甲維鹽提純工藝優(yōu)化研究

王鴻發(fā)，郭佳，李芳，王少云

(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750205)

0 引言

甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽(簡(jiǎn)稱“甲維鹽”)是以阿維菌素為初始原料進(jìn)行合成的一種新型抗生素，其主要成分包括甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽Bla 和Blb 的混合物。顏色為淡黃色、白色結(jié)晶粉末。易溶于丙酮、乙醇、甲醇等極性溶劑，微溶于水，水中溶解度(20 ℃，pH=7.0)0.024 g/L，(20 ℃，pH=3.0)0.003 g/L，不溶于己烷。在常溫常壓下，甲維鹽的穩(wěn)定性較好，對(duì)熱不敏感，但在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)光、強(qiáng)氧化劑的極端條件下不穩(wěn)定。甲維鹽作為阿維菌素半合成衍生物，其結(jié)構(gòu)與阿維菌素類似，但生物活性相比阿維菌素提高了1～3 個(gè)數(shù)量級(jí)。尤其是對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)、稻縱卷葉螟等活性極高。在蔬菜、水稻等大田農(nóng)作物中應(yīng)用更為廣泛，已有報(bào)道顯示，甲維鹽主要的殺蟲(chóng)方式有胃毒和觸殺，即當(dāng)生物體接觸該藥后，可通過(guò)滲透作用進(jìn)入微生物體，發(fā)揮藥效，達(dá)到殺蟲(chóng)的目的。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

YP4002 電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；waters2487 型HPLC(江蘇塞恩斯科技有限公司)；HK-3C 型酸度計(jì)廠家為北京海富達(dá)科技有限公司，HS-DHG 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海和晟儀器科技有限公司)；pH 計(jì)；溫度計(jì)。

1.2 試劑

甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、乙酸異戊酯、鹽酸等試劑均由天津市凱通化學(xué)試劑有限公司提供分析純?cè)噭?/p>

2 材料與方法

2.1 材料

甲維鹽粗品由寧夏泰益欣生物科技股份有限提供。

2.2 方法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

溶解：精準(zhǔn)稱量甲維鹽粗品適量，選用水、甲醇、乙醇、丙酮等溶劑進(jìn)行溶解；

萃取：以甲維鹽粗品的溶解液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，篩選乙酸乙酯、石油醚、乙酸異丙酯等溶劑中最佳萃取劑，同時(shí)篩選萃取壓力、萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)甲維鹽純度和收率的影響；

分離：加入萃取劑的甲維鹽溶液經(jīng)充分?jǐn)嚢韬箪o置分層，篩選對(duì)甲維鹽收率和純度影響最小的分離壓力及分離溫度，分離所得萃取液；

結(jié)晶：將萃取液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮結(jié)晶，獲得甲維鹽成品。

2.2.2 檢測(cè)方法

采用單因素分析方法探究各因素對(duì)甲維鹽收率及含量的影響，并建立了HPLC 法測(cè)定甲維鹽的含量。色譜條件：WondaSil C18-WR 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為水-乙腈(3∶7)；流速1.0 mL/min，波長(zhǎng)為280 nm。

3 結(jié)果與分析

3.1 溶解劑對(duì)甲維鹽純化的影響

甲維鹽在純化過(guò)程中需要先進(jìn)行溶解，而不同溶劑對(duì)甲維鹽的溶解程度存在較大的影響。因此，在其他條件不變的情況下，考察水、甲醇、乙醇、丙酮等溶解劑的溶解效果，篩選最優(yōu)溶解劑。具體結(jié)果如圖1所示。

圖1 溶解劑對(duì)甲維鹽收率和含量的影響

由圖1 可知，溶解劑中乙醇和丙酮對(duì)甲維鹽的收率和純度影響較大，其中丙酮作為溶解劑時(shí)，甲維鹽的收率和純度均為最大值，但由于丙酮揮發(fā)性強(qiáng)、具有堅(jiān)強(qiáng)的毒性，對(duì)人體有害，而乙醇為常見(jiàn)試劑，對(duì)人體的危害較小，安全系數(shù)高，因此，可以選擇乙醇作為溶解劑。

