絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的制備及應用

俞林雙,金萬慧,周 穎,楊悅悅,雷彩虹,3,朱海霖,3,陳建勇

(1.浙江理工大學紡織科學與工程學院(國際絲綢學院),杭州 310018; 2.湖北省纖維檢驗局,武漢 430000;3.浙江省現代紡織技術創新中心,浙江紹興 312000)

突發性創傷出血在日常生活中不可避免,大量的失血和傷口感染可能會危及生命,因此開發具有抗菌止血的創傷愈合材料具有重要意義。絲素蛋白是一種從蠶絲中提取的天然高分子蛋白,具有良好的生物相容性和可降解性,同時具有一定的止血能力和抗菌性能[1-2],在生物醫用材料領域得到了很多研究與應用[3-4]。但單一的絲素蛋白材料止血、抗菌性能不足,限制了其在創面敷料中的應用[5]。因此,構建兼具抗菌、止血功能的絲素基敷料成為研究熱點。抗菌劑一般有無機抗菌劑、有機抗菌劑和天然抗菌劑三大種類。無機抗菌劑有Ag、Cu、ZnO等金屬及金屬化合物[6];有機抗菌劑有季銨鹽、鹵胺類等[7]。這兩類抗菌劑雖應用廣泛、抑菌效率高[8],但仍難以避免化學合成中造成的環境問題以及存在危害人體健康的弊端[9],這使得天然抗菌劑在醫藥材料領域成為了更好的選擇[10]。茜草素是采用乙醇為溶劑從茜草的根中提取得到,是天然藥用植物茜草的主要有效成分,屬于蒽醌類化合物,具有止血、抑菌抗炎等作用[11-12],并且對人體副作用小,除了在現代醫療領域中有極其廣泛的應用外,還被廣泛用作天然食用色素和天然染發劑[13]。

靜電紡絲是一種制備功能性纖維膜的高效方法[14],制備的纖維膜具有較好的生物相容性能和可調節的孔隙率,不僅有益于細胞呼吸增殖加速創面愈合,其較大的比表面積又能增加吸水量,能夠有效地提高止血效率[15]。本文以茜草素為止血抗菌劑,以六氟異丙醇為溶劑制備一定質量比的絲素蛋白/茜草素紡絲溶液,再通過靜電紡絲法制備復合纖維膜。分析不同質量比下所得絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的微觀形貌、吸水率、止血性能和抗菌性能,探究茜草素含量對絲素蛋白纖維膜止血抗菌性能的影響。希望能制備出一種具有良好抗菌效果絲素基止血材料,為今后開展絲素基創面敷料的研究奠定基礎。

1 實 驗

1.1 實驗材料和儀器

實驗材料:蠶繭,浙江米賽絲綢有限公司;六氟異丙醇(99.5%),上海晶純生化科技股份有限公司;茜草素,國藥集團化學試劑有限公司;無水碳酸鈣,無水氯化鈣,無水乙醇,氯化鈉,杭州高晶化工有限公司;磷酸鹽緩沖液(pH=7.2～7.4),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;新西蘭兔血,杭州賽洛進生物科技有限公司;營養瓊脂,酵母浸粉,蛋白胨,杭州百思生物技術有限公司;金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC6538),大腸桿菌標準菌株(ATCC 11229),上海魯微科技有限公司;滅菌級醫用紗布敷料,南昌市奧康醫療器械有限公司;去離子水,實驗室自制。

實驗儀器:SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(杭州惠創儀器設備有限公司);真空冷凍干燥機FD-80(北京博醫康實驗儀器有限公司);凱特TG18G臺式高速離心機(上海晚成醫療器械有限公司);HJ-4A磁力攪拌器(上海路晨科學儀器有限公司);JDF05型靜電紡絲機(長沙納儀儀器科技有限公司);GI54DWS高壓滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司);DNP-9082電熱恒溫培養箱,恒溫振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司);SW-CJ-1D(實用型)單人單面垂直凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)。

