UPLC-MS/MS法同時測定同仁牛黃清心丸中15個膽汁酸的含量 Δ

陳雪婷，林詩鈴，陳 濤，林逸凡，黃鳴清，鄭燕芳 （福建中醫藥大學藥學院，福州 350122）

同仁牛黃清心丸由人工牛黃、當歸、川芎等27 味中藥制備而成[1]，有清心化痰、鎮驚祛風的功能，常用于治療因風痰阻竅而引起的頭昏眼花、痰涎壅盛、神智錯亂、語言不清以及驚風抽搐。人工牛黃為方中君藥，具有清心肝經熱、涼血解毒開竅的功效[1—2]。目前，尚未見到有關同仁牛黃清心丸的法定質控標準，已發表的文獻僅有采用氣相色譜法測定同仁牛黃清心丸中麝香酮的含量[3]，而能同時測定該藥中多個膽汁酸成分的報道尚未見到。

含牛黃中成藥質量的決定性因素是牛黃及其代用品的質量[4]，而對牛黃中的膽汁酸成分進行定量研究將成為提高含牛黃中成藥質量標準和保障其藥物穩定性的關鍵[5]。膽汁酸的種類、成分復雜，部分成分的分子量、極性相近，甚至是同分異構體，不易分離，且部分膽汁酸含量極低，不易檢測到，這增加了相關分析檢測的難度[6—7]。近年來，超高效液相色譜-串聯質譜（UPLCMS/MS）技術因融合了超高效液相色譜的分離能力和高分辨質譜的鑒定能力而廣泛用于中藥復方成分的分析與鑒定[8]。基于此，本研究建立了一種能同時測定同仁牛黃清心丸中15 個膽汁酸成分含量的UPLC-MS/MS法，并采用該法對15批樣品進行了測定，旨在為該藥的質量評價提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Dionex Uitimate 3000 型超高效液相色譜系統、四極桿串聯靜電場軌道阱質譜儀（配備電噴霧離子源）、Heraeus Fresco 17 型離心機均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Milli-Q Direct 16型超純水制備儀購自德國Merck Millipore公司；CPA225D型十萬分之一電子天平購自德國Sartorius 公司；XM-400UHP 型超聲波清洗儀購自小美超聲儀器（昆山）有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA，批號Y08A9E57765）、3-oxo-7α，12α-hydroxy-5β-cholanoic acid（3-OCA，批號N07GY167164）、牛磺鵝脫氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA，批號Y09S8K43540）、3α-羥基-7-氧代-5β-膽烷酸（3α-hydroxy-7-oxo-5β-cholanic acid，3α-OH-7-OCA，批號N30GB169735）、豬脫氧膽酸（hyodeoxycholic acid，HOCA，批號S27M8I36899）、膽酸（cholic acid，CA，批號T16J8Q28663）、甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA，批號Y29M9K57235）、甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA，批號Y27M9E56969）、鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA，批號Z01011LA14）、脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA，批號S05N6I5476）、脫氫膽酸（dehydrocholic acid，DHCA，批號S30J9I64022，內標）、7 -酮-3α，12α-羥基膽烷酸（7-oxodeoxycholic acid，7-ODCA，批號Z09M10J82521）、牛磺膽酸（taurocholic acid，TCA，批號B15J11J118403）對照品均購自上海源葉生物科技有限公司（純度均大于95%）；12-脫氫膽酸（12-dehydrocholic acid，12-DHCA，批號0000080453）、牛磺脫氧膽酸鈉（taurodeoxycholic acid sodium salt hydrate，TDCA-NA，批號B26J9J53831）對照品均購自美國Sigma-Aldrich公司（純度均大于95%）；豬膽酸（hyocholic acid，HCA，批號A1110816）對照品購自美國Cayman公司（純度不小于98%）。

15 批同仁牛黃清心丸由北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠提供，批號分別為20010460、21010855、21010310、21010095、21010858、21010857、21010189、19010326、21010919、21010312、21011012、21010870、21010859、22010142、22010140（編號依次為S1～S15）；甲醇和甲酸為色譜純或質譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～0.5 min，20%A；0.5～1.5 min，20%A→70%A；1.5～7 min，70%A→61%A；7～8 min，61%A；8～14 min，61%A→80%A；14～15 min，80%A→85%A；15～16 min，85%A→90%A；16～17.5 min，90%A→20%A；17.5～19 min，20%A）；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min；進樣量為2 μL。

