鳶尾苷元通過miR-449a 調控JAK／STAT 信號通路對人牙齦成纖維細胞增殖及凋亡的影響

杜 姣，張夢婕，黃聯杰

（武漢存濟口腔醫院綜合科，湖北 武漢 430020）

牙周炎是臨床常見的一種細菌感染性疾病，其可破壞口腔牙周組織進而影響牙槽骨的吸收，人牙齦成纖維細胞是牙齦的主要組成細胞，牙齦成纖維細胞增殖、凋亡、炎癥反應等均可引起牙周炎的發生。研究表明唑來膦酸、柚皮素等可調控牙齦成纖維細胞增殖、凋亡及成骨分化等過程［1-2］。鳶尾苷元是一種異黃酮類化合物，其含有3 個酚羥基與1 個甲氧基，為葛花的有效成分，研究表明其具有抗氧化、炎癥等作用［3］，但其對牙周炎的治療效果及可能作用機制尚未闡明。微小RNA （miRNA） 在牙齦成纖維細胞中異常表達，并可能調控炎癥反應進而參與牙周炎的發生過程［4］。微小RNA-449a （miR-449a） 在腦缺血再灌注損傷中表達降低，丹酚酸A 通過調節miR-499a／DDK1 抑制炎癥反應及細胞凋亡，進而減輕腦缺血再灌注損傷［5］。JAK／STAT 信號通路可介導細胞增殖、分化、凋亡等過程，一旦激活后可明顯誘導炎癥因子的聚集從而加重細胞損傷［6］。但miR-449a 和JAK／STAT 信號通路是否可介導鳶尾苷元調控牙齦成纖維細胞增殖及凋亡的過程尚未可知。因此，本研究主要探討鳶尾苷元對牙齦成纖維細胞增殖及凋亡的影響，探究其對miR-449a 表達和JAK／STAT 信號通路的調控作用。

1 材料

1.1 牙齦組織來源 收集2018 年2 月至2019 年8 月于本院診治的青少年的牙齦組織，拔除智齒時切取少量無炎癥牙齦組織，患者共25 例，其中男性15 例，女性10 例；年齡18～25 歲，平均年齡（23.12±3.15） 歲，牙齦組織于-80 ℃超低溫冰箱內保存。使用含有青鏈霉素雙抗的PBS洗滌牙齦組織，采用組織塊貼壁法進行原代培養［7］，得人牙齦成纖維細胞（HGFs）。本研究經本院醫學倫理委員會審批通過（批號20180019）。

1.2 藥物與試劑 鳶尾苷元（純度≥98%，批號20191203，成都格利普生物科技有限公司）；Lipofectamine2000 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen公司）；cDNA 合成與實時熒光定量聚合酶鏈反應（RTqPCR） 試劑［天根生化科技（北京） 有限公司］；甲基噻唑基四唑（MTT） 試劑、凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；兔抗人細胞周期蛋白1 （Cyclin D1）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 （cleaved caspase-3）抗體（美國Santa Cruz 公司）；兔抗人磷酸化Janus 激酶（p-JAK）、磷酸化信號轉導子和轉錄激活子（p-STAT） 抗體、辣根過氧化物酶（HRP） 標記的山羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥 取對數生長期HGFs （1×105／mL） 接種于96 孔板，每孔100 μL，分別加入含不同濃度（50、100、200 μmol／L） 鳶尾苷元的培養液培養24 h［8］，分別記作鳶尾苷元低、中、高劑量組，同時將正常培養的細胞作為對照組。分別將miR-NC、miR-449a mimics、anti-miR-NC、anti-miR-449a 轉染至HGFs，分別記作miR-NC 組、miR-449a 組、anti-miR-NC 組、anti-miR-449a 組。分別將antimiR-NC、anti-miR-449a 轉染至HGFs 后加入含200 μmol／L鳶尾苷元的培養液繼續培養24 h，分別記作鳶尾苷元+antimiR-NC 組、鳶尾苷元+anti-miR-449a 組。

2.2 MTT 法檢測細胞活力 取對數生長期HGFs （1×105／mL） 接種于96 孔板，每孔100 μL，按“2.1” 項下分組處理后繼續培養24 h，每孔分別加入MTT 溶液20 μL，繼續培養4 h，棄上清后每孔加入DMSO 150 μL，用酶標儀檢測各孔吸光度（A） 值，以A值間接表示細胞活力。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組HGFs，加入預冷PBS 洗滌后棄上清，加入500 μL 結合緩沖液重懸細胞后按照凋亡試劑盒檢測各組細胞凋亡率。

