應(yīng)用宏基因組二代測(cè)序法評(píng)價(jià)支氣管鏡消毒滅菌效果的初步研究

金丁萍,胡燕燕,倪凱文,陳來(lái)娟,楊曉煊,陸 群

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院,浙江杭州 310009

當(dāng)前支氣管鏡的臨床應(yīng)用越來(lái)越普及,其管腔狹小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特點(diǎn)使其護(hù)理清洗尤為困難,若基礎(chǔ)護(hù)理、消毒滅菌和儲(chǔ)存不規(guī)范,容易導(dǎo)致醫(yī)院感染發(fā)生。2019年美國(guó)公布的十大醫(yī)療危害技術(shù)中,明確指出了內(nèi)鏡是增加醫(yī)院感染的風(fēng)險(xiǎn)因素[1]。在各種內(nèi)鏡中支氣管鏡的細(xì)菌檢出率最高,達(dá)到40%,尤其是內(nèi)腔細(xì)菌檢出率高達(dá)57.14%[2]。因此,保證支氣管鏡清洗、消毒、滅菌的效果非常重要,定期開(kāi)展消毒效果的質(zhì)量監(jiān)測(cè)尤為重要。目前國(guó)內(nèi)按照GB 15982-2012《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》,采用常規(guī)法進(jìn)行病原微生物檢測(cè),但檢測(cè)的敏感性較低,尤其對(duì)于少見(jiàn)、難培養(yǎng)的病原體檢出困難。宏基因組二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種微生物檢測(cè)技術(shù),具有靈敏度、準(zhǔn)確性和檢測(cè)效率高的優(yōu)勢(shì)[3],在臨床疑難復(fù)雜感染的診斷中發(fā)揮了巨大價(jià)值,但尚未應(yīng)用于內(nèi)鏡消毒效果監(jiān)測(cè)中。本研究對(duì)經(jīng)過(guò)規(guī)范消毒滅菌后的支氣管鏡進(jìn)行mNGS檢測(cè),并與常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行比較,初步評(píng)價(jià)mNGS對(duì)支氣管鏡消毒滅菌效果監(jiān)測(cè)的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究材料

2022年6月,隨機(jī)抽取某三級(jí)甲等綜合性醫(yī)院內(nèi)鏡室按規(guī)范流程清洗、過(guò)氧乙酸高水平消毒滅菌后的支氣管鏡8根(日本產(chǎn)),分別為型號(hào)BF-P260F(1根)、BF-260(1根)、BF-F260(1根)、BF-IT260(2根)、BF-UC260FW(1根)、BF-P60(2根)。嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則,使用50 mL注射器抽取50 mL含相應(yīng)中和劑的無(wú)菌液,從支氣管鏡的活檢口注入并全量收集至無(wú)菌瓶?jī)?nèi),分別標(biāo)記為樣本C1～C8待檢。準(zhǔn)備8根新啟用并經(jīng)過(guò)清洗和滅菌處理的清洗刷,從8根支氣管鏡活檢口插入,按10～15 cm的行進(jìn)間距從上往下來(lái)回刷洗,直達(dá)出口處,約3 min后抽出清洗刷,同上采用50 mL無(wú)菌液從活檢口沖洗支氣管鏡,收集樣本標(biāo)記為S1～S8待檢。

1.2 方法

1.2.1試劑與儀器

高通量測(cè)序相關(guān)試劑(武漢產(chǎn))、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(英國(guó)產(chǎn)),MGISEQ-2000測(cè)序平臺(tái)(深圳產(chǎn))、抽濾泵和0.45 μm一次性過(guò)濾杯(美國(guó)產(chǎn))。

1.2.2檢測(cè)人員

所有樣本均由醫(yī)院感染管理科專(zhuān)職護(hù)士采集,送微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)人員為檢驗(yàn)科專(zhuān)職人員,具有相應(yīng)檢測(cè)資質(zhì)。

1.2.3操作方法

1.2.3.1 常規(guī)微生物培養(yǎng)方法

按照GB 15982-2012《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》消毒后內(nèi)鏡的監(jiān)測(cè)方法,將C1～C8、S1～S8共16份樣本分別取1 mL接種平皿,將預(yù)先冷卻至45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂每平皿傾注20 mL,經(jīng)35℃培養(yǎng)2 d后記錄第一次菌落數(shù),繼續(xù)培養(yǎng)至7 d后,記錄第二次菌落數(shù)。將剩余洗脫液的2/3量在無(wú)菌條件下采用0.45 μm濾膜過(guò)濾濃縮,分別將濾膜接種于已凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,經(jīng)35℃培養(yǎng)2 d、7 d后分別記錄菌落數(shù)。