1.2 絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的制備

絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的制備步驟包括絲素蛋白的制備、紡絲液的制備和絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的制備,實驗流程圖如圖1所示。

圖1 實驗流程Fig.1 Experimental procedure

1.2.1 絲素蛋白的制備

蠶繭在98 ℃的2%的碳酸鈉溶液中脫膠,脫膠時間3 h。脫膠后用去離子水沖洗蠶絲至無粘膩感。將蠶絲60 ℃烘干,再按質量比1∶50的浴比在98 ℃的三元溶液CaCl2/CH3CH2OH/H2O(物質的量比 1∶2∶8)中溶解3 h,室溫冷卻后置于離心機中以1200 r/min的速度離心,15 min后取上清液抽濾后倒入透析袋中在去離子水中透析3 d,每隔12 h更換一次去離子水。-80 ℃冷凍干燥3 d,獲得純絲素蛋白。

1.2.2 紡絲液的制備

以六氟異丙醇為溶劑,配制成質量分數為12%的絲素蛋白溶液,再根據絲素蛋白/茜草素的質量比(60∶1、30∶1、15∶1、10∶1),加入相應質量的茜草素配制出不同質量比的絲素蛋白/茜草素混合紡絲液。

1.2.3 絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的制備

將制得的紡絲液裝入10 mL的一次性注射器內,安裝上內徑為18 G規格的不銹鋼點膠針頭的噴射口,固定在注射泵上,采用硅油紙收集復合纖維膜,以便更好分離復合纖維膜與接收輥。實驗中,注射泵推進的速度為0.5 mL/h,針頭到滾軸的距離為10 cm,電壓箱設置參數15 kV,時間2 h。并對制得的纖維膜采用75%乙醇浸泡1 h,常溫自然干燥后得到絲素蛋白/茜草素復合纖維膜。將純絲素蛋白纖維膜樣品記為SF,不同質量比絲素蛋白/茜草素復合纖維膜樣品(60∶1、30∶1、15∶1、10∶1)分別記為SF-A1、SF-A2、SF-A3、SF-A4。

1.3 絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的性能測試

1.3.1 表面形貌測試

用 JSM-5610LV 型場發射掃描電鏡(JEOL,日本)對鍍金處理后的復合纖維膜樣品進行表面形貌的觀測。通過 Image-Pro Plus 6.0 軟件對電鏡照片進行分析,隨機選取100根纖維進行測量并計算平均直徑及方差。

1.3.2 化學結構測試

用 Nicolet is50 型傅里葉變換紅外光譜儀(ATR-FTIR)測定不同復合纖維膜樣品的紅外光譜,500～4000 cm-1。

1.3.3 吸水率測試

用稱重法測量復合纖維膜的吸水率[16]。將樣品裁切成邊長3 cm的方形并記重。將樣品置于 10 mL 的PBS(pH=7.2～7.4)中,并室溫放置24 h后,移除樣品表面多余的水并記重。以止血紗布為對照,測量3次取平均值。由式(1)計算吸水率。

(1)

式中:A為吸水率,%;Wd為復合纖維膜干燥時的重量,g;WW為復合纖維膜吸水后的重量,g。

1.3.4 體外凝血指數測試

(2)

式中:BCI為體外凝血指數,%;A1為各組樣品測得的紫外吸光度;A0為陰性對照組的紫外吸光度。

1.3.5 抗菌性能測試

用平皿擴散法[18]和平板計數法[19]測定復合纖維膜的抗菌性能,試驗方法參照 GB/T 20944.1—2007《紡織品 抗菌性能的評價 第1部分:瓊脂平皿擴散法》和 GB/T 20944.3—2008 《紡織品 抗菌性能的評價 第三部分:振蕩法》,測試菌種選用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。樣品的抗菌性能以抑菌圈直徑和抑菌率表征。

