長鏈非編碼RNA HOX轉錄反義RNA對微小RNA-519c-3p/骨形成蛋白Ⅱ型受體調控骨關節炎進展作用及分子機制

范忠誠, 王琮仁, 符策崗, 陳曉峰

1.中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院 骨科中心,海南 海口 570208;2.海口市骨科與糖尿病醫院 骨科中心,海南 海口 570208

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是由關節軟骨缺陷引起的關節疾病[2]。OA是老年人常見的關節疾病,常導致疼痛和功能限制,最終降低生活質量[2]。然而,OA的分子發病機制尚不明確,因此,治療策略的發展受到限制[3]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)是一類長度>200 nt的RNA。大量研究報道,多種失調的LncRNA參與了OA的發生發展[4-7]。LncRNA HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)位于12q13.13,是具有反式作用的LncRNA[8]。已有研究證實,LncRNA HOTAIR上調可促進腫瘤細胞生長、集落形成、遷移和侵襲[7]。但其在OA發病中的潛在分子機制尚處于初步探索階段[9]。本研究旨在探討LncRNA HOTAIR/miR-519c-3p/骨形成蛋白Ⅱ型受體(bone morphogenetic protein receptor 2,BMPR2)信號軸在OA進展中的作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。脂多糖購自北京索萊寶公司;SYBR Premix Ex Taq GC試劑盒購自TAKARA公司;雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司;CCK-8試劑購自TargetMol公司。

1.2 研究方法

1.2.1 微小RNA-519c-3p過表達 細胞接種于6孔板過夜培養后,微小RNA-519c-3p(microRNA-519c-3p,miR-519c-3p)過表達慢病毒轉染細胞,24 h后獲得miR-519c-3p過表達細胞系。

1.2.2 酶聯免疫吸附劑測定 在4℃條件下于平板上包被抗體過夜,封閉后將上清樣品加入孔中與抗體進行孵育。進行顯色,終止后測定450 nm波長處吸光光度值。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測 TRIzol RNA試劑提取總RNA,檢測RNA濃度后逆轉錄成cDNA,通過SYBR Premix Ex Taq GC試劑盒進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)。

1.2.4 蛋白質印跡 細胞樣品冰上裂解后,BCA試劑盒測定濃度,上樣30 μg聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉印至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入一抗后于4℃孵育過夜。次日復溫清洗后二抗孵育2 h,顯影檢測蛋白表達。抗體均購于Abcam公司。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗 根據預測的結合位點設計引物,并構建LncRNA HOTAIR野生型和突變型雙熒光素酶載體。各組細胞轉染48 h后,參照試劑盒操作說明檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 LncRNA HOTAIR負向調控miR-519c-3p的表達 ENCORI網站預測LncRNA HOTAIR可能與miR-519c-3p結合(圖1a)。雙熒光素酶報告實驗顯示,與HOTAIR-WT質粒共轉染時,miR-519c-3p組熒光素酶活性低于對照組,組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與HOTAIR-MUT質粒共轉染時,對照組與miR-519c-3p組熒光素酶活性比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1b。RIP實驗檢測結果顯示,miR-519c-3p組細胞與Ago2抗體結合的樣品中LncRNA HOTAIR的富集顯著(P<0.05,圖1c)。LncRNA HOTAIR在生物素化的miR-519c-3p的吸附物中也顯著富集(P<0.05,圖1d)。qRT-PCR結果顯示,si-HOTAIR組miR-519c-3p的相對表達量高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05,圖1e);HOTAIR組miR-519c-3p的相對表達量低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05,圖1f)。

圖1 LncRNA HOTAIR負向調控miR-519c-3p的表達(a.生物信息學網站預測位點;b.細胞中的熒光素酶活性;c.Ago2在不同組細胞中富集LncRNA HOTAIR;d.生物素在不同組細胞中富集LncRNA HOTAIR;e.si-HOTAIR組miR-519c-3p的相對表達情況;f.HOTAIR組miR-519c-3p的相對表達情況)

