茶葉中硒賦存形態的檢測研究進展

陳 瑤，薛敏敏，雷朋娜

（湖南省產商品質量檢驗研究院，湖南長沙 410007）

硒（Selenium，Se）作為人體和動物體內必需的微量元素，其功能由于形態的不同而有差異，其中有機硒具有提高免疫力、抗氧化和延緩衰老等作用。硒茶樹有較強富集和轉化硒元素的能力，茶葉是人類食物鏈中植物環節最佳的補硒資源，硒在茶葉中的賦存形態決定了人體中硒的營養生理學功能的發揮和攝入過量可能帶來的毒性[1]。因此，測定茶葉中總硒及硒賦存形態的含量，對合理膳食攝入硒元素具有重要指導作用。本文對茶葉中總硒及硒賦存形態的提取和含量檢測方法進行綜合論述，為茶葉中硒元素的賦存形態的后期研究提供參考。

1 茶葉中總硒及硒的賦存形態

硒有6 個天然存在的穩定同位素，具有-2、0、+4、+6 多種化學價態，構成多種特性的有機和無機硒化物[2]。其中有機硒化物包括含硒的氨基酸、含硒蛋白、硒醇、硒醚、硒酚等及其衍生物，無機硒化物包括含硒酸和含亞硒酸的鈉鹽。

杜琪珍等[3]采用同位素示蹤技術對硒在茶葉中的成分進行了深入研究，發現茶葉中硒蛋白質含量最多，占硒總量的80%，無機硒含量最少，僅約占硒總量的8%。茶樹中約80%的硒以有機化合物的形式存在，包括含硒的氨基酸及衍生產物、含硒的蛋白、硒核糖核酸和硒多糖等，其中絕大部分為游離硒蛋白。無機硒主要以SeO3

-和SeO42-的形式存在，在硒總量中的占比不超過16%[4]。

2 總硒及硒的賦存形態的提取

2.1 總硒的提取

總硒的提取方法較為統一，按照食品安全國家標準GB 5009.93—2017[5]中規定的方法，直接加硝酸-高氯酸混合酸利用微波消解或加硝酸利用微波消解對樣品進行提取。

2.2 有機硒的提取

有機硒的測定有兩種途徑，第一種是通過分離有機硒和無機硒，檢測出總硒和無機硒的含量，再將二者相減得到有機硒的含量。第二種是利用有機硒的標準品，分別檢測每種賦存形態硒的有機硒含量，再總和得到有機硒的含量。由于有機硒的標準品較難獲得，所以一般采用第一種。常見的有機硒提取方法包括差減法、有機溶劑萃取法和持續透析法[6]。

（1）差減法。采用定量檢測茶葉中含有的總硒和無機硒，二者含量相減得到有機硒的含量。無機硒的提取有50% HCl 酸提法、水提法。王梅等[7]通過水提法對富硒螺旋藻片中的無機硒進行提取，發現總硒和無機硒含量差減后得到有機硒在總硒中的占比在60%以上。

（2）有機溶劑萃取法。利用相似相溶原理提取有機硒，通過有機溶劑如甲苯、乙醇、乙醚和環己烷等萃取樣品中的有機硒。孫新濤等[8]選取乙醚、乙醇、甲苯有機試劑萃取富硒茶葉的有機硒，對萃取條件進行研究，發現用乙醇的萃取效果最好，最佳條件為浸提溫度50 ，浸提時間1 h，該方法的回收率為93.8%～95.9%，有機硒占總硒的百分比約為90.48%。

（3）持續透析法。利用透析袋和去離子水對樣品進行透析，通過持續換水將茶葉樣品中的無機硒透析到袋外，并測定透析袋內有機硒含量。艾春月等[9]通過采用持續透析法和差減法進行有機硒提取方法優選，持續透析法、差減法測得有機硒含量分別為（154.76±9.47） μg·kg-1、（265.02±6.55） μg·kg-1，富硒茶葉的有機硒提取方法中差減法優于持續透析法。

2.3 硒蛋白的提取

硒蛋白為茶葉中硒的主要存在形態。硒蛋白提取方法主要有溶劑提取法（水、鹽、乙醇、酸、酶和堿溶液萃取）、微波和超聲輔助提取法等[10]。溶劑提取法是指根據蛋白的溶解性不同，用蒸餾水、氯化鈉、氫氧化鈉和乙醇溶液為溶劑分離樣品中蛋白，主要用于富硒大米的硒蛋白提取方面。溶劑提取法效率高、成本低，使用較為頻繁，但也有硒蛋白易流失的問題。微波輔助提取法是利用微波的電磁場提高樣品與介質分子之間的分離作用，而超聲輔助提取法是利用超聲波加速了樣品和提取液充分混合反應，節省了預處理時間，兩種提取技術都可達到提高提取效率的效果。VALE 等[11]利用超聲輔助提取技術對硒營養強化劑中的硒化物進行了提取，用時短且提取效率高，方法回收率達到99%。