1.2.3.2 mNGS檢測(cè)方法

將經(jīng)微生物常規(guī)培養(yǎng)后剩余的樣品(1/3的量)用0.45 μm濾膜過(guò)濾,按4份樣本過(guò)濾在同一張膜上;然后將濾膜放入50 mL無(wú)菌離心管內(nèi),用10 mL無(wú)菌等滲鹽水震蕩洗脫10 min,取出濾膜后將10 mL的液體以12 000 rpm離心5 min,棄上清,沉淀備用。獲取沖洗液和刷洗液各2管,分別標(biāo)記為C1～C4、C5～C8、S1～S4、S5～S8,共4份樣本用于后續(xù)的mNGS方法檢測(cè)病原微生物。4份用于mNGS檢測(cè)的樣本采用柱提法提取核酸,并用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理以打斷核酸。核酸片段主要通過(guò)末端修復(fù)、添加接頭、核酸磁珠純化進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建;根據(jù)濃度混合核酸,環(huán)化擴(kuò)增文庫(kù)得到DNB(DNA nanoball,DNA納米球);隨后通過(guò)儀器氣液系統(tǒng)將DNB泵入到芯片并加以固定,然后泵入測(cè)序試劑進(jìn)行測(cè)序分析。每次檢測(cè)均設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4評(píng)價(jià)方法

1.2.4.1 常規(guī)微生物培養(yǎng)結(jié)果評(píng)價(jià)方法

菌落總數(shù)(CFU/件)=兩平行平板的平均菌落數(shù)(CFU/平板)+濾膜上菌落數(shù)(CFU/濾膜)。

1.2.4.2 mNGS檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)方法

宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)服務(wù)器生物信息學(xué)分析得到初步報(bào)告,由實(shí)驗(yàn)室具有生物信息學(xué)背景的臨床微生物專(zhuān)家解讀,主要依據(jù)同批次的陰陽(yáng)性對(duì)照及以往對(duì)臨床樣本分析的經(jīng)驗(yàn)積累進(jìn)行報(bào)告。主要評(píng)價(jià)指標(biāo)包括嚴(yán)格比對(duì)序列數(shù) (strict mapping reads number,SMRN)、深度(depth)、標(biāo)準(zhǔn)化為1M序列數(shù)(reads per million,RPM)。SMRN:指匹配到該病原體的序列數(shù)目,其多少與標(biāo)本中病原體本身載量負(fù)荷、核酸提取量、人源序列比例等有關(guān),序列數(shù)越高,表示標(biāo)本中檢測(cè)到該病原體的可信度越高。深度:指該微生物基因組上某段序列被檢測(cè)到的次數(shù),深度參數(shù)越大表示該微生物被檢測(cè)到的可靠性越高。RPM:指每百萬(wàn)測(cè)得序列中比對(duì)到目標(biāo)物種基因組的序列條數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)微生物培養(yǎng)的結(jié)果

16份樣本經(jīng)傾注法和濾膜法培養(yǎng)2 d和7 d后,均未檢出病原微生物。

2.2 mNGS檢測(cè)結(jié)果

混合后的4份樣本經(jīng)初步生物信息學(xué)分析檢出不同序列數(shù)的抗輻射不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、腐生葡萄球菌、豚鼠氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、遜德勒不動(dòng)桿菌、卡他莫拉菌、巴斯德葡萄球菌等,其中每份標(biāo)本均檢出銅綠假單胞菌。相同內(nèi)鏡混合后的刷洗液與對(duì)應(yīng)的沖洗液比較,檢出菌種數(shù)、序列數(shù)沒(méi)有明顯增加,未檢出特殊、難培養(yǎng)的病原微生物,見(jiàn)表1和表2。陰性對(duì)照中也包含不同序列的上述菌種,經(jīng)微生物專(zhuān)家結(jié)合陰陽(yáng)性對(duì)照及臨床經(jīng)驗(yàn),進(jìn)一步分析認(rèn)為,4份樣本檢出菌均屬于背景菌。

表1 mNGS檢測(cè)8根支氣管鏡沖洗液的微生物結(jié)果

表2 mNGS檢測(cè)8根支氣管鏡刷洗液的微生物結(jié)果

3 討論

3.1 微生物培養(yǎng)法能滿足當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)法處理支氣管鏡后滅菌效果評(píng)價(jià)的需求

