水生微宇宙研究熱點及毒性對比與預測分析

吳 凡，王曉南*，王旭升，王佳琪，張 聰，劉征濤

1.中國環境科學研究院，環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012

2.海油環境科技（北京）有限公司，北京 100027

微宇宙(microcosm)被稱為模型生態系統，即盡可能地模擬自然生態系統[1]，把復雜多變的自然生態系統加以簡化并對其過程進行模擬，但是模擬的微宇宙并非完全復制自然生態系統；此外一些難以到達的特殊生態系統，如沙漠、遠洋和火山口等也可以通過微宇宙進行研究.微宇宙可以分為陸生微宇宙、水生微宇宙以及濕地(水陸生)微宇宙三類[2].

隨著人類社會的發展，污染物的排放對水生態系統造成了危害[3-4]，相較于單物種毒性實驗，水生微宇宙作為模型生態系統，可以進行群落水平對污染物響應的研究[2,5]，在污染物的生態毒性以及污染物與環境DNA(eDNA)的降解研究中得到應用.孫健等[6]采用35 d 的水生微宇宙毒性實驗，得出三唑酮對中華薄殼介(Dolerocypris sinensis)、隆線溞(Daphnia carinata)等8 種浮游動物組成群落的無效應濃度(NOECcommunity)＞2 078.88 μg/L.Essid 等[7]采用水生微宇宙系統研究了內分泌干擾物苯甲酸雌二醇對線蟲(nematodes)等小型底棲生物群落的影響，發現高濃度(12.9 ng/L)組會造成線蟲群落的Shannon-Wiener指數下降.為充分反映污染物對群落的生態毒性，袁丙強等[8]擴充了生態位，選用大型溞(Daphnia magna)、萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)、羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)等浮游生物組成群落，開展了63 d 的水生微宇宙毒性實驗，結果顯示，三唑磷對浮游生物群落的NOECcommunity和最低觀察效應濃度(LOECcommunity)分別為17.5 和52.5 μg/L.為了全面探索有毒污染物的遷移轉化規律，水生微宇宙技術也被引入污染物的降解轉化等研究中.Yi 等[9]采用小球藻(Chlorellasp.)與鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)的微宇宙系統開展了苯酚的降解研究，發現小球藻與鉤蟲貪銅菌共存時對苯酚的降解能力增強.McKeever等[10]采用水生微宇宙實驗發現，加入好氧微生物群落后二溴化乙烯的降解速率是之前的8 倍.但這些實驗過程均未考慮環境因素的影響，Mouafo 等[11]將環境因素納入實驗發現，在酸性水生微宇宙環境中高溫不利于銅綠假單胞菌降解聚乙烯.為了計算生態系統的物種多樣性，近年來eDNA 技術常被用于分析環境中的目標物種[12]，然而受到環境因素的影響，eDNA的降解會影響檢測結果的可靠性[13]，水生微宇宙可以模擬不同的環境條件，有助于研究環境因素對eDNA 降解的影響.Strickler 等[13]通過水生微宇宙實驗發現，在低溫(5 ℃)、低紫外線輻射以及堿性條件下，牛蛙蝌蚪的eDNA 降解速率最低；而Wei 等[14]通過水生微宇宙實驗發現，高濃度細菌可以增加日本大螯蜚(Grandidierella japonica) eDNA 的降解速率.

在水生生物毒性實驗中，水質參數，如pH[15-16]、硬度[17-18]和溶解氧[19]等均會對污染物的毒性效應產生影響，毒性預測模型的研究可以定量水質參數對毒性效應的影響.Schlekat 等[20]成功構建了鎳對水中大型溞和隆線溞的毒性預測模型，其中包含的水質參數有pH、硬度及溶解有機碳.Wang 等[21]將可溶性有機碳作為影響因子構建了水體中銅對鯉魚(Cyprinus carpio)的毒性預測模型，并使用急性毒性實驗數據對預測模型進行了驗證.