抑菌圈:將液態無菌瓊脂培養基倒入培養皿中,待其冷卻固化后,取適量菌液在平板上均勻地涂板,并將復合纖維膜制成直徑6 mm的圓形試樣,將其分別置于培養皿的中間位置,37 ℃恒溫密封培養。24 h后,用游標卡尺測定抑菌圈直徑的大小,每組進行3次測量。

抑菌率:將50 mg的樣品置于已培養的菌懸液中,振蕩菌懸液使細菌均勻分布。24 h以后進行稀釋,再移取10 μL菌液涂平板并密封。將平板倒置于37 ℃恒溫箱中,24 h后計數平板上的菌落數。每組進行3次測量。由式(3)計算抑菌率。

(3)

式中:R為抑菌率,%;Nm為各組樣品平板上的菌落數,個;N0為未放樣的空白對照平板上的菌落數,個。

2 結果與分析

2.1 表面形貌表征

不同質量比的絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的形貌特征如圖2所示。從圖2中可以看出,與未浸泡乙醇的純絲素纖維膜SF(圖2(a))相比,浸泡后的純絲素蛋白纖維膜SF(圖2(b))呈致密網狀結構,從圖2(c)—(f)可以看出,絲素蛋白/茜草素復合纖維膜中的纖維均呈光滑致密、無串珠網狀結構。與純絲素蛋白纖維膜SF(0.61±0.22) μm相比,SF-A1、SF-A2、SF-A3、SF-A4的平均直徑分別為(0.63±0.20)、(0.60±0.21)、(0.61±0.19)、(0.63±0.18) μm,說明加入茜草素后復合纖維膜的纖維直徑沒有明顯的變化。但當絲素蛋白與茜草素質量比為15∶1時,纖維網中出現明顯的纖維斷裂,復合纖維膜的機械性能降低。

圖2 絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的SEM照片Fig.2 SEM photos of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.2 化學結構分析

不同質量比的絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的紅外光譜測試結果如圖3所示。從圖3中可以看出,復合纖維膜在1625 cm-1處左右對應絲素蛋白酰胺I的吸收峰,呈現出典型的β折疊結構,這種構造使得復合纖維膜在水中不溶解[20]。與純絲素蛋白纖維膜SF相比,復合纖維膜在1380、1100、930 cm-1處出現新的特征吸收峰,對應的可能是茜草素苯環上的碳氫鍵的面外彎曲振動、C—H面內彎曲振動和C—H面外彎曲振動。此外,隨著茜草素含量增加,復合纖維膜在3280 cm-1處的O—H和N—H基團重疊的伸縮振動峰的強度減弱。以上峰值變化說明絲素膜中存在茜草素(1,2-二羥基-9,10-蒽二酮)[21],且沒有新物質產生。

圖3 絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的紅外譜圖Fig.3 FTIR spectra of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.3 吸水率分析

圖4 絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的吸水率Fig.4 Water absorption of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.4 體外凝血指數分析

不同質量比的絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的體外凝血指數(BCI)測試結果如圖5所示。從圖5(a)中可以看出,復合纖維膜可以吸收血液使其凝固成血凝塊并沉降在離心管的底部,隨著茜草素含量的增加,上清液的顏色逐漸變淡,表明復合纖維膜吸收血液使其凝固的能力增強。從圖5(b)可以看出,與止血紗布對照樣的BCI值(80.01±1.38)%相比,SF(70.95±0.49)%、SF-A1(54.27±0.74)%、SF-A2(42.27±0.38)%、SF-A3(31.15±0.60)%和SF-A4(22.74±0.74)%的BCI值逐步減少,數據差異具有統計學意義(P<0.05),表明制得的復合纖維膜的體外促凝血能力均優于止血紗布。其中SF-A4能夠在很短的時間內使血液凝固,表現了極好的凝血能力。這歸因于茜草素可以縮短凝血酶原轉化為凝血酶的時間,使血液凝固時間縮短,有效提高止血效果[24]。同時復合纖維膜具有較高的吸水率(圖4),與血液接觸時能夠快速吸收水分子加速血液凝固,因此SF-A4復合纖維膜有較低的體外凝血指數,止血作用明顯增強。

