纖連蛋白Ⅲ型結構域蛋白5對HepG2肝癌細胞體外轉移活性的影響及其機制

袁慶功 張焱 李軍輝 楊文彬

肝癌發生過程包含了遺傳/表觀遺傳改變以及細胞分子路徑的失調,Wnt/β-catenin途徑在肝癌中通常上調,與維持腫瘤起始細胞、耐藥性、腫瘤進展和轉移密切相關[1,2]。因此,開發針對Wnt/β-catenin途徑的選擇性藥物對于肝細胞癌治療具有重要意義。纖連蛋白Ⅲ型結構域蛋白5(fibronectin type III domain containing 5, FNDC5)一種脂肪因子,最初在骨骼肌和脂肪組織中發現,在代謝紊亂、宮頸癌、子宮內膜癌、癌癥惡病質和妊娠前期糖尿病患者中表達降低[3]。本研究探索FNDC5在肝細胞癌發展中的作用機制,以期為肝細胞癌的治療提供思路。

材料與方法

一、材料與儀器

肝癌細胞系HepG2細胞(上海中國科學院細胞資源中心);重組人FNDC5蛋白(英國Abcam公司);RPMI-1640培養基(北京依諾凱公司);RIPA裂解液(武漢卡諾斯公司);Annexin V/PI試劑盒(北京普利萊公司);青霉素-鏈霉素雙抗(上海萊爾公司);BCA試劑盒(美國Applied Biosystems公司);結晶紫指示劑、Matrigel(南京Vazyme公司)。Anti-β-actin(武漢Proteintech Group公司);anti-C-myc(英國Abcam公司);Cyclin-D1(美國Santa cruz公司)。細胞培養箱(美國賽默飛公司);酶標儀(中國普朗公司);熒光顯微鏡(中國復享光學公司);凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司);流式細胞儀(深圳邁瑞公司)。

二、方法

(一)細胞培養 在37 ℃、體積分數為0.05的CO2環境中,RPMI 1640培養基(10%胎牛血清)培養,同時加入雙抗(青霉素-鏈霉素)混合溶液,然后收集生長狀態良好的細胞并將細胞分為4組,分別用0、5、10、20 μmol的重組人FNDC5蛋白處理HepG2細胞12 h。

(二)噻唑藍檢測細胞活力 將細胞培養在96孔板中,每孔3×103個細胞,培養12 h,使用0、5、10、20 μmol的重組人FNDC5蛋白培養,加入20 mL MTT液(5.0 mg/mL),37 ℃培養4 h,用100 mL二甲基亞砜溶解紫色晶體,Mitras2LB943多功能酶標儀分別在于0、12、24、48 h檢測各組細胞的吸光度(490 nm),統計細胞存活率。

(三)細胞劃痕實驗分析細胞遷移能力 在6孔板培養細胞,加入重組人FNDC5蛋白,將100 μL的槍頭在細胞中劃痕,使劃痕的大小一致。對該線進行拍照、標記,并在37℃下培養24 h。PBS清洗3次細胞,顯微鏡下觀察統計遷移細胞數。

(四)Transwell實驗分析細胞侵襲能力 將1×105個細胞添加到涂有Matrigel的上腔中。同時把10% FBS 500 μL RPMI 1640培養液加入到下室。隔夜孵化后,除去未貼壁的多余細胞。4%多聚甲醛固定,通過結晶紫對細胞進行染色。顯微鏡對五個任意挑選的區域內的細胞數量進行計數。

(五)流式細胞術分析細胞凋亡率 將細胞離心并用預冷75%乙醇再次懸浮。450 μL PBS補充50 μL碘化丙(0.5 mg/mL)重新懸浮細胞, 37 ℃培養30 min。5 μL Annexin-V-異硫氰酸熒光素孵育細胞。流式細胞儀檢測凋亡細胞。

(六)集落形成實驗分析細胞生長能力 HepG2細胞接種到6孔板,1×102個細胞/孔,在培養箱中繼續放置14 d,4%多聚甲醛固定,PBS清洗后,加入結晶紫對細胞進行染色,顯微鏡下計數細胞集落數。

(七)蛋白免疫印跡分析Wnt/β-catenin通路蛋白的影響 在4℃環境下將RIPA裂解液加入培養皿裂解細胞,離心收集總蛋白。BCA試劑盒計算各組總蛋白質的濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白,截取含目的蛋白的凝膠電轉到PVDF膜。在室溫環境中,用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1.5 h。與對應的一級抗體4 ℃過夜。次日用辣根過氧化物酶結合的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG抗體將PVDF膜孵育1 h。用增強化學發光試劑盒使蛋白顯影,Image Lab軟件計算灰度值。

