大孔吸附樹脂分離純化白子菜總黃酮工藝優(yōu)化

于 鳳，許凱歌，許秋雙，李天祥

（天津中醫(yī)藥大學，天津 301617）

白子菜為菊科菊三七屬植物，2010 年被批準為新食品原料，全草入藥［1-2］，具有降尿酸［3］、抗痛風［4］、治療2 型糖尿?。?-7］、胰島素抵抗［8-9］、治療脂肪肝［10-11］、增強胃腸蠕動［12］等功效，并且活性成分豐富，包括黃酮、生物堿、酚酸［13］。課題組前期發(fā)現(xiàn)，白子菜黃酮有著顯著的降低血尿酸作用。

黃酮分離純化方法諸多，以大孔吸附樹脂為主［14］，它作為一種綠色環(huán)保材料在中藥材、中藥制劑方面應用廣泛［15-20］，但目前尚未涉及白子菜總黃酮。因此，本實驗考察了HPD600、AB-8、ADS-7、D101、DM301 型大孔吸附樹脂對白子菜總黃酮的吸附性能，并優(yōu)化該成分分離純化工藝，以期為其藥理活性研究及相關制劑開發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 HNY-200F 型恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津市歐諾儀器儀表有限公司）；UV-6100 PCS 型紫外分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；DT5-1型低速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；R-1001N 型旋轉蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑與藥物 蘆丁對照品（批號1009H022，純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）。ZTC1+1Ⅱ型天然澄清劑（A、B 組分，武漢振天成科技有限公司）。HPD600、AB-8、ADS-7、D101、DM301型大孔吸附樹脂（北京索萊寶科技有限公司）。硫酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉為分析純；無水乙醇為分析純（天津市富宇精細化工有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3 藥材 白子菜于2020 年9 月采自天津種質資源圃，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學李天祥教授鑒定為菊科植物白子菜Gynuradivaricate（L.） DC.。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品3.140 2 mg，置于25 mL 棕色量瓶中，60%乙醇溶解，即得（該成分質量濃度為0.125 6 mg／mL），精密吸取0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL 量瓶中，60%乙醇定容，制成系列質量濃度。

2.1.2 線性關系考察 精密吸取不同質量濃度對照品溶液各0.5 mL，置于10 mL 量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.4 mL，搖勻，靜置5 min，加入10%Al （NO3）3溶液0.4 mL，搖勻，靜置5 min，加入4%NaOH 溶液5 mL，搖勻，靜置5 min，以相應試劑為空白，在510 nm 波長處測定吸光度。以對照品質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝0.012 1X+0.002 6 （r＝0.999 8），在12.56～251.2 μg／mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.3 上樣液制備 稱取白子菜粉末300 g，20倍量60%乙醇浸泡30 min，回流提取1 h，共2 次，濾過，合并濾液，回收溶劑，制備0.2 g／mL 醇提液，置于50 ℃水浴鍋中，緩慢加入4%B 組分（含ZTC1+1 Ⅱ型天然澄清劑） 并不斷攪拌，水浴30 min，加入2%A 組分水浴20 min，每隔5 min 攪拌20 s，室溫靜置2 h，3 000 r／min 離心5 min，取上清液，即得。

2.1.4 測定方法 精密吸取0.5 mL 上樣液，按“2.1.2” 項下方法測定3 次吸光度，取平均值，代入方程，計算總黃酮含量。

2.2 樹脂預處理 取HPD600、AB-8、ADS-7、D101、DM301 型樹脂適量，裝柱（2 cm×30 cm），8 BV 2%NaOH 溶液以4 BV／h 體積流量沖洗2 h，蒸餾水沖洗至流出液呈中性，60 ℃水浴加熱5 min，95%乙醇浸泡30 min，以3 BV／h 體積流量沖洗4 BV，2%HCl 浸泡30 min，以3 BV／h 體積流量沖洗4 BV，蒸餾水沖洗至流出液呈中性。