微宇宙作為一種新型模型生態系統，應用領域逐漸增多.因此，該研究采用CiteSpace 軟件，對國內外所有涉及微宇宙的文獻進行計量分析，分析國內外水生微宇宙的研究現狀和熱點趨勢；搜集基于水生微宇宙的生態毒性數據，并與單物種毒性實驗數據進行對比分析，分別構建了通過單物種及水質參數預測微宇宙毒性數據的回歸模型，以期為水生微宇宙的深入研究提供參考.

1 標準水生微宇宙實驗體系及實驗系統

在標準微宇宙系統的構建中，系統介質以及沉積物一般采用T82MV 培養液以及由石英砂、幾丁質和纖維素制成的人工沉積物[5-6].由圖1 可見：在向經過滅菌處理的容器中加入培養液以及沉積物3～7 d 后加入浮游植物，約一周時間后加入浮游動物；在全部受試生物接種入微宇宙3～7 d 后投入受試物質，記當天為實驗的第0 天[7].

圖1 標準水生微宇宙實驗流程Fig.1 The flow chart of standard aquatic microcosm test

基于不同研究目的，構建的微宇宙系統也會存在差異，現階段主要的微宇宙實驗系統如表1 所示.依據微宇宙內部循環特征，將水循環納入體系的微宇宙系統稱為流動微宇宙[1]，反之則為靜止微宇宙.其中，靜止微宇宙使用較為廣泛，實驗時間范圍為22～281 d，實驗容器體積較小.流動微宇宙實驗時間范圍為59～77 d，實驗容器體積較大，一般參考加拿大奎爾夫大學的室外微宇宙系統[30]進行設計.受試生物方面，一般采用甲殼類和輪蟲(rotifers)等浮游動物，綠藻、藍藻和硅藻等浮游植物、沉水植物等.此外，受試生物的種類也受實驗容器體積的影響，容器體積較大的微宇宙會涉及沉水植物以及大型無脊椎動物，其中沉水植物主要為金魚藻屬(CeratophyllumL.)或狐尾藻屬(MyriophyllumL.)等多年生草本植物，大型無脊椎動物主要為鉤蝦(Gammarussp.)、椎實螺(Lymnaeasp.)和石蛭(Erpobdellasp.)等.

表1 微宇宙系統以及相應受試生物Table 1 Microcosm system and corresponding test organisms

2 文獻數據分析

2.1 數據的獲取

為了更好地探索國內外水生微宇宙領域的研究進展，基于中國知網、Elsevier 以及Web of Science 數據庫進行了文獻數據搜集，并對搜集到的中英文文獻全記錄數據使用CiteSpace 進行關鍵詞聚類分析.在中國知網數據庫中以“水生微宇宙”“模擬水生生態系統”以及“生態毒理學”為主題關鍵詞分別進行檢索，從1990 年至2022 年8 月10 日共得到105 篇有效文獻.在Web of Science 核心數據集中以“aquatic microcosm”以及“ecotoxicology”為主題關鍵詞進行檢索，從1962 年至2022 年8 月10 日共得到2 115 篇有效文獻，其中，國內文獻198 篇，國外文獻1 917 篇.

2.2 國內外發文量對比

以每10 年為時間切片單位，將國內外文獻數據集各時間切片內的發文量進行對比(見圖2).由圖2可見，國內水生微宇宙領域的研究相對較為滯后，從21 世紀10 年代開始國內發文量有顯著增加趨勢，到21 世紀20 年代后國內發文量占比已從21 世紀10年代的16.1%提至26.1%，表明國內近些年關于微宇宙的研究正在迅速發展.國外在20 世紀60-80 年代開始對水生微宇宙進行探索，到90 年代后相關發文量顯著提升.由于水生微宇宙可以模擬自然生態系統的特性，該領域的研究熱度越來越高，21 世紀20 年代的總發文量已經接近20 世紀90 年代的總發文量.

2.3 關鍵詞聚類圖、時間線圖分析

論文關鍵詞是對論文內容的高度總結，可以反映文章的研究主題以及主要研究內容，也具有較好的繼承以及延伸性，因此對關鍵詞的分析可以更好地把握某一研究領域的發展趨勢以及當下研究熱點.