三、統計學分析

結 果

一、FNDC5對HepG2細胞生長的作用

MTT實驗結果表明,經0、5、10和20 μmol的FNDC5處理的HepG2細胞,其存活率分別為92.86±0.32、79.32±0.17、50.11±0.56和29.29±0.96,差異有統計學意義(F=23.897,P=0.003)。在20 μmol的FNDC5濃度下,處理0、12、24和48 h后,HepG2細胞的存活率分別為95.66±0.72、32.56±0.93、22.17±0.29和13.66±0.91,差異有統計學意義(F=25.321,P=0.001)。

二、不同濃度FNDC5對HepG2細胞侵襲與遷移能力的作用

見表1。劃痕結果顯示,各個濃度的重組FNDC5蛋白能夠抑制HepG2細胞遷移,同時隨著重組FNDC5蛋白的濃度升高,其抑制效果也逐漸加強,見圖1A。此外,Transwell的結果顯示,各個濃度的重組FNDC5蛋白能夠抑制HepG2細胞侵襲,同時隨著重組FNDC5蛋白濃度加大,抑制作用加強,見圖1B。

A為劃痕實驗結果;B為細胞侵襲實驗結果。

表1 不同濃度FNDC5對HepG2細胞遷移和侵襲的影響(±s)

三、不同濃度FNDC5對HepG2凋亡的影響

流式細胞術分析發現,不同濃度重組FNDC5蛋白能夠促進HepG2細胞的凋亡發生。同時重組FNDC5蛋白濃度升高,HepG2細胞的凋亡比例也伴隨增加,見圖2。

圖2 不同濃度FNDC5對HepG2凋亡的影響

四、不同濃度FNDC5對HepG2細胞集落形成的影響

細胞集落形成實驗發現,不同濃度重組FNDC5蛋白能夠抑制HepG2細胞的集落形成,同時重組FNDC5蛋白濃度升高后,HepG2細胞的集落數量也隨之減少,見圖3,表2。

圖3 濃度FNDC5對HepG2細胞集落形成的影響

表2 不同濃度FNDC5對HepG2細胞集落形成和凋亡的影響(±s)

五、不同濃度重組FNDC5蛋白對Wnt/β-catenin通路的作用

Western blotting實驗發現,不同濃度FNDC5對Wnt/β-catenin通路具有抑制作用,且隨著FNDC5濃度增加,β-catenin、C-myc和Cyclin-D1蛋白表達逐漸降低,見圖4,表3。

圖4 不同濃度FNDC5對Wnt/β-catenin通路的影響

表3 不同濃度FNDC5對Wnt/β-catenin通路的影響(±s)

討 論

肝癌患者的預后主要取決于術后復發和殘留肝實質浸潤性轉移的發生率,侵襲和轉移是肝癌的基本特征[4-6]。研究發現,肝癌患者肝組織中FNDC5的異常表達與癌癥相關[7]。然而,FNDC5過度表達對HepG2細胞生長和轉移的影響因素尚不清楚。FNDC5除了與肝細胞癌密切相關之外,也能夠減弱MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞的生長活性和轉移能力[8,9]。然而,在子宮內膜癌、結腸癌、甲狀腺癌和食管癌,細胞體外與對照樣品中的發現相比,FNDC5對細胞增殖、粘附或集落形成沒有影響[10]。本研究的結果表明,不同濃度FNDC5可抑制肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲和集落形成,并促進肝癌細胞凋亡;除此之外,發現FNDC5的作用與Wnt/β-catenin通路相關,不同濃度FNDC5能夠抑制Wnt/β-catenin通路中β-catenin、C-myc和Cyclin-D1蛋白的表達。

研究表明,Wnt/β-catenin通路參與多種癌癥的發展,包括膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌和肝癌[11]。Wnt/β-catenin還能夠影響下游其他蛋白的活性,包括mTOR、NF-κB、P70S6K和Bax,以調節細胞增殖和遷移[12]。降低Wnt/β-catenin通路相關蛋白的表達水平有利于阻止HCC細胞增殖和侵襲,但是上調Wnt/β-catenin通路后可以促進HCC細胞生長活性、侵襲、克隆形成和腫瘤形成[13]。體外研究發現,β-catenin在肝癌組織和肝癌細胞中的表達增加,在肝癌的發展和進展中至關重要[14]。本研究證明,FNDC5顯著降低HepG2細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的活性。采用FNDC5處理HepG2細胞后,β-catenin、C-myc和Cyclin-D1蛋白的表達水平下降,細胞增殖、遷移和侵襲也下降,凋亡增加,表明Wnt/β-catenin通路參與了FNDC5對HepG2細胞增殖、遷移和侵襲抑制過程。

綜上所述, FNDC5可以抑制肝癌細胞的生長活性、遷移、侵襲和集落形成,并促進肝癌細胞凋亡;進一步證明了FNDC5能夠下調Wnt/β-catenin通路的活性,進而抑制肝癌的惡性發展。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。