不同藥敏試驗方法檢測耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌對替加環素敏感性的效能評價*

謝國艷,周林艷,梁 斌,裴凌燕,王禹婷,李鳳嬌,劉慶中△

上海中醫藥大學附屬市中醫醫院:1.檢驗科;2.病理科,上海 200071

替加環素是美國食品和藥物管理局(FDA)批準應用于臨床的首個甘氨酰四環素類抗菌藥物,其抗菌譜廣,抗菌活性強,能夠治療多重耐藥(MDR)革蘭陰性和革蘭陽性細菌引起的感染[1-2]。在當前耐藥菌廣泛流行的背景下,替加環素已成為這些病原菌感染治療的一線藥物[3],但隨著使用量的增加其耐藥率也隨之升高[1]。因此,根據藥物敏感性試驗(簡稱藥敏試驗)結果正確選擇替加環素用于感染治療,對減少和延緩細菌耐藥性的產生至關重要。

目前,替加環素體外藥敏試驗方法主要有肉湯微量稀釋(BMD)法和紙片擴散(KB)法,其中BMD法為參考方法[4]。雖然歐洲抗菌藥物敏感性測試委員會(EUCAST)、FDA和英國抗菌化療協會(BSAC)制定了適合少量菌種(大腸埃希菌和柯氏枸櫞酸桿菌)對替加環素敏感性的最低抑菌濃度(MIC)折點,但至今美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)仍缺乏相應的判讀標準[4]。研究顯示,不同的藥敏試驗方法檢測替加環素的敏感性會存在差異,導致對其耐藥性的判斷出現錯誤[2]。BMD法結果雖然準確,但操作煩瑣,臨床上不易常規實行。因此,尋找簡便易行、結果可靠的替代方法勢在必行。本研究即擬評估臨床上可用的儀器法、E-test法及KB法檢測耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌對替加環素的敏感性,評估其與參考方法BMD法的一致性,以期獲得不同菌種對應的最佳檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料來源 收集本院2020年8月至2022年3月臨床分離的非重復耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌211株(其中肺炎克雷伯菌96株、鮑曼不動桿菌62株、大腸埃希菌48株和陰溝腸桿菌5株)。藥敏試驗質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922由上海市臨床檢驗中心提供。

1.2儀器與試劑 所有菌株經Vitek2 Compact全自動微生物鑒定儀鑒定,亞胺培南和/或美羅培南耐藥性由配套藥敏卡檢測并經KB法確認。Vitek2 Compact全自動細菌鑒定儀及配套GN335藥敏卡為法國梅里埃公司產品,替加環素標準品購自國家衛生健康委食品藥品鑒定所,替加環素藥敏紙片(15微克/片)為英國Oxoid公司產品,替加環素E-test試紙條為溫州市康泰生物科技有限公司產品、水解酪蛋白(MH)肉湯為廣東環凱微生物科技有限公司產品,水解酪蛋白瓊脂(MH)平板購自上海伊華醫學科技有限公司,替加環素緩沖液購自上海原科實業發展有限公司。

1.3試驗方法 按照美國CLSI推薦的操作[4]進行。判讀實驗結果時質控菌株ATCC 25922的抑菌圈直徑范圍應為20～27 mm,MIC值范圍應為0.03～0.25 μg/mL,以證明在控[4]。

1.3.1BMD法 將替加環素倍比稀釋成0.062 5～32.000 0 μg/mL系列濃度的工作液,分別加入96孔無菌培養板,每孔100 μL,調節菌液至1.0×106CFU/mL,每孔加入100 μL,混勻,35 ℃培養16～20 h后觀察結果,孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度即為MIC值[4]。

1.3.2KB法 調節菌液至0.5麥氏濁度單位,涂布于MH平板,待表面干后貼兩張替加環素紙片于瓊脂表面,其中一張紙片加6 μL替加環素復敏液(KB1法),另一張紙片不加替加環素復敏液(KB2法),35 ℃培養16～18 h,測量抑菌圈直徑。

1.3.3儀器法 用Vitek 2 Compact全自動鑒定儀及GN335藥敏卡進行藥敏試驗,具體操作參照說明書,儀器軟件自動判讀MIC值。

1.3.4E-test法 操作同KB法,將紙片換成E-test試紙條,標有刻度的一面向上貼于瓊脂表面,35 ℃培養16～20 h,讀取橢圓型抑菌圈與試紙條交界處刻度值,即為MIC值。