2.1.2 質譜條件

采用加熱型電噴霧離子源、負離子監測模式（negative ion mode，Neg）；噴霧電壓為3.0 kV（－）；毛細管溫度為325 ℃；輔助氣溫度為350 ℃；鞘氣流速為45 arb；輔助氣流速為10 arb；吹掃氣體流速為1 arb；質譜測定數據采用平行反應監測（parallel reaction monitoring，PRM）模式。各待測成分及內標的質譜優化參數見表1；PRM圖見圖1。

圖1 同仁牛黃清心丸中15個膽汁酸成分的PRM圖

表1 各待測成分及內標的質譜優化參數

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品母液及內標溶液

精密稱取上述除DHCA 外的15 種對照品各適量，加甲醇超聲（功率100 W，頻率40 kHz，下同）溶解，制成質量濃度均為2 mg/mL的單一對照品母液。分別量取上述各單一對照品母液，用甲醇稀釋，得到TCA、7-ODCA、12-DHCA、GCA、3-OCA、TCDCA、3α-OH-7-OCA、HCA、TDCA-NA、HOCA、CA、GCDCA、GDCA、CDCA、DCA的質量濃度分別為3 997.66、206.44、350.86、2 074.28、92.53、223.69、1 709.53、4 257.16、960.72、1 685.76、5 052.81、96.43、545.48、253.55、465.09 ng/mL的混合對照品母液。

精密稱取DHCA 對照品適量，用甲醇溶解，制成質量濃度為10 μg/mL的內標母液；再取內標母液適量，用甲醇稀釋，得到質量濃度為20 ng/mL的內標溶液。

2.2.2 供試品溶液

取同仁牛黃清心丸適量，剪碎，加入等質量硅藻土，研磨成粉末，過20 目篩。精密稱取該粉末0.10 g，置于容量瓶中，加入10 mL甲醇充分搖勻，稱重，超聲提取30 min后，再次稱重，加甲醇補足失重，以10 000 r/min離心10 min，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，置于1 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到供試品溶液。取供試品溶液適量，按1∶1（V/V）加入內標溶液后進樣分析。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系及定量限、檢測限考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品母液適量，用甲醇逐級稀釋后，按1∶1（V/V）加入內標溶液制成系列質量濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下分析條件進樣測定，并以各對照品的質量濃度為橫坐標（X）、對照品與內標的質量濃度之比為縱坐標（Y）進行線性回歸；再分別以信噪比（S/N）＝3 計算檢測限（limit of detection，LOD），以S/N＝10計算定量限（limit of quantitation，LOQ），結果見表2。

表2 TCA等15個待測成分的線性關系及定量限、檢測限考察結果

2.3.2 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品母液適量，加甲醇分別稀釋2、30、60倍，配制成高、中、低質量濃度的對照品溶液，按“2.1”項下分析條件在同一天連續進樣6次，測定日內精密度；連續測定3 d，測定日間精密度。結果顯示，日內精密度的RSD 為1.59%～4.74%（n均為6），日間精密度的RSD為0.29%～5.49%（n均為3），表明儀器精密度較好。

2.3.3 穩定性試驗

取同一供試品溶液（編號S1），分別于制備后0、2、4、6、8、12、24、48 h按“2.1”項下分析條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，TCA 等15 個待測成分峰面積的RSD 為1.15%～3.21%（n均為8），表明供試品溶液在48 h內穩定性較好。

2.3.4 重復性試驗

取同一批同仁牛黃清心丸（編號S1），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項下分析條件進樣測定，記錄峰面積并以內標法計算15個膽汁酸成分的含量。結果顯示，TCA、7-ODCA、12-DHCA、GCA、3-OCA、TCDCA、3α-OH-7-OCA、HCA、TDCA-NA、HOCA、CA、GCDCA、GDCA、CDCA、DCA 的平均含量分別為356.12、21.78、3.82、144.01、1.83、13.62、41.80、494.18、56.24、151.08、517.84、10.79、39.68、29.50、47.89 μg/g，RSD為0.77%～2.94%（n均為6），表明本方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（編號S1）0.05 g，共9份，分成3組，分別精密加入低、中、高水平（相當于樣品含量的50%、100%、150%）的混合對照品母液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下分析條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，TCA、7-ODCA、12-DHCA、GCA、3-OCA、TCDCA、3α-OH-7-OCA、HCA、TDCA-NA、HOCA、CA、GCDCA、GDCA、CDCA、DCA的平均加樣回收率分別為97.1%～100.1%、102.0%～103.1%、99.1%～104.1%、93.8%～103.0%、96.1%～99.0%、98.2%～103.4%、95.1%～100.3%、98.5%～103.0%、97.7%～105.7%、96.8%～103.2%、97.4%～99.3%、96.7%～101.5%、95.1%～100.5%、97.7%～100.2%、94.6%～103.4%，RSD為0.5%～5.8%（n均為9），表明本方法準確度良好。

