血清lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征、血清細胞凋亡分子和預后不良的關系研究*

申旭霞,趙超芬,袁 麗,張光杰,李 蘭

成都市第五人民醫院:1.檢驗科;2.婦科,四川成都 611130

卵巢癌是女性常見的一種惡性腫瘤,發病率位居婦科惡性腫瘤的第3位,但其病死率高居婦科腫瘤首位,嚴重威脅女性身心健康[1]。上皮性卵巢癌(EOC)缺乏特定癥狀和體征,且早期篩查項目較少,患者確診時多已為疾病晚期,預后及總體生存率較低[2]。因此,尋求有效的早期診斷指標對提高患者的生存率至關重要。有研究報道,循環血液中的長鏈非編碼核糖核酸(lncRNA)是由原發腫瘤分泌并釋放入血,lncRNA通過對靶基因的調控,在惡性腫瘤的發生過程中起到關鍵作用[3]。許多lncRNA被發現可調節卵巢癌的進展[4-5],lncRNA中的賴氨酰氧化酶樣1(LOXL1-AS1)與腫瘤的發生和侵襲有關,可作為多種腫瘤預后指標,但目前研究主要集中在乳腺癌、膀胱癌等[6-7];肺腺癌轉移性相關轉錄本1(MALAT1)在非小細胞肺癌轉移、增殖、侵襲過程中發揮重要的作用[8];但二者在卵巢癌中的作用研究較少。本研究通過探討血清lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1在EOC患者機體中的變化情況,分析其與臨床病理特征、血清凋亡細胞因子及預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年1月本院收治的68例EOC患者作為EOC組,國際婦產科聯盟(FIGO)分期Ⅰ～Ⅱ期接受EOC分期手術治療,Ⅲ～Ⅳ期接受腫瘤細胞減滅術治療。本研究經過本院醫學倫理委員會審核批準[倫(審)A201609022-09]。納入標準:(1)經手術病理證實為EOC;(2)符合手術適應證;(3)認知正常,能正常溝通;(4)無其他婦科病史;(5)術前3個月未接受放化療。排除標準:(1)心、肝、腎功能異常;(2)合并自身免疫性疾病;(3)伴嚴重軀體障礙;(4)不配合相關研究;(5)合并其他婦科疾病;(6)盆腔臟器手術史,接受過放化療。另選取70例卵巢良性腫瘤患者作為良性組,同期本院體檢健康者60例作為對照組。EOC組中,年齡(54.76±6.21)歲;體質量指數(BMI)(21.06±2.31)kg/m2;絕經18例;產次(2.81±0.30)次;病理類型:漿液性腺癌21例,黏液性腺癌19例,內膜性腺癌16例,其他12例;FIGO分期:Ⅰ～Ⅱ期28例,Ⅲ～Ⅳ期40例;淋巴結轉移:有38例,無30例。良性組中,年齡(54.91±6.12)歲;BMI(21.23±2.62)kg/m2;絕經14例;產次(2.75±0.32)次。對照組中,年齡(55.07±6.45)歲;BMI(20.98±2.98)kg/m2;絕經9例;產次(2.78±0.30)次。3組一般資料對比,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2方法

1.2.1病歷資料收集 收集EOC患者的臨床資料,包含年齡、BMI、產次、絕經情況、FIGO分期、病理類型、淋巴結轉移、組織分期等臨床基本資料。

1.2.2血清lncRNA檢測 利用血清分離膠真空采血管采集所有入組人員空腹外周血4 mL,4 ℃條件下靜置0.5 h,2 h內4 000 r/min離心10 min,取部分上清液,采用Trizol Reagent法提取血清總RNA,采用SMA 400UV-vis測定分離出的RNA濃度和純度,參照逆轉錄試劑盒進行RNA的逆轉錄,根據SYBR Green PCR試劑盒要求,在CFX96實時熒光定量PCR儀上檢測lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1表達水平。二者表達結果通過內參基因GAPDH均一化,并采用2-ΔΔCt計算患者血清中lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1的相對表達量。PCR反應體系:10 μL SYBR Green PTPCR Master Mix 2個,正向、反向引物共1.0 μL,模板RNA 2 μg,QuantiTectRT Mix 0.5 μL,ddH2O 0.5 μL。PCR的反應條件具體如下:95 ℃ 10 min,95 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共45個循環。本研究所用引物(廣州艾基生物技術有限公司)見表1。