1.4判讀標準 替加環素的敏感性參照FDA推薦的判斷標準[5],見表1。

表1 替加環素敏感性的判定標準

1.5統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。計數資料以頻數或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。各種被評估方法與參考方法(BMD法)比較分析參數如下,Kappa值(κ>0.750表示一致性好,κ<0.400表示一致性差);基本一致率(EA):被評估方法與參考方法所得MIC值相同或相差上下一個濃度梯度的菌株百分率;分類一致率(CA):被評估方法與參考方法的符合率;微小誤差(mE):參考方法結果為敏感或耐藥,被評估方法為中介;重大誤差(ME):被評估方法將敏感判定為耐藥;非常重大誤差(VME):被評估方法將耐藥判定為敏感。根據美國CLSI要求,可接受誤差范圍為:EA和CA≥90%,VME≤1.5%,ME≤3%,mE≤10%[6]。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1BMD法檢測耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌的MIC值 96株肺炎克雷伯菌對替加環素的MIC50值(抑制50%菌株生長所需的MIC值)和MIC90值(抑制90%菌株生長所需的MIC值)分別為1.0、2.0 μg/mL,62株鮑曼不動桿菌的MIC50值和MIC90值分別為0.5、2.0 μg/mL,48株大腸埃希菌的MIC50值和MIC90值分別為0.5、1.0 μg/mL,5株陰溝腸桿菌的MIC50值和MIC90值分別為0.5、2.0 μg/mL。各菌種對替加環素MIC值的分布見表2。

表2 BMD法檢測各菌種對替加環素的MIC值分布(n)

2.2兩種KB法檢測各菌種對藥敏試驗替加環素結果的比較 對于肺炎克雷伯菌,兩種KB法檢測的藥敏結果比較差異均有統計學意義(P<0.05);對于鮑曼不動桿菌,兩種KB法的敏感率比較差異有統計學意義(P<0.05);而對于大腸埃希就和陰溝腸桿菌,兩種KB法的結果比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.34種被評估方法與BMD法檢測耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌對替加環素的藥敏試驗結果比較 4種被評估方法檢測大腸埃希菌和陰溝腸桿菌對替加環素的藥敏試驗結果與BMD法比較差異均無統計學意義(P>0.05);E-test法檢測肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌對替加環素的藥敏試驗結果與BMD法比較差異均無統計學意義(P>0.05);KB1法檢測鮑曼不動桿菌中介株對替加環素的藥敏試驗結果與BMD法比較差異有統計學意義(P<0.05);儀器法和KB2法檢測肺炎克雷伯菌(敏感、中介、耐藥株)和鮑曼不動桿菌(敏感、中介株)對替加環素的藥敏試驗結果與BMD法比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4種被評估方法與BMD法檢測各菌種對替加環素藥敏試驗結果比較[n(%)]

2.44種被評估方法與BMD法藥敏試驗結果的一致性比較 4種被評估方法與BMD法檢測結果相比較,均未發現VME。E-test法檢測4種細菌的藥敏試驗結果與BMD法相比,一致性好(κ>0.750),EA(94.8%～100.0%)、CA(91.7%～100%)和mE(0.0%～3.2%)均在可接受范圍,未發現ME和VME。儀器法檢測大腸埃希菌和陰溝腸桿菌的藥敏試驗結果與BMD法一致性好(κ=0.751、1.000),而對肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌則一致性較差(κ=0.209、0.316),具有較高的ME(4.2%和3.2%),尤其對鮑曼不動桿菌還同時存在mE偏高(11.3%)。KB1法檢測4種細菌的藥敏試驗結果與BMD法的κ>0.750,EA、CA、mE、ME和VME均在可接受范圍,而KB2法除大腸埃希菌外(κ=0.639),對其余菌種檢測結果與BMD的一致性都不理想(κ<0.400)。見表4。

表4 4種被評估方法與BMD法藥敏試驗結果的一致性比較

3 討 論

隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用,細菌的耐藥率不斷增高,從而給該類抗菌藥物的選擇造成較大限制。替加環素針對臨床上的MDR菌具有很高的活性,它可與細菌核糖體30S亞基結合,將氨酰-tRNA阻擋在核糖體A位外,從而阻礙細菌蛋白質的合成,被認為是治療該類細菌嚴重感染的最后有效措施[7-8]。臨床上,正確應用替加環素需要可靠的藥敏試驗方法進行指導,探尋便于實驗室常規開展且結果可靠的替加環素敏感性檢測方法尤為必要。有研究表明,FDA的替加環素敏感性判定折點優于EUCAST[9-10],因此本研究采用FDA的判讀標準來評估各種方法檢測各菌種對替加環素藥敏試驗結果的可靠性。

