循環(huán)miR-27a-3p水平與新發(fā)皮質(zhì)下小梗死嚴重程度及短期神經(jīng)功能預后的關系*

周嬋娟,龍發(fā)青,王文菊,趙仕玉

1.海南省東方市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,海南東方 572600;2.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,海南海口 570311

腦小血管病(CSVD)是指影響大腦小動脈、微動脈、毛細血管和小靜脈的多種病理過程[1]。CSVD相關急性腦損傷的核心機制被認為是缺血,缺血通過小動脈狹窄或閉塞導致腦組織局灶性損傷,與結(jié)構或功能無關(如血管痙攣、自我調(diào)節(jié)受損或低血壓)[2]。新發(fā)皮質(zhì)下小梗死(RSSI)是CSVD的關鍵顱腦磁共振成像(MRI)特征之一[3]。CSVD的發(fā)病機制復雜,有研究認為其可能與內(nèi)皮功能障礙和血腦屏障破壞有關[4]。微小RNA(miRNA)是一類小的非編碼單鏈RNA(長度約為19～24個核苷酸),通過與信使轉(zhuǎn)錄本的互補區(qū)域結(jié)合來抑制翻譯并調(diào)節(jié)其靶mRNA的降解[5]。存在于生物體液中的miRNA高度穩(wěn)定,可作為癌癥、急性腦梗死和神經(jīng)退行性疾病的可靠標志物[6-10]。有研究顯示,急性缺血性腦梗死患者血清外泌體中miR-27a-3p呈高表達,而且通過miR-27a-3p/PPARγ軸加重腦部炎癥,進而影響患者預后[8]。miR-27a-3p被認為是腦小血管內(nèi)皮細胞磷酸二酯酶3a(PDE3A)的新型調(diào)節(jié)劑[11]。然而,miR-27a-3p作為重要的血管生成miRNA是否影響CSVD的發(fā)病鮮見相關研究。基于實驗室、影像學和臨床評估之間的相關性,本研究旨在探討循環(huán)miR-27a-3p與RSSI發(fā)病后14 d內(nèi)短期預后之間的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究為一項前瞻性研究,選取2018年5月至2021年6月海南省東方市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的RSSI患者153例作為RSSI組,另選取同期體檢健康者150例作為對照組。RSSI被定義為由單一穿支動脈閉塞引起的新發(fā)深部小梗死,導致其供血區(qū)腦組織缺血性壞死。納入標準:(1)年齡≤75歲;(2)首次發(fā)病,發(fā)病時間<48 h;(3)RSSI患者的MRI上表現(xiàn)出典型的腦梗死癥狀和體征,缺血性病灶<20 mm;(4)具有完整臨床、實驗室、影像學相關資料。排除標準:(1)頸動脈或顱內(nèi)動脈狹窄>50%,心源性卒中、既往心腦血管疾病;(2)合并嚴重肝或腎功能損傷及風濕免疫病和惡性腫瘤等炎癥相關疾病。RSSI組中男89例,女64例;平均年齡(61.72±11.19)歲;對照組中男77例,女73例;平均年齡(60.69±11.86)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究根據(jù)赫爾辛基宣言進行,并經(jīng)海南省東方市人民醫(yī)院倫理審查委員會批準,所有參與者均知情同意。

1.2觀察指標

1.2.1一般臨床資料收集 包括年齡、性別、生命體征(血壓和脈搏)、病史(高血壓和糖尿病)、個人病史[吸煙史(連續(xù)吸煙1年以上,吸煙>1支/天)和飲酒史(連續(xù)飲酒1年以上,攝入酒精量≥100 g/d)]和基本實驗室檢查[葡萄糖(Glu)、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL),白細胞計數(shù)(WBC)和尿酸(UA)]。所有對照組均接受心電圖(ECG)和腦成像檢查[頭部計算機斷層掃描(CT)或MRI],RSSI患者接受腦部MRI、頸動脈檢查、腦血管檢查[腦動脈CT成像(CTA)或腦動脈核磁成像(MRA)]、心臟超聲、24 h動態(tài)心電圖和頭部磁敏感加權成像(SWI)檢查。此外,記錄患者入院時(基線)和診斷后14 d時的美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分,并計算ΔNIHSS(基線NIHSS-14 d時NIHSS)和NIHSS改善率[(基線NIHSS-14 d時NIHSS)/基線NIHSS)×100%]。