3.2 萃取溶劑對(duì)甲維鹽純化的影響

萃取是采用一種溶劑將甲維鹽溶液中的甲維鹽溶解，分層并分離獲得甲維鹽萃取液，但是不同的萃取溶劑對(duì)甲維鹽的溶解效果存在較大的差異。篩選一種較好的萃取劑可以有效提升甲維鹽的純度。本次實(shí)驗(yàn)篩選萃取劑為乙酸乙酯、乙酸異丙酯、石油醚。具體結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知，本研究所用的三種萃取劑所得的甲維鹽的收率基本持平，但含量差異較大，乙酸乙酯的含量達(dá)到最大值，因此，以乙酸乙酯為萃取劑進(jìn)行后續(xù)條件篩選的單因素實(shí)驗(yàn)。

圖2 萃取劑對(duì)甲維鹽收率和含量的影響

3.3 萃取壓力對(duì)甲維鹽純化的影響

萃取過(guò)程中，壓力的變化能夠影響萃取的結(jié)果，也可以對(duì)甲維鹽成品結(jié)果產(chǎn)生影響，因此，稱取適量的甲維鹽粗品，共設(shè)8 個(gè)壓力梯度，分別為5 Pa、10 Pa、15 Pa、20 Pa、25 Pa、30 Pa、35 Pa、40 Pa，其余條件不變的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 萃取壓力對(duì)甲維鹽收率和含量的影響

由圖3 可知，隨著萃取壓力的逐漸變大，甲維鹽純度和收率均為上升的趨勢(shì)，當(dāng)萃取壓力小于30 Pa時(shí)，無(wú)論是甲維鹽的收率還是純度，都比較小，提純效果差；當(dāng)萃取壓力增大到30 Pa 時(shí)，提純效果較佳，當(dāng)萃取壓力在30～40 Pa 之間時(shí)，收率和純度的變化基本保持平穩(wěn)，因此，萃取壓力可以確定為30～40 Pa。由于萃取壓力為30 Pa、35 Pa、40 Pa 時(shí)，提純效果幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，如果從安全和經(jīng)濟(jì)成本角度考慮，可以選擇低壓力30 Pa。

3.4 萃取溫度對(duì)甲維鹽純化的影響

稱取適量的甲維鹽粗品，加入乙醇溶解劑，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取壓力分別為30 Pa，萃取溫度分別設(shè)置為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50℃、55℃，其他條件不變的情況下進(jìn)行單因素驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。具體結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 萃取溫度對(duì)甲維鹽收率和含量的影響

由圖4 可知，萃取溫度對(duì)提純效果的影響小于萃取壓力。萃取溫度在40 ℃以下時(shí)，萃取效果較差；當(dāng)溫度增大到40 ℃時(shí)，萃取效率明顯增大；當(dāng)溫度增大到40 ℃時(shí)，萃取效果最佳，繼續(xù)增大溫度，收率和純度都逐漸減小，這可能是由于高溫對(duì)甲維鹽的結(jié)構(gòu)造成了影響，導(dǎo)致小部分甲維鹽發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成其他物質(zhì)。因此可以選擇40 ℃左右的萃取溫度。

3.5 萃取時(shí)間對(duì)甲維鹽純化的影響

在生產(chǎn)過(guò)程中，萃取時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)純度、收率和產(chǎn)量均有直接影響，萃取時(shí)間短，可能會(huì)導(dǎo)致萃取不徹底，影響收率和純度，萃取過(guò)程消耗的時(shí)間長(zhǎng)，可能造成時(shí)間的浪費(fèi)，影響最終的進(jìn)度和產(chǎn)量，因此稱取適量甲維鹽粗品，用乙醇溶解，加入乙酸乙酯萃取，萃取壓力為30 Pa，萃取溫度為40 ℃，設(shè)置7 個(gè)萃取時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行驗(yàn)證，分別為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h。具體結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 萃取時(shí)間對(duì)甲維鹽收率和含量的影響