2.2 miR-519c-3p的過表達抑制了人軟骨細胞OA的進展 qRT-PCR結果顯示,轉染miR-519c-3p模擬物后,miR-519c-3p組miR-519c-3p相對表達量高于NC組,差異有統計學意義(P<0.05,圖2a)。CCK-8實驗結果顯示,與NC組比較,miR-519c-3p組軟骨細胞增殖速度變慢(P<0.05,圖2b)。qRT-PCR結果顯示,與NC組比較,miR-519c-3p過表達后,細胞中降基質金屬蛋白酶(matrix metallopeptidase,MMP)3、MMP9、MMP13、含Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif,ADAMTS)4、ADAMTS5及促炎因子白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的mRNA水平顯著降低,而COL2A1、SOX9和Aggrecan的mRNA水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05,圖2c、d)。蛋白質印跡(western blot,WB)結果顯示,與NC組比較,miR-519c-3p組MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS4、ADAMTS5蛋白表達水平降低,COL2A1、SOX9蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05,圖2e)。酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)結果顯示,與NC組比較,miR-519c-3p組的IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低,差異有統計學意義(P<0.05,圖2f)。

圖2 miR-519c-3p過表達抑制人軟骨細胞OA的進展(a.miR-519c-3pRNA的表達水平;b.各組細胞的生長情況;c.各組細胞中OA相關基因的mRNA表達水平;d.OA相關基因在不同組細胞中的mRNA表達水平;e.各組細胞中OA相關基因的蛋白表達水平;f.各組細胞上清中促炎因子的表達水平)

2.3 miR-519c-3p負向調控BMPR2的表達 生物信息學網站TargetScanHuman預測BMPR2是miR-519c-3p的下游靶點(圖3a)。雙熒光素酶報告的結果如下:miR-NC或miR-519c-3p 與BMPR2-WT共轉染細胞后,NC組熒光素酶活性高于miR-519c-3p組,差異有統計學意義(P<0.05),但二者與BMPR2-MUT共轉染組間的熒光素酶活性比較,差異無統計學意義(P>0.05,圖3b)。qRT-PCR結果及WB結果發現,miR-519c-3p過表達后,miR-519c-3p組BMPR2的mRNA及蛋白表達水平低于NC組,差異有統計學意義(P<0.05);miR-519c-3p表達被抑制后,miR-519c-3p sponge組的BMPR2的mRNA及蛋白表達水平高于miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3c、d。此外,當細胞過表達LncRNA HOTAIR后,HOTAIR組的BMPR2的mRNA及蛋白表達水平高于Control組,差異均有統計學意義(P<0.05);LncRNA HOTAIR表達被抑制后,siHOTAIR組的BMPR2的mRNA及蛋白表達低于siNC組,差異有統計學意義(P<0.05,圖3e、f)。

圖3 miR-519c-3p負向調控BMPR2的表達(a.生物信息學網站TargetScanHuman 8.0預測二者結合位點;b.各組細胞熒光素酶活性;c.miR-519c-3p過表達及被抑制后不同組細胞BMPR2的mRNA水平;d.miR-519c-3p過表達及被抑制后不同組細胞BMPR2的蛋白水平;e.LncRNA HOTAIR過表達及被抑制后不同組細胞BMPR2的mRNA水平;f.LncRNA HOTAIR過表達及被抑制后不同組細胞BMPR2的蛋白水平)

2.4 LncRNA HOTAIR通過miR-519c-3p/BMPR2調控人軟骨細胞OA的進展 與NC組比較,si-HOTAIR組BMPR2表達水平降低,而si-HOTAIR+miR-519c-3p sponge組BMPR2的RNA水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05,圖4a)。WB結果趨勢相同(圖4b)。

圖4 LncRNA HOTAIR通過miR-519c-3p/BMPR2調控人軟骨細胞OA的進展(a.不同組細胞BMPR2的mRNA水平比較;b.不同組細胞BMPR2的蛋白水平比較;c.不同組細胞活力比較;d.不同組細胞降解酶及促炎因子的基因mRNA相對表達量比較;e.不同組細胞軟骨標志基因mRNA相對表達量比較;f.不同組細胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平比較)