2.4 RT-qPCR 法檢測細胞miR-449a表達 收集各組HGFs，采用TRIzol 法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA 為模板進行RT-qPCR 反應，按照試劑盒說明書配置反應體系并設置反應條件，應用羅氏LightCycler480 熒光定量PCR 儀檢測miR-449a相對表達量。

2.5 Western blot 法檢測細胞Cyclin D1、cleaved caspase-3、p-JAK、p-STAT 蛋白表達 收集各組HGFs，用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，SDS-PAGE 電泳，轉膜，封閉2 h，分別孵育一抗（1 ∶1 000） 與二抗（1 ∶5 000），暗室內曝光顯影后應用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

2.6 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料均符合正態分布，以（±s） 表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 鳶尾苷元對HGFs 細胞增殖、凋亡的影響 與對照組比較，鳶尾苷元各劑量組細胞活力和Cyclin D1 蛋白表達均降低（P＜0.05），凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白表達均升高（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 鳶尾苷元對HGFs 細胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

表1 鳶尾苷元對HGFs 細胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別Cyclin D1cleaved caspase-3A 值凋亡率／%對照組0.86±0.080.32±0.030.986±0.097.13±0.64鳶尾苷元低劑量組0.72±0.06*0.48±0.04*0.765±0.08*13.16±1.05*鳶尾苷元中劑量組0.58±0.05*0.72±0.07*0.536±0.05*18.93±1.73*鳶尾苷元高劑量組0.41±0.04*0.79±0.06*0.457±0.04*25.43±2.34*

圖1 鳶尾苷元對HGFs 細胞凋亡（A） 及Cyclin D1、cleaved caspase-3 蛋白（B） 的影響

3.2 鳶尾苷元對HGFs 中miR-449a表達的影響 與對照組比較，鳶尾苷元各劑量組miR-449a表達升高（P＜0.05），見表2。

表2 鳶尾苷元對HGFs 中miR-449a 表達的影響（±s，n＝9）

表2 鳶尾苷元對HGFs 中miR-449a 表達的影響（±s，n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別miR-449a對照組1.00±0.11鳶尾苷元低劑量組1.57±0.12*鳶尾苷元中劑量組2.24±0.21*鳶尾苷元高劑量組2.64±0.23*

3.3miR-449a對HGFs 細胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-449a 組細胞活力及Cyclin D1 蛋白表達均降低（P＜0.05），凋亡率、miR-449a表達及cleaved caspase-3 蛋白表達均升高 （P＜0.05）。與anti-miR-NC 組比較，antimiR-449a 組細胞活力及Cyclin D1 蛋白表達均升高 （P＜0.05），凋亡率、miR-449a表達及cleaved caspase-3 蛋白表達均降低（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 miR-449a 對HGFs 細胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

表3 miR-449a 對HGFs 細胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

注：與miR-NC 組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC 組比較，＃P＜0.05。

組別miR-449aCyclin D1cleaved caspase-3A 值凋亡率／%miR-NC 組1.00±0.100.88±0.080.33±0.030.991±0.097.23±0.71 miR-449a 組1.85±0.14*0.41±0.04*0.76±0.07*0.506±0.05*20.64±1.82*anti-miR-NC 組1.01±0.090.84±0.070.31±0.020.983±0.087.14±0.62 anti-miR-449a 組0.38±0.03＃1.13±0.10＃0.08±0.01＃1.286±0.11＃3.04±0.27＃

圖2 miR-449a 對HGFs 細胞凋亡（A） 及Cyclin D1、cleaved caspase-3 蛋白（B） 的影響

3.4anti-miR-449a逆轉鳶尾苷元對HGFs 細胞增殖、凋亡的影響 與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較，鳶尾苷元+antimiR-449a 組細胞活力及Cyclin D1 蛋白表達均升高 （P＜0.05），凋亡率、miR-449a表達及cleaved caspase-3 蛋白表達均降低（P＜0.05），見圖3、表4。

表4 anti-miR-449a 逆轉鳶尾苷元對HGFs 細胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

表4 anti-miR-449a 逆轉鳶尾苷元對HGFs 細胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

注：與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較，*P＜0.05。

組別miR-449aCyclin D1cleaved caspase-3A 值凋亡率／%鳶尾苷元+anti-miR-NC 組1.00±0.100.43±0.040.81±0.070.447±0.0424.13±2.14鳶尾苷元+anti-miR-449a 組0.40±0.04*0.82±0.08*0.38±0.03*0.861±0.07*11.58±1.24*

