 耳鼻喉科,河南 開封 475002)

分泌性中耳炎是一種常見的兒童疾病,以中耳積液為特征[1]。持續的分泌性中耳炎可導致鼓膜和中耳的長期變化,造成一定程度的聽力損失。既往研究表明耳咽管功能障礙、過敏、免疫失衡及細菌感染等因素是引起分泌性中耳炎的主要原因[2-3]。其中,免疫失衡是分泌性中耳炎發病的一個重要因素。T細胞亞群在機體的免疫調節中起重要作用,分泌性中耳炎患兒通常伴有腺樣體肥大,報道顯示腺樣體肥大引起的免疫異常可能在分泌性中耳炎的發病中起著重要作用[4]。miR-495在許多疾病的炎癥反應中起著重要的調節作用,如肺炎[5]、炎癥性腸病[6]和強直性脊柱炎[7]。然而,miR-495在分泌性中耳炎中的研究較少。本研究分析了分泌性中耳炎合并腺樣體肥大患兒及單純腺樣體肥大患兒外周血miR-495水平的差異并進一步探討了血清miR-495失調與免疫失衡及炎癥因子釋放的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年3月至2022年3月在開封市人民醫院收治的分泌性中耳炎合并腺樣體肥大患兒53例為觀察組,選取同期單純腺樣體肥大患兒40例為對照組。觀察組中男35例,女18例;年齡5～16歲,平均(7.22±2.13)歲;病程4～13個月,平均(8.36±2.53)個月。對照組中男26例,女14例;年齡4～16歲,平均(7.16±1.96)歲;病程5～13個月,平均(8.58±2.73)個月。兩組患兒一般資料相比,差異無統計學意義(P>0.05)。所有納入本研究的患兒家屬均簽署知情同意書。本研究已通過醫院醫學倫理委員會審核批準。納入標準:腺樣體肥大經鼻咽部影像學或內鏡檢查確診;分泌性中耳炎患兒的診斷符合《臨床實踐指南:分泌性中耳炎(更新版)》[8]中的診斷標準。排除標準:合并支氣管哮喘或急性呼吸道感染;合并重要器官功能障礙;有精神疾病。

1.2 檢測方法

1.2.1血液樣本收集

于清晨收集患兒5 mL空腹靜脈血,血液樣本用于T淋巴細胞亞群水平的檢測。血液樣本以3 000 r·min-1離心10 min,收集上層血清檢測miR-495水平及炎癥因子水平。

1.2.2血清miR-495水平檢測

采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取血清總RNA,使用MicroRNA 反轉錄試劑盒(Applied Biosystems公司)將RNA反轉錄為cDNA。按照TaqMan Fast PCR Master Mix 試劑盒(Applied Biosystems公司)的說明書配制實時定量聚合酶鏈反應體系對miR-495進行擴增。miR-495的水平以2-ΔΔCT法進行分析,以U6為內參基因。miR-495及U6的引物序列:miR-495上游引物為5’-TCCGATTCTTCACGTGGTAC-3’,miR-495下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’,U6上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,U6下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3血液T淋巴細胞亞群水平檢測

使用免疫熒光法檢測血液T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+及CD8+水平,流式細胞儀購自邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.2.4血清炎癥因子水平檢測

采用酶聯免疫吸附試劑盒(eBioscience公司)檢測血清中白細胞介素(interleukin,IL)-8及IL-1β水平,檢測過程嚴格按照說明書操作。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 血清miR-495在分泌性中耳炎中的診斷價值

觀察組患兒血清miR-495水平(0.75±0.09)低于對照組(1.00±0.10),差異有統計學意義(t=13.240,P<0.001)。ROC曲線結果顯示血清miR-495水平診斷分泌性中耳炎的曲線下面積為0.969(P<0.001),95% CI 0.937～1.000,最佳截斷值為0.872,診斷價值較高。