BMD法被稱為藥敏試驗的“金標準”,可以準確、標準化地定量測定菌株對抗菌藥物的MIC值,但對于大批量菌株的藥敏試驗,由于需要嚴格保證MH肉湯為新鮮配制[11],工作量大,耗時較長,臨床上不易常規開展。E-test法操作簡便、結果直觀,適用于單個樣本的檢測[12],是傳統基于稀釋藥敏試驗方法的便捷替代品。本研究結果顯示,E-test法檢測耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌對替加環素的敏感性與BMD法具有非常好的一致性(κ>0.750),EA、CA、ME、mE、VME等評價指標均在可接受范圍內,且所研究的4種細菌的藥敏試驗結果與BMD法比較均無明顯差異,適合對替加環素敏感性的檢測。E-test法檢測價格較貴,難以在臨床上大批量常規開展,但在常規方法不能準確檢測藥敏結果時,該方法不失為一種可靠的復檢手段。

當前,微生物實驗室常規開展藥敏試驗最多采用的是儀器法和KB法。儀器法高效、便捷,受到微生物檢測人員青睞。本研究結果顯示,儀器法檢測大腸埃希菌和陰溝腸桿菌對替加環素的敏感性結果與BMD法具有較好的一致性,各項評價指標均在可接受范圍;但檢測肺炎克雷伯菌時替加環素的敏感率明顯低于BMD法(P<0.05),而中介率和耐藥率明顯高于BMD法(P<0.05);檢測鮑曼不動桿菌時替加環素的敏感率明顯低于BMD法(P<0.05),中介率明顯高于BMD法(P<0.05);這兩種細菌的儀器法結果與BMD法相比,一致性較差(κ<0.40),且評價指標超出范圍不可接受(肺炎克雷伯菌ME為4.2%,鮑曼不動桿菌mE為11.3%、ME為3.2%),提示對儀器法檢測的上述兩種細菌的替加環素藥敏試驗結果需謹慎解讀,這一結論與文獻報道一致[6,12]。

KB法操作簡便、成本低廉,為臨床使用最多的藥敏試驗方法之一。研究顯示,替加環素理化性質活潑,KB法的藥敏試驗結果判定易受實驗條件中的光照、氧氣含量、實驗時間等因素影響[8]。本研究通過比較常規KB法(KB2法)結果與BMD法,發現二者的一致性均不理想(大腸埃希菌κ=0.639,其他κ<0.400),除了大腸埃希菌的評價指標在可接受范圍(陰溝腸桿菌的mE為20%,超出評價范圍),其余細菌的評價指標均不可接受。本研究結果進一步印證了常規KB法不適合檢測肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌對替加環素敏感性的結論[6,11-12]。另外,本研究還采用了在常規KB法的基礎上滴加替加環素復敏液,即KB1法檢測細菌對替加環素的敏感性,復敏液為EDTA溶液,本身無抑菌作用,但可以消除替加環素抗菌活性的影響因素,恢復藥物的抗菌活性[8]。KB1法的藥敏試驗結果與BMD法表現出較好的一致性(κ>0.750),評價指標均在可接受范圍,除鮑曼不動桿菌的中介率比較差異有統計學意義(P=0.027)外,其余結果均與BMD法比較差異均無統計學意義(P>0.05),KB1法檢測肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌敏感株對替加環素的藥敏試驗結果明顯優于KB2法。對于鮑曼不動桿菌,KB1法的mE(9.7%)接近可接受范圍的上限,可能與此方法檢測該菌的中介率明顯增高有關(與BMD法比較差異有統計學意義),因此,當KB1法檢測到鮑曼不動桿菌中介株時,需通過定量檢測法再次確認。需要指出的是,本研究中陰溝腸桿菌菌株數量太少,需收集大樣本量的菌株進一步證實KB1法是否適用于其對替加環素的藥敏試驗檢測。

綜上所述,對于耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌,儀器法和KB1法可以常規檢測大腸埃希菌對替加環素的敏感性;而對于肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌,可以用KB1法檢測其對替加環素的敏感性;當KB1法在檢測鮑曼不動桿菌中介株時需謹慎對待,可通過簡便有效的E-test法進行復檢。