3 總硒及硒的賦存形態分析分離和檢測方法

近年來，針對茶葉樣品中硒的不同賦存形態研究出現了多種分離和檢測方法。研究表明，隨著聯用技術的迅猛發展，通過高效率的分離技術和高靈敏度的檢測方法的結合，可直接得到硒的賦存形態，從而對茶葉中硒的賦存形態進行分析。

3.1 氣相色譜-電感耦合等離子體質譜法

氣相色譜- 電感耦合等離子體質譜法（Gas Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，GC-ICP-MS）是利用氣相色譜儀對樣品進行分離，利用電感耦合等離子體質譜用儀進行檢測的方法。氣相色譜的高效能、高靈敏度、分析速度快、應用廣泛以及容易操作等特點，適合分離揮發性的硒化合物，也可利用衍生劑法使硒化合物衍生出揮發性，再利用氣相色譜分離進行硒化合物的檢測。GIRáLDEZ 等[12]利用衍生劑對樣品中硒化合物進行衍生化，吸附萃取后使用GC-ICP-MS 進行亞硒酸鹽和硒氨基酸的形態檢測，結果表明該方法線性關系良好、靈敏度高。

3.2 高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜法

氫化物-原子熒光光譜法（Hydride Generation-Atomiomic Fluorescence Spectrometry，HG-AFS）具有操作簡單、準確度高、有較寬線性范圍、效率高和消耗低等特點，與高效液相色譜儀聯用后可檢測不同形態的硒。章寒英等[13]采用酸和酶兩種方法對樣品進行提取，再利用此種聯用技術對樣品進行形態分析，在11 min 內分離出5 種硒形態。許月明等[14]用高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜法檢測出富硒黃山貢菊的樣品中存在4 種硒形態，其中硒代蛋氨酸含量最多。

3.3 高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法

高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）由于具有高靈敏度、速度快、同時多元素分析以及寬線性范圍等特點，是元素形態分析領域的常用技術。高效液相色譜是較為普及的分離技術，目前研究較多的有反相離子對色譜、離子交換色譜和分子排阻色譜。電感耦合等離子質譜聯用儀是目前使用最多的檢測器，其具有檢出限低、靈敏度高和多元素同位素檢測等優點，但運行成本較高。張穎等[15]利用HPLCICP-MS 聯用法有效分離出食品中5 種硒形態，定量分析硒（IV）和硒（VI）測得食品中無機硒的含量，對總硒進行測定，從而進一步計算出樣品中有機硒的含量。

3.4 毛細管電泳-電感耦合等離子體質譜法

毛細管電泳-電感耦合等離子體質譜法（Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，CE-ICP-MS）適用于分析檢測硒蛋白，其優點為分辨率高、取樣量少、效率高以及不改變樣品形態等。毛細管電泳是以高壓直流電場為驅動力，加入緩沖溶液，在極微小內徑的毛細管內，根據各組分分配系數以及遷移速度的差異進行蛋白高效分離。ZHAO 等[16]使用CE-ICP-MS 聯用法檢測了富硒大米中的硒形態，得出硒主要以硒代蛋氨酸形式存在，該聯用法回收率較高。

4 結語

目前我國現行的茶葉中硒的檢測方法和國家標準為總硒含量的檢測標準，茶葉中有機硒、硒賦存形態等關鍵性指標的國家標準仍缺失。根據《中華人民共和國國民經濟和社會發展第十四個五年規劃和2035 年遠景目標綱要》《“健康中國2030”規劃綱要》，預計到2030 年，全民健康素養水平大幅提升，健康生活方式基本普及，各地將有把富硒產業作為特色產業上升為國家戰略的趨勢。隨著我國市場對富硒茶葉的需求不斷增長，有機硒、硒不同賦存形態含量標準、生產技術和質量安全成為關注重點。茶葉中硒賦存形態的研究是為了后期更好地研究硒在人體內的營養價值和生理功能，所以將硒的賦存形態分析與生物功能學和營養學等相結合是未來研究的方向。