2.2 血液T淋巴細胞亞群水平

觀察組患兒血清中的CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。

表1 兩組患兒血液T淋巴細胞亞群水平比較

2.3 血清炎癥因子水平

觀察組患兒血清IL-8及IL-1β高于對照組,差異有統計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 兩組患兒血清炎癥因子水平比較

2.4 血清miR-495水平與免疫及炎癥指標水平的相關性分析

經Pearson相關性分析發現觀察組患兒血清miR-495水平與T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平呈負相關(P<0.05),與炎癥因子IL-8及IL-1β水平亦呈負相關(P<0.001)。見表3。

表3 觀察組患兒血清miR-495水平與免疫及炎癥指標水平的相關性分析

3 討論

分泌性中耳炎是一種常見的兒童疾病,病因主要為細菌感染及免疫失衡等,主要以藥物治療(類固醇或抗生素等)和手術治療(鼓室造瘺管或腺樣體切除術)為主[9-10]。有研究顯示,急性分泌性中耳炎患者血液及耳積液中的淋巴細胞數量增加,促炎因子釋放,血清免疫球蛋白表達也失調[11-13]。持續性的分泌性中耳炎會導致聽力損傷及鼓膜改變,因此除了接受有效的治療外,分泌性中耳炎的早期診斷十分關鍵。

miRNAs是長度在19到21個核苷酸之間的非編碼RNA,可調節基因表達,參與機體生理及病理過程。有研究報道miR-495是抑制肺癌細胞增殖的抑癌因子[14]。此外,miR-495可以抑制強直性脊柱炎的炎癥反應[7],并通過抑制炎癥小體信號通路改善心臟微血管內皮細胞的炎癥反應和凋亡[15]。miR-495還能抑制高血糖性心肌成纖維細胞炎癥[16]。以上研究表明miR-495參與炎癥反應的調控,推測miR-495可能參與分泌性中耳炎的進展調控。本研究結果顯示觀察組患兒血清miR-495水平低于對照組,表明miR-495水平下調可能與分泌性中耳炎的發病相關。ROC曲線分析顯示血清miR-495水平診斷分泌性中耳炎的曲線下面積為0.969,表明血清miR-495是分泌性中耳炎較為理想的診斷指標。

CD3+及CD4+是機體的T淋巴細胞、輔助性T淋巴細胞的代表。CD8+是機體的抑制性T淋巴細胞,其通過抑制免疫應答及T細胞增殖與CD4+相互拮抗,維持機體免疫平衡[17]。此外,CD4+/CD8+為評價機體免疫狀態的重要指標,比值上升表示機體免疫增強,比值下降表示機體免疫力下降[18]。本研究發現與對照組患兒相比,觀察組患兒血液中的CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平均升高,說明分泌性中耳炎合并腺樣體肥大患兒存在免疫失衡。分泌性中耳炎的發展伴隨著機體大量炎癥介質的釋放,且隨著病情加重,機體炎癥反應加劇[19]。IL-8及IL-1β可由多種細胞分泌,參與機體的炎癥反應及免疫調節。本研究發現,與對照組相比,觀察組患兒血清中的炎癥因子IL-8及IL-1β均升高,且差異具有統計學意義。

進一步分析了分泌性中耳炎患兒血清miR-495水平失調與免疫失衡及炎癥因子釋放的相關性,Pearson相關性分析發現觀察組患兒血清miR-495水平與T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平呈負相關,與炎癥因子IL-8及IL-1β水平亦呈負相關,表明血清miR-495可能通過調控機體免疫平衡及炎癥反應參與分泌性中耳炎的發病。

4 小結

分泌性中耳炎患兒血清miR-495水平下調,且機體T淋巴細胞亞群及炎癥因子異常表達,血清miR-495可能通過調控機體免疫平衡及炎癥反應參與分泌性中耳炎的發病。血清miR-495對分泌性中耳炎具有較高的診斷價值。miR-495調節機體免疫平衡及炎癥狀態的機制仍需進一步研究。