由圖5 可知，萃取時(shí)長(zhǎng)小于2.5 h 時(shí)，甲維鹽的收率和純度隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，增大幅度顯著；當(dāng)萃取時(shí)長(zhǎng)大于等于2.5 h 時(shí)，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，收率和純度基本趨于穩(wěn)定，綜合各生產(chǎn)因素，萃取時(shí)間確定為2.5 h。

3.6 分離壓力對(duì)甲維鹽純化的影響

稱取適量的甲維鹽粗品，用乙醇溶解，加入乙酸乙酯萃取，萃取壓力分別為30 Pa，萃取溫度為40 ℃，共設(shè)置7 個(gè)分離壓力，分別為0.1 Pa、2 Pa、4 Pa、6 Pa、8 Pa、10 Pa、12 Pa，萃取時(shí)間為2.5 h，其余條件不變進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。具體結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 分離壓力對(duì)甲維鹽收率和純度的影響

由圖6 可知，分離壓力為4 Pa 時(shí)，效果最佳，當(dāng)分離壓力小于4 Pa，收率增大，甲維鹽純度下降，這可能是由于分離的樣品中含有一部分雜質(zhì)；當(dāng)分離壓力大于4 Pa 時(shí)，收率和純度都有所下降，這可能是流體中一部分甲維鹽沒(méi)有在分離釜中徹底分離。由于分離壓力對(duì)提純結(jié)果影響較小，因此在后續(xù)的正交試驗(yàn)中分離壓力可以取4 Pa。

3.7 分離溫度對(duì)甲維鹽純化的影響

稱取適量的甲維鹽粗品，用乙醇進(jìn)行溶解，加入乙酸乙酯萃取，萃取壓力為30 Pa，萃取溫度為40 ℃，分離壓力為4 Pa，萃取時(shí)間為2.5 h，分離溫度分別設(shè)置為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃進(jìn)行驗(yàn)證。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 分離溫度對(duì)甲維鹽收率和純度的影響

由圖7 可知，在其他條件不變時(shí)，隨著溫度的提升甲維鹽的純度和收率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)分離溫度在40 ℃時(shí)，甲維鹽的收率和純度達(dá)到峰值，依據(jù)最優(yōu)值選擇，分離溫度確定為40 ℃。

3.8 工藝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)以上單因素實(shí)驗(yàn)，確定了甲維鹽純化過(guò)程中的7 個(gè)參數(shù)，具體工藝參數(shù)如下：溶解劑為乙醇，萃取劑為乙酸乙酯，萃取壓力為30 Pa，萃取溫度為40 ℃，萃取時(shí)間為2.5 h，分離壓力為4 Pa，分離溫度為40 ℃。以所得最優(yōu)工藝進(jìn)行5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其工藝的穩(wěn)定性。

由表1 可知，5 次平行試驗(yàn)得到的甲維鹽平均收率在80.18%；甲維鹽B1 純度平均值為94.06%。5 次平行實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.08%和0.11%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均較低，表明該工藝合理可行。

表1 工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)甲維鹽純化過(guò)程中的溶解劑、萃取劑、萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、分離壓力和分離溫度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，每個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)中最適參數(shù)對(duì)甲維鹽收率、純度均有影響，通過(guò)此工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證，甲維鹽純化后的收率達(dá)到80.18%，純度達(dá)到了94.06%。能夠萃取壓力為30 Pa，萃取溫度為40 ℃，分離壓力為4 Pa，分離溫度為40 ℃，萃取時(shí)間為2.5 h，其他參數(shù)若需要精確細(xì)化可繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。