1.2.2CSVD影像學特征 所有RSSI患者均使用3.0T MRI檢查,采用ABC/2法計算腦梗死體積。分別評估CSVD影像學特征。血管源性腔隙定義為直徑在3～15 mm的皮質(zhì)下圓形或卵圓形充滿液體的腔隙(信號類似于腦脊液),病灶與先前穿支小動脈區(qū)域發(fā)生的急性RSSI或出血相一致。腦血管周圍間隙擴大(EPVS)定義為穿過灰質(zhì)或白質(zhì)的沿著血管典型走向的充滿液體的間隙,并進一步進行EPVS分級[12]:0、1、2、3、4級(對應的數(shù)量分別為0個、>0～10個、>10～20個、>20～40個、>40個)。血管源性腦白質(zhì)高信號(WMH)定義為白質(zhì)中大小不等的信號異常:T2加權像(T2WI)上的高信號;WMH分為腦室旁WMH(PVWMH)和深部WMH(DWMH),采用Fazekas量表進行分級[13]。腦微出血(CMB)定義為SWI上顯示低信號的小圓形病灶(直徑<10 mm),分為腦葉CMB和深部CMB。CSVD MRI總負荷評分規(guī)則[14]:存在腔隙、存在CMB、EPVS的數(shù)量≥11個、Fazekas分級≥2,每項評分為1分,共4分。

1.2.3miR-27a-3p檢測 采集所有研究對象清晨(早晨7～9點)空腹靜脈血樣。按照RNA提取試劑盒(中國大連Takara生物技術有限公司)的說明書提取全血樣本總RNA,并檢測其濃度。使用PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒(Takara)進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Takara)的說明,以cDNA為模板,應用Applied Biosystems 7500系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR,95 ℃持續(xù)10 min,45次循環(huán)(95 ℃持續(xù)10 min,60 ℃持續(xù)1 min)。對每個樣品進行重復分析。以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算miR-27a-3p相對表達水平。引物如下:miR-27a-3p的正向引物為5′-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3′、反向引物為5′-AGGG CTTAGCTGCTTGTGAGCA-3′;U6的正向引物為5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′、反向引物為5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料比較 此外,RSSI組有高血壓病史、吸煙史的比例及WBC、循環(huán)miR-27a-3p水平顯著高于對照組(P<0.05),TC、LDL、HDL水平低于對照組(P<0.05),而兩組其他資料比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

表1 臨床資料比較[M(P25,P75)或n(%)或

2.2循環(huán)miR-27a-3p水平與梗死體積的相關性 經(jīng)Spearman秩相關系數(shù)分析,RSSI患者循環(huán)miR-27a-3p水平與梗死體積呈正相關(r=0.357,P<0.001),進一步校正年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史、TG、TC、HDL、LDL、Glu等混雜參數(shù)后,經(jīng)多元線性回歸分析,循環(huán)miR-27a-3p水平與梗死體積仍呈正相關(β=0.410,95%CI:0.197～0.624,P<0.001)。