中國知網數據庫關鍵詞聚類如圖3(a) 所示，聚類模塊值(Modurality Q)=0.857 8(＞0.3)，聚類平均輪廓值(Mean Silhouette)=0.638 6(＞0.5)，表明聚類顯著.聚類標簽序號越小，表示該聚類下包含的關鍵詞數量越多，同一聚類中的關鍵詞聯系較為密切，選取前10個聚類進行展示.由圖3(a)可見，與水生微宇宙相關的中文文獻研究主題多與宏觀層面的生態系統層級相關，部分選用微生物作為實驗對象.

圖3 國內水生微宇宙研究領域文獻關鍵詞分析Fig.3 Key words analysis map in domestic literatures about aquatic microcosm

由圖3(b)可見，多數聚類在近幾年較為缺乏，相關實驗仍需進一步拓展.在聚類“#1 富營養化”“#3 微宇宙系統”“#4 微生物”中分別發現了關鍵詞“三唑磷”“銅離子”和“恩諾沙星”等，已有學者采用水生微宇宙進行相應污染物的生態毒理實驗[6,37-38]，表明國內文獻中生態毒理已成為水生微宇宙研究領域的熱點之一.

Web of Science 數據庫關鍵詞聚類如圖4(a)所示，聚類模塊值(Modurality Q)=0.454(＞0.3)，聚類平均輪廓值(Mean Silhouette)=0.732(＞0.7)，表明聚類顯著.“#0 Dynamics(動態)”和“#1 Ecotoxicology(生態毒理學)”是包含關鍵詞數量排名前二位的聚類，在數據庫中分別檢索到1 008 和539 篇相關文獻.在其他聚類如“#2 Bioaugmentation(生物強化)” 和“#4 Impact(影響)”中也包含了“rhizosphere(根際)”“silver nanoparticle(納米銀離子)”等生態毒理常用的關鍵詞.如Lin 等[26]在水生微宇宙中研究了亞微米塑料對植物根際微生物的毒性效應；B?ttcher 等[39]采用微宇宙毒性實驗，通過21 d 的暴露實驗研究了異丙隆對浮萍(Lemna minor)根際的影響；還有許多學者采用水生微宇宙進行了納米銀離子的生態毒性實驗[40-44].這表明在其他聚類中也包含與生態毒理學密切相關的關鍵詞，綜合中英文獻關鍵詞聚類分析可以看出，生態毒理學在水生微宇宙的研究中占比較大.

圖4 國外水生微宇宙研究領域文獻關鍵詞分析Fig.4 Key words analysis map in international literatures about aquatic microcosm

英文文獻關鍵詞時間線圖〔見圖4(b)〕顯示，第一篇水生微宇宙研究文獻于20 世紀60 年代發表，但20 世紀90 年代之前水生微宇宙相關文獻較少，在90 年代其數量顯著增長，因此包含關鍵詞較多的聚類從90 年代開始計算.其中，聚類“#0 Dynamics(動態)”包含關鍵詞數量最多，從20 世紀60 年代至今一直有相關研究，且持續有新研究方向的關鍵詞出現在聚類中.動態代表了生物體對生態系統生境的所有適應性反應[45]，以及生態系統本身與生物體通過相互作用所形成的進化機制[46-47]，因此相關實驗涉及范圍廣泛，需要跨學科的研究方法，聚類“#0 Dynamics(動態)”的關鍵詞涉及“litter decomposition (凋落物降解)”“ecosystem function (生態系統功能)”“species richness(物種豐富度)”等領域研究.聚類“#1 ecotoxicology(生態毒理學)”的文獻數量較多，但近階段沒有新關鍵詞出現在該聚類中，這可能與生態毒理聯系較為密切的關鍵詞出現在其他聚類中有關，如“#0 Dynamics(動態)”“#4 Impact(影響)”和“#8 Microbial communities(微生物群落)”中出現的“Risk(風險)”，以及“#5 Antifouling(防污)”中出現的“oxidative stress(氧化壓力)”等.這表明水生微宇宙作為模型生態系統，相關實驗逐漸包含生態系統內部更多的生態學進程，并向交叉學科的研究發展，不局限于單一的研究方向.通過對國內外水生微宇宙領域文獻關鍵詞聚類進行對比(見表2)可以發現，國內外都開展了水生微宇宙的群落影響、微生物實驗，但國內更多集中在生態系統宏觀層面的實驗，國外除了宏觀層面的實驗外，也開展了生態毒理學和微觀層面的實驗.