2.4 樣品含量測定

分別精密稱取15批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下分析條件進樣測定，記錄峰面積并按內標法計算樣品中15 個膽汁酸成分的含量，每批樣品平行測定3次，結果見表3。

表3 不同批次同仁牛黃清心丸中15個膽汁酸成分的含量測定結果（n＝3，μg/g）

2.5 不同批次同仁牛黃清心丸的化學模式識別分析

為考察同一廠家不同批次同仁牛黃清心丸間的質量差異性，筆者采用SPSS 24.0軟件，以本法測定的15個膽汁酸成分的含量為變量，以平方歐氏距離為測度，對15 批同仁牛黃清心丸進行聚類分析，結果見圖2。由圖2可知，當平方歐氏距離為5時，15批同仁牛黃清心丸可聚為2 類，其中S1～S12 聚為一類，S13～S15 聚為一類，說明該廠家生產的同仁牛黃清心丸在質量上存在差異。

圖2 15批同仁牛黃清心丸的層次聚類圖

筆者又將15批同仁牛黃清心丸中15個膽汁酸成分的含量作為變量，采用主成分分析的方法進行分析。結果顯示，提取出的前2 個主成分累計方差貢獻率達91.740%，表明該模型可以解釋原有變量91.74%的信息；其中主成分1的方差貢獻率為83.072%，主成分2的方差貢獻率為8.668%。此外，由主成分分析的得分圖（圖3）可知，15批同仁牛黃清心丸可被分為2類，其中S13～S15為一類，其他批次為另一類，與聚類分析結果一致。

圖3 15批同仁牛黃清心丸的主成分得分圖

3 討論

3.1 檢測條件的選擇

膽汁酸是一類具有類固醇結構的有機酸，由一個甾環和一個脂肪側鏈共同構成，缺少共軛體系。有研究聯用液相色譜儀與蒸發光散射檢測器檢測膽汁類動物藥中的膽汁酸成分，結果表明，含量較低的膽汁酸成分檢測結果不佳[9]。膽汁酸種類較多且化學結構相似，部分膽汁酸還是同分異構體，檢測不易。因此本研究使用高靈敏和高選擇性的UPLC-MS/MS 技術，采用Hypersil GOLD C18色譜柱，選用Neg 進行多反應監測，并以DHCA為內標，以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動相，所得圖譜峰形對稱、基線平穩、分離度好。

3.2 測定結果分析

本研究采用建立的UPLC-MS/MS法對15批同仁牛黃清心丸中15個膽汁酸成分的含量進行測定，發現總含量最高的是S13 批次，最低的是S2 批次；15 個膽汁酸成分中平均含量最高的是HCA，最低的是3-OCA。不同批次同仁牛黃清心丸中膽汁酸成分的含量存在差異，推測其原因可能是牛黃藥材各批次間質量不穩定，也可能是制劑過程中，由于環境、機器性能等不同因素，導致物料混合不均勻或成分降解，使得不同批次產品中各成分含量存在差異。因此，藥品生產廠家在生產過程中應不僅重視原料的質量控制，還要嚴格把控制劑的生產工藝，確保產品質量的均一性。

結合聚類分析結果可知，15批同仁牛黃清心丸可分為2 類，其中S1～S12 為一類，S13～S15 為另一類，說明不同批次的同仁牛黃清心丸中15 個膽汁酸成分的含量存在一定的差異。主成分分析將膽汁酸成分中的多個變量通過線性轉換選出2個主成分進行分析評價，所得結果與聚類分析結果相似，說明兩種分析方法均能較好地反映出不同批次同仁牛黃清心丸品質間的差異性。由此得出，不同批次同仁牛黃清心丸中膽汁酸含量存在一定的差異，今后可進一步探究其譜效關系，為該藥的質量控制和藥效評價標準提供規律性的科學依據。

綜上所述，本研究建立了同時測定同仁牛黃清心丸中15 個膽汁酸成分含量的UPLC-MS/MS 法，并采用該方法測定了15批樣品的含量，且化學模式識別分析可反映出不同批次同仁牛黃清心丸品質間的差異性。該方法準確、靈敏度高、專屬性強，且測定膽汁酸種類較多，能快速實現對同仁牛黃清心丸中15 個膽汁酸成分的定量分析，適用于該藥的質量控制。