圖1 循環(huán)miR-27a-3p水平與梗死體積的相關性

2.3循環(huán)miR-27a-3p水平與MRI總負荷特征之間的相關性 CSVD MRI總負荷特征中,循環(huán)miR-27a-3p水平與WMH-Fazekas分級和EPVS分級有關(P<0.05)。見表2。經(jīng)Spearman秩相關系數(shù)分析,RSSI患者循環(huán)miR-27a-3p水平與MRI總負荷(r=0.415,P<0.001)、WMH-Fazekas分級(r=0.546,P<0.001)、EPVS分級(r=0.207,P=0.010)呈正相關,見圖2。進一步校正年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史、TG、TC、HDL、LDL、Glu等混雜參數(shù)后,經(jīng)多元線性回歸分析,循環(huán)miR-27a-3p水平與MRI總負荷(β=0.224,95%CI:0.136～0.313,P<0.001)、WMH-Fazekas分級(β=0.166,95%CI:0.115～0.217,P<0.001)、EPVS分級(β=1.101,95%CI:0.225～1.976,P=0.014)仍呈正相關。

注:A、B、C分別為MRI總負荷、WMH-Fazekas分級、EPVS分級之間的相關性散點圖。

表2 不同MRI總負荷特征患者的循環(huán)miR-27a-3p水平比較[M(P25,P75)]

2.4循環(huán)miR-27a-3p水平與短期神經(jīng)功能預后的相關性 RSSI患者基線時、14 d時的NIHSS和14 d時ΔNIHSS分別為2.00(1.00,5.00)、2.00(0.00,4.00)、0.00(0.00,1.00)分,NIHSS改善率為0.00%(0.00%,0.50%)。經(jīng)Spearman秩相關系數(shù)分析,RSSI患者循環(huán)miR-27a-3p水平與ΔNIHSS(r=0.370,P<0.001)、NIHSS改善率(r=0.644,P<0.001)呈正相關,而與基線NIHSS無相關性(P=0.446),見圖3。進一步校正年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史、TG、TC、HDL、LDL、Glu等混雜參數(shù)后,經(jīng)多元線性回歸分析,循環(huán)miR-27a-3p水平與ΔNIHSS(β=0.209,95%CI:0.120～0.298,P<0.001)、NIHSS改善率(β=0.137,95%CI:0.099～0.175,P<0.001)仍呈正相關。

注:A、B分別為循環(huán)miR-27a-3p水平與發(fā)病14 d時ΔNIHSS和NIHSS改善率的相關性散點圖。

3 討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),RSSI組的循環(huán)miR-27a-3p水平顯著高于對照組,循環(huán)miR-27a-3p水平與梗死體積、MRI總負荷、WMH、EPVS及14 d時ΔNIHSS、NIHSS改善率均呈正相關,且校正混雜參數(shù)后,循環(huán)miR-27a-3p水平與上述指標仍呈正相關,提示循環(huán)miR-27a-3p高表達與RSSI嚴重程度和患者短期神經(jīng)功能預后密切相關,這可能為臨床指導CSVD治療提供一定的經(jīng)驗。

目前有研究認為,內(nèi)皮功能障礙和血腦屏障破壞與CSVD的發(fā)病機制有關[4]。在炎癥的作用下,內(nèi)皮損傷導致血腦屏障破壞、白質(zhì)病變、神經(jīng)元變性和死亡[15]。有研究表明,miRNA在生理和病理條件下可作為血腦屏障功能的多功能調(diào)節(jié)劑[7],在神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)炎癥性疾病等許多腦部病變中都證明了血腦屏障相關miRNA的作用[7,16]。XI等[17]發(fā)現(xiàn),miR-27a-3p可以對抗創(chuàng)傷性腦損傷后的神經(jīng)元死亡和血腦屏障通透性和自噬激活。本研究發(fā)現(xiàn),循環(huán)miR-27a-3p水平在RSSI患者中顯著升高,且與腦梗死體積和MRI總負荷特征呈顯著正相關,提示循環(huán)miR-27a-3p可能在CSVD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