圖3 anti-miR-449a 逆轉鳶尾苷元對HGFs 細胞凋亡（A） 及Cyclin D1、cleaved caspase-3 蛋白（B） 的影響

3.5miR-449a及鳶尾苷元對HGFs 細胞JAK／STAT 信號通路蛋白表達的影響 與對照組比較，200 μmol／L 鳶尾苷元組p-JAK、p-STAT 蛋白表達降低（P＜0.05）；與anti-miRNC 組比較，anti-miR-449a 組p-JAK、p-STAT 蛋白表達升高（P＜0.05）；與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較，鳶尾苷元+anti-miR-449a 組p-JAK、p-STAT 蛋白表達升高 （P＜0.05），見圖4、表5。

表5 miR-449a 及鳶尾苷元對HGFs 細胞p-JAK、p-STAT蛋白表達的影響（±s，n＝9）

表5 miR-449a 及鳶尾苷元對HGFs 細胞p-JAK、p-STAT蛋白表達的影響（±s，n＝9）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與anti-miR-NC 組比較，＃P ＜0.05；與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較，＆P＜0.05。

組別p-JAKp-STAT對照組0.73±0.060.62±0.05鳶尾苷元組0.33±0.03*0.28±0.02*anti-miR-NC 組0.74±0.060.63±0.06 anti-miR-449a 組1.11±0.10＃0.93±0.09＃鳶尾苷元+anti-miR-NC 組0.31±0.030.26±0.02鳶尾苷元+anti-miR-449a 組0.65±0.06＆0.57±0.04＆

圖4 各組細胞p-JAK、p-STAT 蛋白條帶圖

4 討論

牙周炎發病機制尚未完全闡明，牙周組織再生對治療牙周炎具有重要意義，牙周組織再生、修復等與牙齦成纖維細胞增殖、遷移及分化等密切相關，既往研究顯示脂聯素、硝苯地平等均可影響牙齦成纖維細胞生物學特性，但關于其具體作用機制尚未闡明［9-10］。miRNA 可能作為牙周炎治療的潛在靶標［11］。但關于藥物與miRNA 在治療牙周炎中的作用機制也尚未闡明。

鳶尾苷元具有清除氧自由基、降血糖等作用，還可減輕急性心肌梗死小鼠的心肌損傷［12］；可抑制血管平滑肌細胞增殖及炎癥反應的發生［13］；可抑制LPS 誘導的炎癥反應從而減輕小鼠急性肺損傷［14］。本研究結果顯示，鳶尾苷元可降低細胞活力，提高細胞凋亡率，提示鳶尾苷元可促進牙齦成纖維細胞凋亡。

miR-449a可通過調節高遷移率族框蛋白1 抑制類風濕關節炎成纖維細胞樣滑膜細胞增殖、遷移和炎癥反應［15］；還可調控AREG 減輕腦缺血損傷［16］。本研究結果顯示，鳶尾苷元可提高miR-449a表達；miR-449a過表達可降低細胞活力，促進細胞凋亡；而抑制miR-449a表達可提高細胞活力，抑制細胞凋亡，提示miR-449a過表達可抑制牙齦成纖維細胞增殖，誘導細胞凋亡。進一步研究顯示，鳶尾苷元與anti-miR-449a共處理后可增強細胞活力，降低細胞凋亡率，提示抑制miR-449a表達可明顯逆轉鳶尾苷元對HGFs細胞增殖及凋亡的作用。JAK 與細胞膜上的受體結合后發生磷酸化，STAT 與受體結合后在p-JAK 的催化下形成p-STAT，其可促進炎性細胞因子的分泌及生成，進一步促進細胞凋亡［17-19］。本研究結果顯示，鳶尾苷元可降低HGFs中p-JAK、p-STAT 蛋白表達；抑制miR-449a表達可促進p-JAK、p-STAT 蛋白表達；且抑制miR-449a表達可逆轉鳶尾苷元對p-JAK、p-STAT 蛋白表達的抑制作用，提示鳶尾苷元可能通過調控miR-449a而抑制JAK／STAT 信號通路的活化從而發揮作用。

綜上所述，鳶尾苷元可抑制HGFs 細胞增殖，促進細胞凋亡，其作用機制與上調miR-449a表達及抑制JAK／STAT信號通路活化有關，可為進一步闡明牙周炎發病機制奠定實驗基礎，還可為揭示鳶尾苷元治療牙周炎的分子機制提供參考。