表1 引物序列

1.2.3血清凋亡因子水平檢測 采集所有入組人員肘部靜脈血2 mL,常規離心(3 000 r/min,離心15 min,離心半徑15 cm),取上清液于-70 ℃冰箱保存,采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清中B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、生存素(Survivin)、B細胞CLI/淋巴瘤2關聯凋亡基因1(Bag-1)水平,所有操作均嚴格按照試劑盒要求進行,試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2.4預后情況 對比EOC患者預后情況,隨訪2年(或死亡),末次隨訪日期為2022年1月,隨訪方式為門診復查與電話隨訪。

2 結 果

2.13組受試者血清lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1及血清凋亡因子水平比較 血清lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1、Bcl-2、Survivin、Bag-1水平比較,EOC組均高于良性組(P<0.05),良性組均高于對照組(P<0.05);血清Bax水平比較,EOC組低于良性組(P<0.05),良性組低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 3組受試者血清lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1及血清凋亡因子水平比較

2.2lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1表達與EOC患者臨床病理特征的關系 以EOC組lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1表達水平中位值(1.90、1.38)分別將患者分為低表達組和高表達組。不同年齡和病理類型的EOC患者lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05),不同FIGO分期、淋巴結轉移、組織分期的EOC患者lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1表達與EOC患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1表達與EOC患者血清凋亡因子表達的關系 lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1高表達組Bcl-2、Survivin、Bag-1水平均高于lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1低表達組(P<0.05),Bax水平低于lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1低表達組(P<0.05)。見表4。

表4 lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1表達與EOC患者血清凋亡因子表達的關系

2.4EOC患者lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1表達與血清凋亡因子相關性 Pearson相關性分析結果顯示,EOC患者血清lncRNA LOXL1-AS1與lncRNA MALAT1表達水平與Bcl-2、Survivin、Bag-1均呈正相關(P<0.05),與Bax呈負相關(P<0.05)。見表5。

表5 EOC患者lncRNA LOXL1-AS1與lncRNA MALAT1表達水平與血清凋亡因子相關性

2.5EOC患者lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1表達與預后的關系 隨訪2年,lncRNA LOXL1-AS1低表達組累積生存率為85.29%(29/34),高于lncRNA LOXL1-AS1高表達組的55.88%(19/34),兩組比較差異有統計學意義(Log-rankχ2=8.365,P<0.001);lncRNA MALAT1低表達組累積生存率為81.82%(27/33),高于lncRNA MALAT1高表達組的60.00%(21/35),兩組比較差異有統計學意義(Log-rankχ2=6.364,P<0.001)。見圖1。

注:A、B分別為lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1高表達與低表達組生存曲線圖。

2.6EOC患者預后的多因素二元Cox比例風險回歸分析 回歸模型為多因素二元Cox比例風險回歸,因變量為EOC患者預后(賦值1=死亡,0=生存),參考前述各表比較結果,將患者年齡、病理類型、FIGO分期、淋巴結轉移情況、組織分期和血清中lncRNA LOXL1-AS1與lncRNA MALAT1表達水平作為自變量,回歸過程采用逐步后退法進行自變量篩選,α進=0.05,α出=0.10。結果顯示,淋巴結轉移、lncRNA LOXL1-AS1與lncRNA MALAT1高表達是EOC患者預后不良的獨立影響因素(P<0.05)。見表6。