已有研究證實,miRNA可以通過靶向特定的信使RNA來調(diào)節(jié)腦缺血性損傷[16,18]。YE等[8]報道m(xù)iR-27a-3p通過靶向PPARγ加重急性腦梗死患者的腦損傷和炎癥。YASMEEN等[11]證明,miR-27a-3p可靶向腦微血管內(nèi)皮細胞中PDE3A蛋白,參與免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)皮完整性和神經(jīng)發(fā)生。HARATI等[7]證明,miR-27a-3p通過靶向GSK3β基因并激活Wnt/β-catenin信號傳導,是腦內(nèi)皮關鍵緊密連接蛋白的正調(diào)節(jié)因子,可在以屏障功能受損為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中保持腦內(nèi)皮完整性。XI等[17]發(fā)現(xiàn),miR-27a-3p通過靶向內(nèi)皮水通道蛋白11防止血腦屏障破壞和腦損傷。上述研究證明了miR-27a-3p表達與人類腦血管疾病之間的關聯(lián),這些結(jié)果表明miR-27a-3p可能通過不同的信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、血腦屏障和相關炎癥反應,參與CSVD進展。在本研究中,較高的循環(huán)miR-27a-3p水平預示著更高的MRI總負荷評分及WMH和EPVS的嚴重程度。筆者推測循環(huán)miR-27a-3p參與了大腦炎癥反應,導致與慢性和持續(xù)性炎癥反應相關的WMH和EPVS發(fā)生[19],進而影響MRI總負荷。然而,筆者沒有發(fā)現(xiàn)深部或腦葉CMB及腔隙與循環(huán)miR-27a-3p之間存在相關性,可能是由于CMB與高血壓或淀粉樣變性有關,但無法反映大腦持續(xù)的炎癥反應[20];而腔隙通常被認為是由其他病變轉(zhuǎn)化而來的,發(fā)病機制復雜,缺乏證據(jù)支持。

此外,筆者還發(fā)現(xiàn)miR-27a-3p的表達水平與患者14 d時ΔNIHSS、NIHSS改善率呈正相關。既往研究表明,miR-27a-3p可靶向神經(jīng)元中的促凋亡蛋白,可能對減少神經(jīng)元細胞死亡至關重要[11]。ZHANG等[21]研究提示,miR-27a-3p可通過靶向卵泡抑素樣蛋白1(FSTL1)改善的氧-葡萄糖剝奪/再灌注誘導的神經(jīng)細胞損傷。同時,以往的研究已經(jīng)表明,細胞外糖蛋白FSTL1與心血管疾病和炎癥性疾病有關,可加速神經(jīng)元凋亡,并可能具有治療缺血性卒中的潛力[22-23]。此外,YE等[8]報道,miR-27-3p可以靶向PPARγ,并影響小膠質(zhì)細胞的激活。激活的PPARγ可以減少神經(jīng)元死亡,具有神經(jīng)保護作用,有助于緩解神經(jīng)炎癥[24]。而小膠質(zhì)細胞被認為是大腦中不可缺少的免疫細胞,激活時可提示腦神經(jīng)炎癥[25]。上述研究和本研究均提示miR-27a-3p可能通過介導各種信號通路參與神經(jīng)系統(tǒng)的修復過程,從而改善卒中預后?？傊?循環(huán)miR-27a-3p水平反映了RSSI患者短期預后情況,其水平升高與短期神經(jīng)功能修復良好相關,可為臨床治療提供一定參考。

綜上所述,循環(huán)miR-27a-3p反映了RSSI的嚴重程度,有望作為短期神經(jīng)功能預后的預測因子。在CSVD的影像學特征上,循環(huán)miR-27a-3p可以反映WMH和EPVS的嚴重程度,對腦血管疾病的診斷和治療具有一定的指導意義。但本研究存在一定局限性,如納入病例數(shù)較少、排除標準為頸動脈或顱內(nèi)動脈狹窄>50%,可能未充分排除頸動脈斑塊高負荷患者,而且循環(huán)miR-27a-3p在CSVD中的潛在機制尚不明確,未來仍需要更多的臨床研究和動態(tài)觀察來進一步證實其在RSSI中的臨床應用價值。