圖5 絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的體外凝血性能Fig.5 In vitro coagulation activity of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.5 抗菌性能分析

不同質量比的絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的抑菌圈測試結果如圖6所示。平皿擴散法是衡量抑菌效果的定性方法[18]。從圖6中可以看出,純絲素蛋白纖維膜SF對金黃色葡萄球菌(6.81±0.31)mm和大腸桿菌(6.43±0.22) mm都僅具有輕微的抗菌性能。SF-A1、SF-A2、SF-A3和SF-A4對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別是(7.90±0.01)、(9.27±0.04)、(10.57±0.01)、(12.23±0.01) mm;SF-A1、SF-A2、SF-A3和SF-A4對大腸桿菌的抑菌圈直徑分別是(7.53±0.01)、(8.73±0.04)、(9.30±0.04)、(11.47±0.09) mm,數據差異具有統計學意義(P<0.05)。由此可知,在相同的實驗條件下,復合纖維膜對金黃色葡萄球菌的抑制效果優于大腸桿菌,而且隨著茜草素含量的增加,復合纖維膜的抗菌性越好。茜草素具有一定的抗菌效果,其抑菌機制主要是通過抑制細菌的細胞壁合成、抑制細菌蛋白質合成等方式來阻止細菌的生長和繁衍[24]。

圖6 絲素蛋白/茜草素復合纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈大小Fig.6 Inhibitory zone size of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane against S.aureus and E.coli

不同質量比的絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的抑菌率測試結果如圖7所示。平板計數法是一種定量判斷材料抗菌率的方法[19]。從圖7(a)—(b)可以看出,與空白對照相比,純絲素蛋白纖維膜SF的瓊脂平板上菌落數量減少但仍能觀察到大量菌落,說明純絲素蛋白纖維膜SF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有一定的抑制作用但效果并不明顯。隨著茜草素含量的增加,SF-A1、SF-A2、SF-A3、SF-A4瓊脂平板上生長的菌落數量逐漸減少,表明復合纖維膜抗菌性能與茜草素的含量呈正相關。其中在復合纖維膜SF-A4的瓊脂平板上僅觀察到少量菌落,抑制了大部分菌落的形成,對金黃色葡萄球菌(98.03±0.28)%和大腸桿菌(92.02±1.03)%均有很強的抑制作用。但當絲素蛋白/茜草素質量比超過15∶1時復合纖維膜的機械性能變差,纖維出現斷裂(圖2),因此綜合茜草素用量、凝血效果和抗菌性,本文實驗沒有進一步制備更高質量比的絲素蛋白/茜草素復合纖維膜。

圖7 絲素蛋白/茜草素復合纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌性能Fig.7 Bacteriostatic performance of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane against S.aureus and E.coli

3 結 論

本文以茜草素為止血抗菌劑,通過靜電紡絲法制備了絲素蛋白/茜草素復合纖維膜,并探討分析了不同質量比條件下得到的絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的微觀形貌、吸水率、止血性能、抑菌性能。得到的主要結論如下:

a)絲素蛋白/茜草素復合纖維膜止血性能實驗表明,采用靜電紡絲制得的復合纖維膜具有較高的吸水率,有利于快速吸收水分子加速血液凝固,不同質量比絲素蛋白/茜草素復合纖維膜的體外促凝血能力均優于止血紗布。其體外凝血指數較小,體外凝血時間較短,止血性能優于止血紗布。

b)絲素蛋白/茜草素復合纖維膜抗菌性能與茜草素的含量成正相關,當絲素蛋白與茜草素的質量比為10∶1時,絲素蛋白/茜草素復合纖維膜具有較好的抗菌性能,對大腸桿菌的抑菌率為(92.02±1.03)%,對金黃色葡萄球菌的抑菌率為(98.03±0.28)%。