2.3 大孔吸附樹脂篩選

2.3.1 靜態(tài)吸附性能 稱取預處理后抽濾至干的5 種樹脂各1.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入0.2 g／mL 上樣液20 mL，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱（25 ℃、100 r／min） 中振蕩3 h，濾過，取續(xù)濾液，測定吸附率，公式為吸附率＝［（C1-C2）／V1］ ×100%，其中C1為吸附前總黃酮質量濃度，C2為吸附后總黃酮質量濃度，V1為上樣液體積。棄去上清液后，加入55%乙醇20 mL，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩3 h，取上清液，計算解吸率，公式為解吸率＝｛C3V2／［（C1-C2） ×V1］ ｝ ×100%，其中C3為解吸后總黃酮質量濃度，V2為解吸后溶液體積，結果見表1。由此可知，AB-8 型樹脂吸附能力最強，HPD600 型樹脂解吸能力最強。

表1 總黃酮在不同樹脂上的靜態(tài)吸附能力（±s，n＝3）Tab．1 Static adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

表1 總黃酮在不同樹脂上的靜態(tài)吸附能力（±s，n＝3）Tab．1 Static adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

型號吸附率／%解吸率／%DM-30182.08±0.2287.11±0.23 D10180.25±0.3687.41±0.29 ADS-780.81±0.1686.14±0.30 AB-884.75±0.2688.30±0.38 HPD60081.06±0.3090.72±0.09

2.3.2 動態(tài)吸附性能 稱取預處理后抽濾至干的5 種樹脂各3.0 g，裝柱（1 cm×50 cm），40 mL 0.2 g／mL 上樣液以3 BV／h 體積流量上樣，收集流出液，4 BV 55% 乙醇洗脫，保持體積流量不變，收集洗脫液，計算吸附率、解吸率，結果見表2。由此可知，AB-8 型樹脂吸附能力最強，HPD600型樹脂解吸能力最強。

表2 總黃酮在不同樹脂上的動態(tài)吸附能力（±s，n＝3）Tab．2 Dynamic adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

表2 總黃酮在不同樹脂上的動態(tài)吸附能力（±s，n＝3）Tab．2 Dynamic adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

型號吸附率／%解吸率／%DM-30172.46±0.6790.27±0.24 D10171.09±0.2187.44±0.48 ADS-772.15±0.2490.47±0.42 AB-878.28±0.4589.12±0.25 HPD60074.20±0.4391.45±0.44

2.3.3 混合樹脂吸附性能 分別按1 ∶0、2 ∶1、3 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 3、1 ∶ 2、0 ∶ 1 比例稱取HPD600、AB-8 型樹脂共3.0 g，混勻后裝柱，40 mL 0.2 g／mL 上樣液以4 BV／h 體積流量上樣，收集流出液，計算吸附率，20 mL 55% 乙醇以4 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計算解吸率，結果見表3。由此可知，兩者比例為3 ∶2 時吸附性能最佳。

表3 不同比例混合樹脂吸附性能（±s，n＝3）Tab．3 Adsorption capacities of mixed resins with different ratios （±s，n＝3）

表3 不同比例混合樹脂吸附性能（±s，n＝3）Tab．3 Adsorption capacities of mixed resins with different ratios （±s，n＝3）

HPD600、AB-8 型樹脂比例吸附率／%解吸率／%1 ∶083.14±0.0983.96±0.05 1 ∶185.98±0.0889.10±0.05 2 ∶183.88±0.0587.67±0.06 3 ∶286.71±0.0589.94±0.07 2 ∶385.05±0.0988.43±0.01 1 ∶284.88±0.0285.66±0.02 0 ∶184.16±0.0183.43±0.06

2.4 混合樹脂吸附研究

2.4.1 生藥量與混合樹脂干重比例 稱取HPD600 型樹脂1.8 g、AB-8 型樹脂1.2 g，共5份，混勻后裝柱，設定生藥量與混合樹脂干重比例分別為1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1，分別量取0.2 g／mL 上樣液7.5、15、30、45、60 mL，以4 BV／h 體積流量上樣，收集流出液，計算總黃酮吸附率，結果見表4。由此可知，兩者比例大于3 ∶1時吸附率迅速降低，表明吸附已飽和。