表6 EOC患者預后的多因素二元Cox比例風險回歸分析結果

3 討 論

卵巢癌因發病位置特殊,且早期癥狀不顯著,發病較隱匿,多數患者就診時已處于疾病中、晚期,同時伴有不同程度腫瘤侵襲、轉移,不利于患者康復[9]。尋找卵巢癌早期診斷與預后的血清標志物已成為研究熱點。研究顯示,人類的遺傳物質中97%以上的轉錄產物是非編碼RNA,腫瘤的侵襲、轉移受到其調控,而lncRNA近年來被證實與腫瘤的發生、發展密切相關,如lncRNA MALAT1在肝癌、腸癌、膀胱癌、肺癌等惡性腫瘤中均異常表達,且與腫瘤發生、發展及生存率密切相關[10-11]。XUE等[12]研究顯示,lncRNA LOXL1-AS1通過調控miR-18b-5p與其靶基因Vacuolar ATP酶組裝因子VMA21軸促進卵巢癌細胞的生長、遷移和侵襲。LncRNA MALAT1雖不編碼蛋白,但可通過多種方式間接調控基因的表達,其表達異常與多種惡性腫瘤顯著相關[13-14]。本研究結果顯示,lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1在EOC組織中呈高表達,提示lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1參與了卵巢腫瘤細胞的生物學行為及EOC發病過程,在EOC發生、發展過程中可能發揮致癌作用,其表達水平升高可作為早期診斷EOC的輔助指標。為明確lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1與EOC患者臨床病理特征的關系,本研究根據lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1檢測結果,將患者分為高表達組和低表達組,結果顯示,EOC患者中lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1表達水平與年齡和病理類型無關,與FIGO分期、淋巴結轉移、組織分期有關,隨著淋巴結轉移、FIGO分期及組織分期增加,血清lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1呈高表達,證實lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1參與了EOC發生、發展過程,其表達水平升高可促進EOC的發展。分析原因,lncRNA LOXL1-AS1可通過抑制CAOV3細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲過程,誘導細胞凋亡[15];lncRNA MALAT1通過調控腫瘤相關信號通路,進而調控腫瘤的發生發展,還可降低細胞活力促進細胞凋亡[16]。

細胞凋亡在EOC的發生發展中發揮關鍵作用,Survivin是一種新的凋亡抑制蛋白,可直接與caspase作用,抑制caspase-3、caspase-7的活性,在EOC中呈高表達[17];Bcl-2在多種惡性腫瘤中表達不同,且與腫瘤的發生、發展及預后密切相關[18];Bax是促凋亡類蛋白,與Bcl-2形成異二聚體而發揮促細胞凋亡作用[19];Bcl-2、Bax、Survivin在EOC發生發展中分別發揮協同、拮抗作用。3組受試者血清Bcl-2、Survivin、Bag-1水平從高到低依次為EOC組、良性組、對照組,血清Bax水平從低到高依次為EOC組、良性組、對照組。此外,lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1高表達組Bcl-2、Survivin、Bag-1水平均高于lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1低表達組,Bax水平低于lncRNA LOXL1-AS1、lncRNA MALAT1低表達組。對上述凋亡因子與血清lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1相關性分析,結果顯示,血清lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1高表達與Bcl-2、Survivin、Bag-1均呈正相關,與Bax呈負相關,提示血清lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1表達水平升高,可增加Bcl-2、Survivin、Bag-1的表達,抑制Bax表達,促進疾病進展。

既往研究顯示,血清lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1表達水平還與EOC預后密切相關[20-21]。本研究通過對所有患者隨訪,計算生存率,并分析EOC預后的影響因素,結果顯示,隨訪2年后,lncRNA LOXL1-AS1低表達組累積生存率為85.29%,高于lncRNA LOXL1-AS1高表達組的55.88%,lncRNA MALAT1低表達組累積生存率為81.82%,高于lncRNA MALAT1高表達組的60.00%。淋巴結轉移、lncRNA LOXL1-AS1與lncRNA MALAT1高表達是EOC患者預后不良的獨立影響因素,提示血清lncRNA LOXL1-AS1與lncRNA MALAT1高表達患者生存時間較短,lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1高表達可作為評估EOC患者預后的重要指標。

綜上所述,EOC患者血清中lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1均呈高表達,二者與淋巴結轉移、FIGO分期、組織分期、凋亡因子表達及預后相關,可作為EOC診斷及預后治療的的輔助指標,其表達水平升高提示患者有EOC的可能,臨床應加強對上述指標的檢測。本研究存在一定的局限性,血清中lncRNA LOXL1-AS1及lncRNA MALAT1在EOC中的具體作用機制未明確,日后需進行更加深入的研究。