CCK-8實驗結果顯示,與NC組比較,si-HOTAIR組增殖變慢,si-HOTAIR+miR-519c-3p sponge組細胞增殖變快(P<0.05)。與 NC組比較,miR-519c-3p組細胞增殖變慢,miR-519c-3p+BMPR2組細胞增殖變快(P<0.05)。見圖4c。

qRT-PCR結果顯示,與NC組比較,si-HOTAIR組中降解酶(MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5)及促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的基因mRNA相對表達量顯著降低,而軟骨細胞標志基因COL2A1、SOX9和Aggrecan的mRNA相對表達量上調(P<0.05);與si- HOTAIR組比較,si-HOTAIR+miR-519c-3p sponge組細胞的降解酶和促炎因子的基因mRNA相對表達量升高,軟骨標志基因mRNA相對表達量卻下調(P<0.05)。同樣,qRT-PCR結果顯示,與NC組比較,miR-519c-3p組降解酶和促炎因子基因mRNA相對表達量降低,軟骨標志基因mRNA相對表達量增加(P<0.05);但與miR-519c-3p組比較,miR-519c-3p+BMPR2組細胞的降解酶和促炎因子的基因mRNA相對表達量升高,軟骨標志基因mRNA相對表達量下調(P<0.05)。見圖4d、e。

ELISA實驗結果顯示,促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α在不同組別中的表達水平表現出與各促炎因子基因mRNA相對表達量相同的趨勢(圖4f)。這些結果提示,LncRNA HOTAIR通過miR-519c-3p/BMPR2調控人軟骨細胞OA的進展。

3 討論

LncRNA HOTAIR在癌癥生物學中具有重要的致癌作用[9]。近年來,有研究報道,LncRNA HOTAIR在OA病理中具有多種功能[9-10]。本研究闡明了LncRNA HOTIAR/miR-519c-3p/BMPR2軸在調節OA進展中的作用。

本研究利用生物信息學網站ENCORI分析LncRNA HOTAIR潛在的下游分子miR-519c-3p,雙熒光素酶報告實驗和RIP實驗證實了miR-519c-3p可與LncRNA HOTAIR相結合,qRT-PCR和WB結果發現LncRNA HOTAIR和miR-519c-3p的表達呈負相關。這提示LncRNA HOTAIR可以靶向調控下游miR-519c-3p的表達。

有研究報道,miR-519c-3p可通過靶向BTG3促進肝癌的生長和轉移[11]。此外,抑制LncRNA NEAT1通過調節miR-519c-3p/MeCP2軸促進黑色素瘤細胞對順鉑的敏化[12]。但miR-519c-3p在OA中的作用少見報道。本研究結果發現,miR-519c-3p過表達后,軟骨細胞生長變慢,降解酶(MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5)及促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平降低,而COL2A1和SOX9水平升高,這提示miR-519c-3p可以抑制OA進展。鑒于過往LncRNA HOTAIR可促進OA進展的研究[10],這提示miR-519c-3p和LncRNA HOTAIR在OA的進展上具有拮抗作用,這也與LncRNA HOTAIR負向調控miR-519c-3p表達的結論相符。

miRNA家族構成了精密的調控網絡[13]。本研究利用生物信息學和雙熒光素酶報告基因實驗預測并證實miR-519c-3p、BMPR2相互結合。上調miR-519c-3p表達后BMPR2表達降低;反之miR-519c-3p被抑制后BMPR2的表達增高。這提示,miR-519c-3p不僅可以與BMPR2結合,并可調控其表達水平。此外,本研究結果顯示,LncRNA HOTAIR表達被抑制后,BMPR2表達下調;LncRNA HOTAIR過表達后,BMPR2表達隨之增高。基于LncRNA HOTAIR對miR-519c-3p的負調控作用,這提示LncRNA HOTAIR通過下調miR-519c-3p水平削弱了miR-519c-3p對BMPR2的抑制。綜上,miR-519c-3p可以負向調控BMPR2的表達。

本研究結果發現,LncRNA HOTAIR干擾的軟骨細胞中感染miR-519c-3p sponge,可以逆轉干擾LncRNA HOTAIR對BMPR2的下調,這提示BMPR2的表達被LncRNA HOTAIR顯著激活,而被miR-519c-3p抑制。BMPR2對于軟骨的形成以及關節修復具有重要的影響[14]。本研究通過回補實驗也進一步驗證了miR-519c-3p通過靶向BMPR2軸調控軟骨細胞生長、降解酶及促炎因子的分泌,這提示,LncRNA HOTAIR不僅調控下游miR-519c-3p/BMPR2的表達,更通過miR-519c-3p/BMPR2途徑調控OA的進展。

綜上所述,LncRNA HOTAIR可通過miR-519c-3p/BMPR2軸調控OA的進展。本研究為闡明OA進展的分子機制、篩選OA特異性生物標志物提供重要依據。