表4 生藥量與混合樹脂干重比例對總黃酮吸附率的影響（±s，n＝3）Tab．4 Effect of crude drug dosage-mixed resin dry weight ratio on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表4 生藥量與混合樹脂干重比例對總黃酮吸附率的影響（±s，n＝3）Tab．4 Effect of crude drug dosage-mixed resin dry weight ratio on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

生藥量與混合樹脂干重比例吸附率／%1 ∶291.78±0.07 1 ∶191.68±0.06 2 ∶191.31±0.08 3 ∶189.92±0.09 4 ∶179.81±0.07

2.4.2 上樣液質量濃度 稱取HPD600 型樹脂1.8 g、AB-8 型樹脂1.2 g，共5 份，混勻后裝柱，按“2.1.3” 項下方法制備上樣液，取質量濃度為1.2 g／mL 者7.5 mL，蒸餾水依次稀釋至0.075、0.15、0.3、0.6、1.2 g／mL，以4 BV／h 體積流量上樣，收集流出液，計算總黃酮吸附率，結果見表5。由此可知，上樣液質量濃度為0.3 g／mL 時藥液流動性、混合樹脂吸附性能較好，并且可避免藥液浪費。

表5 上樣液質量濃度對總黃酮吸附率的影響（±s，n＝3）Tab．5 Effect of sample solution concentration on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表5 上樣液質量濃度對總黃酮吸附率的影響（±s，n＝3）Tab．5 Effect of sample solution concentration on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

上樣液質量濃度／（g·mL-1）吸附率／%0.07576.24±0.09 0.1581.64±0.04 0.385.82±0.04 0.687.02±0.07 1.287.97±0.04

2.4.3 上樣體積流量 按“2.4.2” 項下方法裝柱，取0.3 g／mL 上樣液30 mL，分別以1、2、3、4、5 BV／h 體積流量上樣，收集流出液，計算總黃酮吸附率，結果見圖1。由此可知，體積流量為1、2 BV／h 時該成分吸附率較大，為了節(jié)省時間，最終確定為2 BV／h。

圖1 上樣體積流量對總黃酮吸附率的影響Fig．1 Effect of sample volumetric flow rate on adsorption rate of total flavonoids

2.5 混合樹脂解吸研究

2.5.1 雜質洗脫液體積流量 按“2.4.3” 項下方法裝柱、上樣、收集流出液后，6 BV 蒸餾水分別以3、4、5、6、7、8 BV／h 體積流量除雜，6 BV 55%乙醇以4 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計算總黃酮轉移率，公式為轉移率＝（Z2／Z1） ×100%，其中Z1為上樣液中總黃酮含量，Z2為解吸液中總黃酮含量，結果見表6。由此可知，隨著洗脫液體積流量增加，流出液顏色逐漸加深渾濁，為了提高解吸后溶液中總黃酮純度并節(jié)約時間，最終確定為5 BV／h。

表6 雜質洗脫液體積流量對總黃酮轉移率的影響（±s，n＝3）Tab．6 Effect of impurity eluent volumetric flow rate on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表6 雜質洗脫液體積流量對總黃酮轉移率的影響（±s，n＝3）Tab．6 Effect of impurity eluent volumetric flow rate on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

雜質洗脫液體積流量／（BV·h-1）轉移率／%3 87.97±0.08 87.71±0.06 5 87.42±0.06 6 84.27±0.08 7 82.04±0.08 8 81.45±0.09 4

2.5.2 雜質洗脫液用量 按“2.5.1” 項下方法裝柱、上樣、收集流出液，分別用2、4、6、8、10、12 BV 蒸餾水以5 BV／h 體積流量除雜，6 BV 55%乙醇以4 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計算總黃酮轉移率，結果見表7。由此可知，洗脫液用量為8 BV 時流出液幾乎無色澄清，表明樹脂柱中雜質沖洗較完全。

表7 雜質洗脫液用量對總黃酮轉移率的影響（±s，n＝3）Tab．7 Effect of impurity eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表7 雜質洗脫液用量對總黃酮轉移率的影響（±s，n＝3）Tab．7 Effect of impurity eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