表2 國內外水生微宇宙文獻關鍵詞聚類對比Table 2 Comparison of keyword clusters in domestic and foreign literatures about aquatic microcosm

3 基于微宇宙的毒性數據分析

從上述文獻聚類結果可以看出，生態毒理是采用微宇宙進行實驗的主要研究方向之一.傳統的生態毒理實驗一般是基于單一物種對污染物進行劑量-效應評估.在20 世紀80 年代研究[48-49]發現，單物種毒性實驗結果無法用于評估生態系統層級的反應，因為物種在生態系統中會參與各種生態學進程，并受到物種間相互作用以及非生物部分相互作用的影響，所以基于單物種的毒性實驗并不能完全反映污染物對生態系統中該物種產生的影響.鑒于單物種毒性實驗的局限性，需要運用更接近自然生態系統的實驗方式，因此水生微宇宙技術被引入到生態毒性實驗當中.此外，水質參數會對水生微宇宙中污染物的毒性效應產生影響.因此，該研究進一步開展了基于微宇宙生態毒性數據的研究，比較了單物種毒性實驗和微宇宙毒性實驗兩種實驗所得毒性值的差異，并分析了兩種毒性實驗所得毒性值的聯系，以及水質參數對微宇宙毒性效應的影響.

3.1 數據的獲取、篩選和處理

對基于2.1 節搜集的中文文獻進行篩選，保留包含生態毒性數據以及對應水質參數的文獻并對數據進行整理；采用Elsevier 和Web of Science 數據庫以“aquatic microcosm”和“toxicity”為主題對英文文獻中水生微宇宙的生態毒性數據以及對應的水質參數數據進行搜索整理.并在上述數據庫和美國ECOTOX數據庫中分別搜索微宇宙毒性實驗涉及污染物對應的單物種毒性實驗數據，搜集到的數據包含NOEC、LOEC(最低觀察效應濃度)、EC10和EC50.

由于不同污染物和物種的毒性數據差異較大，為使數據呈正態化分布，對所有搜索得到的毒性數據進行對數處理.對部分水質參數缺少的數據，使用R 4.2.1 以及RStudio 軟件中的“mice”程序包進行多重插補，這是一種基于重復模擬的處理缺失值的方法，在土壤性質參數[50]以及水質參數[51]等方面具較好的填補效果.

3.2 單物種毒性數據與微宇宙毒性數據的對比分析

為確保實驗環境條件基本一致，分別選取采用標準實驗準則(如OECD 202 等)進行單物種毒性實驗以及采用美國材料與試驗協會準則ASTM E 1366-02進行微宇宙毒性實驗的文獻，并進一步對文獻中相同暴露時間下單物種[52-59]和微宇宙[31,34-36,60-63]兩種毒性實驗得出的毒性指標(NOEC、LOEC、EC10和EC50)分別計算平均值，如兩種實驗方式下阿特拉津對伊樂藻(Elodea canadensis)的EC50(14 d)、氯乙酸對西伯利亞狐尾藻(Myriophyllum sibiricum)的EC50(4 d)、多菌靈對觸角豆螺(Bithynia tentaculata)的NOEC(28 d)等.由于相同暴露時間下可選擇數據較少，NOEC、LOEC 和EC10的平均值包含6 組數據，EC50平均值包含9 組數據.對比分析(見圖5)發現，微宇宙毒性實驗數據平均值較單物種毒性實驗平均值降低了56%，其中兩種實驗方式下的NOEC、LOEC 和EC10平均值均存在顯著差異(微宇宙毒性實驗結果較單物種毒性實驗結果降低了49%，t檢驗，P＜0.05)，EC50平均值也存在顯著差異(微宇宙毒性實驗結果較單物種毒性實驗結果降低了64%，t檢驗，P＜0.01).結果表明，在種間相互作用的影響下物種對污染物更為敏感.