近年來(lái),隨著內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展及在臨床中的廣泛應(yīng)用,軟式內(nèi)鏡使用后的消毒效果評(píng)估越來(lái)越受到關(guān)注。本研究中的8根內(nèi)鏡在高水平消毒及滅菌后分別采用沖洗和刷洗兩種方法采集樣本,并按GB 15982-2012《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中的要求進(jìn)行微生物培養(yǎng),結(jié)果常規(guī)微生物培養(yǎng)2 d、7 d均為陰性,說(shuō)明按照目前清洗、消毒、滅菌的標(biāo)準(zhǔn)處理支氣管鏡能夠達(dá)到要求。但通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)法檢測(cè)病原微生物的種類(lèi)有限,無(wú)法檢出特殊難培養(yǎng)的細(xì)菌、非典型病原體、病毒等;而且受限于細(xì)菌的生長(zhǎng)特性,出報(bào)告時(shí)間2～15 d不等[4]。因此,采用該技術(shù)監(jiān)測(cè)支氣管鏡的消毒效果存在假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 mNGS用于支氣管鏡滅菌效果的評(píng)價(jià)在性價(jià)比上并沒(méi)有優(yōu)勢(shì)

mNGS可同時(shí)對(duì)數(shù)十萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)條DNA/RNA分子序列讀取,單次運(yùn)行即可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)以及非典型病原體的鑒定,尤其是能夠檢出未知及難培養(yǎng)病原體。且檢測(cè)速度快,在感染性疾病診斷中具有重要價(jià)值[5]。本研究對(duì)8根支氣管鏡的沖洗液和刷洗液進(jìn)行mNGS檢測(cè),結(jié)果檢出均為背景菌,未見(jiàn)難培養(yǎng)和特殊的病原體,這與王萍等[6]的研究結(jié)果一致。此外,支氣管鏡容易形成生物膜,是導(dǎo)致內(nèi)鏡消毒、滅菌失敗的主要原因。即使嚴(yán)格按照規(guī)范對(duì)支氣管鏡進(jìn)行清洗消毒,生物膜仍無(wú)法被徹底清除,存在交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)[7]。對(duì)比本研究中刷洗液、沖洗液的mNGS檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)刷洗后并未見(jiàn)微生物構(gòu)成和序列數(shù)的明顯增加,可能與該批次支氣管鏡的日常清洗和維護(hù)較好、沒(méi)有明顯的生物膜形成有關(guān)。此外,mNGS檢測(cè)的成本明顯高,對(duì)于常規(guī)支氣管鏡滅菌效果的評(píng)價(jià)并不合適。

3.3 mNGS用于支氣管鏡滅菌效果的評(píng)價(jià)還需要更多研究

由于本研究是首次對(duì)支氣管鏡的沖洗液和刷洗液進(jìn)行mNGS檢測(cè),對(duì)標(biāo)本質(zhì)量控制、結(jié)果解讀還缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),且二代測(cè)序技術(shù)敏感度高、背景核酸干擾、外源性核酸污染、定植菌的混雜等容易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果,檢測(cè)出的病原微生物基因片段也可能是經(jīng)過(guò)高水平消毒滅菌后死亡病原體的殘骸。因此,本研究認(rèn)為研究中mNGS未檢出特殊、難培養(yǎng)的病原體才具有重要的臨床價(jià)值,而對(duì)檢出常見(jiàn)病原微生物及其序列數(shù)高低的臨床意義還有待明確,需要排除檢測(cè)過(guò)程中的污染,并結(jié)合培養(yǎng)法的結(jié)果做出綜合判斷。

3.4 本研究的局限性

首先是選取的支氣管鏡數(shù)量有限,沒(méi)有對(duì)支氣管鏡使用的年限進(jìn)行分層。第二,因?yàn)榭紤]研究成本,沒(méi)有對(duì)每根支氣管鏡的樣本逐個(gè)進(jìn)行mNGS檢測(cè),而是將8根支氣管鏡的沖洗、刷洗的16個(gè)樣本合并成4份,不能區(qū)分單根支氣管鏡的情況。第三,由于缺乏內(nèi)鏡采樣標(biāo)本質(zhì)量控制和結(jié)果解讀的標(biāo)準(zhǔn),對(duì)mNGS檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)判斷還有待更多的研究。

(致謝:感謝護(hù)理部封秀琴主任、醫(yī)院感染管理科董麗老師對(duì)本研究的悉心指導(dǎo)!)