雜質洗脫液用量／BV轉移率／%2 85.94±0.07 85.48±0.09 6 84.64±0.07 8 84.53±0.09 1083.86±0.09 1283.72±0.09 4

2.5.3 洗脫劑體積分數(shù) 按“2.5.1” 項下方法裝柱、上樣，8 BV 蒸餾水以5 BV／h 體積流量除雜，分別用6 BV 10%、25%、40%、55%、70%、85%乙醇以4 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計算轉移率，結果見圖2。由此可知，體積分數(shù)為70%時轉移率顯著升高，并且可節(jié)約試劑。

圖2 洗脫劑體積分數(shù)對總黃酮轉移率的影響Fig．2 Effect of eluent concentration on transfer rate of total flavonoids

2.5.4 洗脫劑體積流量 按“2.5.3” 項下方法裝柱、上樣、除雜，6 BV 70% 乙醇分別以1、2、3、4、5、6 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計算轉移率，結果見圖3。由此可知，體積流量為1、2 BV／h 時轉移率較高，為了節(jié)約時間，最終選擇2 BV／h。

圖3 洗脫劑體積流量對總黃酮轉移率的影響Fig．3 Effect of eluent volumetric flow rate on transfer rate of total flavonoids

2.5.5 洗脫劑用量 按“2.5.3” 項下方法裝柱、上樣、除雜，分別用5、6、7、8、9 BV 70%乙醇以2 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計算轉移率，結果見表8。由此可知，用量大于4 BV 時轉移率升高，而且逐漸平穩(wěn)，為了節(jié)約試劑，最終選擇8 BV。

表8 洗脫劑用量對總黃酮轉移率的影響（±s，n＝3）Tab．8 Effect of eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表8 洗脫劑用量對總黃酮轉移率的影響（±s，n＝3）Tab．8 Effect of eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

乙醇用量／BV轉移率／%4 73.75±0.09 80.81±0.07 6 86.02±0.08 7 88.61±0.09 8 89.73±0.07 9 91.01±0.09 5

2.6 驗證試驗 稱取HPD600 型樹脂1.8 g、AB-8型樹脂1.2 g，混勻后裝柱，30 mL 0.3 g／mL 上樣液以2 BV／h 體積流量上樣，8 BV 蒸餾水以5 BV／h體積流量除雜，8 BV 70%乙醇以2 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，測定總黃酮含量，計算轉移率；取3 份純化前后上樣液，每份10 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸至無液體流動，置于105 ℃烘箱中2 h，冷卻干燥，稱定質量，計算總黃酮純度，公式為純度＝（X／Y） ×100%，其中X為純化前總黃酮含量，Y為樣品液烘干后質量，結果見表9。由此可知，純化后總黃酮純度顯著升高，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表9 驗證試驗結果（n＝3）Tab．9 Results of verification tests （n＝3）

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)95%乙醇浸泡并以1 BV／h 體積流量洗脫后，大孔吸附樹脂再生處理效果較好；提取物大多殘留在柱尾，并且較難洗脫，故可考慮逆向洗脫以再生樹脂。

在考察檢測波長時發(fā)現(xiàn)，蘆丁對照品溶液、白子菜醇提液分別在510、507 nm 波長處有最大吸收，可能是由于后者所含成分復雜，造成波長略微藍移，故選擇510 nm 作為檢測波長。在考察樹脂吸附效果時發(fā)現(xiàn)，動態(tài)、靜態(tài)解吸結果有所差異，可能是由于樹脂球徑不同而導致樹脂和藥液中物質接觸面積、藥液流動速度不一。在考察吸附條件時發(fā)現(xiàn)，藥液酸性增加時變渾濁，有沉淀生成，并且析出的灰黑色物質中可能含有較多黃酮，故本實驗不對上樣液pH 進行調節(jié)。

驗證試驗發(fā)現(xiàn)，白子菜總黃酮轉移率達89.67%，純度由上樣前的12.67%增加至70.63%，RSD 均小于5%，表明成本低廉、綠色環(huán)保的HPD600、AB-8 型大孔吸附樹脂適用于該成分分離純化，可為其開發(fā)利用提供有力支持。