圖5 單物種毒性實驗和微宇宙毒性實驗毒性平均值的對比Fig.5 Comparison of mean toxicity data between single species test and microcosm test

種間作用的影響導致單物種毒性實驗和微宇宙毒性實驗所得毒性值存在顯著差異，因此本研究分別選取兩種實驗的9 組NOEC (LOEC、EC10)和EC50數據進行回歸分析構建回歸預測模型(見圖6).由圖6可見，單物種毒性實驗和微宇宙毒性實驗的毒性數據之間呈顯著正相關〔NOEC (LOEC、EC10) 數據的P＜0.05，EC50數據的P＜0.01〕.風險評估的常用評價標準一般基于單物種毒性實驗所得毒性值，但污染物進入生態系統后的毒性效應需考慮群落水平的影響[48-49]，單物種毒性實驗所得毒性值無法充分反映群落水平的間接作用，因此基于群落水平的微宇宙毒性實驗所得毒性值在風險評估中更加可靠[59].圖6 中顯示的2個預測模型可以通過單物種毒性試驗所得毒性值推導出微宇宙毒性試驗中相應物種的毒性值，表明該模型可為基于群落水平的生態風險評估提供參考.

圖6 毒性數據回歸分析Fig.6 Regression analysis of toxicity data

3.3 水質參數對微宇宙毒性效應的影響

采用R 4.2.1 軟件，基于逐步回歸分析剔除了相關性較差的水質參數后，構建了水生微宇宙中不同水質參數對浮游動物[24,27,35-36]以及被子植物[23,29,31,62,64-65]的毒性數據預測模型(見表3).由表3 可見，在水生微宇宙毒性實驗中有機殺菌劑(四環素類、鹵乙酸類、三嗪類和鹵代烴類)對浮游動物的毒性主要受溶解氧和pH 影響(R2為0.822)，對被子植物的毒性主要受pH 和堿度的影響(R2為0.984)，其中，溶解氧和pH 均增強了有機殺菌劑對浮游動物的毒性效應，pH和堿度均減弱了其對被子植物的毒性效應.研究[66]發現，pH 等土壤參數以影響污染物生物有效性的方式對毒性效應產生影響，其構建了基于pH 等土壤性質的毒性預測模型，為生態風險評估和毒性預測提供支持.在水質參數的影響研究方面，US EPA 采用基于溫度和pH 的模型來推導氨氮水質基準[67]，另有學者構建了pH 對有機殺菌劑五氯酚的生態毒性預測模型[68].研究中多選用pH 等水質參數構建毒性預測模型，是因為其通過影響污染物在水體中的有效態含量，從而影響其對水生生物產生毒性效應的有效含量，即生物有效性.

表3 水質參數預測毒性數據回歸模型Table 3 Regression models for predicting toxicity data from water quality parameters

該研究采用文獻數據[30,31,61-62,69-72]對預測模型結果進行驗證，其中，選用8 組浮游動物數據、4 組被子植物數據進行驗證(用于驗證的數據未被用于模型的構建)，并對預測結果進行分析(見圖7).由圖7 可見，模型預測值和微宇宙毒性實驗實測值相似，且均在95%預測帶內，表明該模型可對上述有機殺菌劑對浮游動物和被子植物的毒性效應進行預測，已有學者對土壤毒性預測模型進行了相似結果驗證[73-75].后續數據的補充可以更好地驗證該模型的精確度，為基于微宇宙的生態系統風險評估提供參考.

圖7 模型結果驗證Fig.7 Verification of model results

4 結論

a) 根據聚類與時間線分析發現，生態毒理學是水生微宇宙的重要研究方向，近年來微宇宙毒性實驗逐漸向交叉學科的方向發展，不再局限于單一的研究方向.

b) 基于15 組相同暴露條件下的微宇宙與單物種毒性實驗數據，經過統計分析發現，微宇宙毒性實驗的毒性數據(NOEC、LOEC、EC10和EC50) 均顯著低于單物種毒性實驗的毒性數據(t檢驗，P＜0.05)，其中微宇宙毒性實驗數據平均值總體降低了56%，表明物種在種間關系的影響下對污染物更為敏感；同時構建了單物種與微宇宙毒性實驗所得毒性值的回歸模型，發現該模型可以較好地通過單物種毒性實驗所得毒性值對微宇宙毒性實驗的毒性值進行預測(P＜0.05).