白前種子質量分級標準及特性研究

張紅楊, 劉世紅, 張冰冰, 向健華, 陳 誠, 黃必勝, 劉大會, 雷 咪

(1.教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室/湖北中醫藥大學藥學院, 武漢 430065;2.中國藥科大學中藥學院, 南京 210009; 3.武漢市新鄉園農業科技發展有限責任公司, 武漢 430065)

白前始載于漢魏《名醫別錄》,列為中品[1],為蘿藦科植物柳葉白前[Cynanchumstauntonii(Decne.)Schltr. ex Levi.]或芫花葉白前[Cynanchumglaucescens(Decne.)Hand.-Mazz.]的干燥根莖和根,性辛、苦,微溫,歸肺經,具有降氣、消痰、止咳的功效,用于肺氣壅實,咳嗽痰多,胸滿喘急[2]等癥狀。古代專著文獻認為,白前“專主肺家,為治咳嗽降氣之要藥”[3];為“肺家之要藥”[4]。近年來,人們對肺部疾病的治療和對白前的關注日益增多,白前的臨床應用范圍、臨床使用量和種植規模也逐年擴大,從1984年湖北省武漢市農科院開始在新洲、黃岡等地開展柳葉白前野生轉家種試驗以后,至2021年年底湖北省柳葉白前的種植面積10萬畝,居全國首位[5]。

目前白前的野生種質資源稀少,其主產區武漢新洲區、黃岡團風縣主要以種子育苗移栽為主,但不同產地和不同成熟度的白前種子,質量差異較大,其種子出苗率、出苗整齊度和幼苗后期長勢等情況也差異明顯。相對農作物而言,我國中藥材種子市場流通體系不健全,種子生產無統一的質量標準,種子質量決定藥材質量,藥材質量決定市場價值,因此人工繁育優良白前種子種苗對豐富種質資源和保證藥材質量非常關鍵,而優良種子的生產又依賴于規范化的種子質量標準[7-9]。目前,已有很多關于中藥材種子質量分級標準的研究,如射干[10]、北蒼術[11]、滇重樓[12]、三七[13]和金銀花[14]等,而對柳葉白前種子質量標準的研究還未見報道。本研究參考農作物檢驗規程以及同屬植物種子的相關研究報道[15-23],收集10個不同產地的白前種子,從外觀形態來比較其種子差異,并通過對其生活力檢測及發芽生物學特性指標的測定,探討影響白前種子發芽率的因素,在此基礎上采用K均值聚類算法(K-means)初步制定白前種子的質量分級標準。這對規范種植白前、提高白前產量和質量,降低生產成本,推動白前GAP基地建設,保護良種資源具有重要的意義。

1 試劑與材料

人工氣候培養箱(合肥右科儀器設備有限公司),AUX220型分析天平(日本島津株式會社)、DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)、H2O2(天津市天力化學試劑有限公司)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(上海源葉生物科技有限公司,批號S19026)、磷酸緩沖液(pH值6.5～7.0)。

實驗用白前種子于2021年10—12月采自湖北新洲、團風、麻城、黃岡、羅田等五個產區。經湖北中醫藥大學劉大會教授鑒定為蘿藦科植物柳葉白前的干燥成熟種子。具體來源及編號見表1。

表1 不同產地白前種子信息Table 1 Seed information of Cynanchum stauntonii from different producing areas

2 方 法

2.1 扦 樣

將編號1～10的白前種子按GB/T 3543.2—1995《農作物種子檢驗規程 扦樣》[15]要求,采用徒手減半分取法選擇試驗樣品,以試驗樣品為凈度分析樣品的10倍量,凈度分析樣品不少于2 500粒種子的原則選取白前種子的最小取樣質量,按不同產地分批裝入網袋,置于通風陰涼處保存備用。

2.2 種子形態觀察

對10批種子分別進行形態觀察。隨機挑選各批次成熟種子50粒,觀察種子外觀形態并采集照片。用游標卡尺測量種子長度、寬度、厚度,精確到0.01 mm。

2.3 凈度分析

采用四分法,將編號1～10的白前種子按照GB/T 3543.3—1995《農作物種子檢驗規程 凈度分析》[16],以試驗樣品為凈度分析樣品的10倍量,凈度分析樣品不少于2 500粒為原則(不少于50 g),將抽取的白前種子樣品摞成圓錐形,用手掌從上向下將其平鋪開,鋪成圓形,用鑷子將其平均分成四等分扇形,取其中一份做樣品,重復上述操作直至獲取所需的樣品量。分別將凈種子、廢種子及其他雜質分開[19],稱重記錄。重復3次。

種子凈度/%=[(種子總重量-雜質重理)/種子總重量]×100%。

2.4 千粒重

將凈度分析后的純凈樣品按四分法取樣,參照暢晶等[24]實驗過程中采用的五百粒法測定不同產地白前種子的千粒重,重復3次(兩平行數據之差與平均值之比在4.0%以內有效)。

2.5 含水量測定

采用(105±2)℃恒溫烘干法:用分析天平稱取每組白前種子2 g,精確到0.000 1 g,誤差小于0.2%,重復3組。首先將洗凈的稱量瓶放入預熱好的105 ℃烘箱中干燥,室溫冷卻后,將白前種子裝入洗凈干燥的稱量瓶中,在分析天平上稱取質量(W1),置于105 ℃烘箱中6 h后,放置硅膠缸中冷卻30 min直至室溫,稱重(W2),計算含水量。

含水量/%=[(W1-W2)/W1]×100%。

2.6 生活力測定

采用TTC染色法[20]測定生活力。選取白前種子25份,采取L25(53)正交試驗設計(表2),選擇預濕時間、TTC濃度、染色時間3個因素,初步確定各因素對生活力測定的影響。

表2 正交試驗設計Table 2 Orthogonal experimental design

2.6.1不同濃度的TTC染色組

采用pH值6.5～7.0的磷酸緩沖溶液分別配制成濃度為0.3%,0.4%,0.5%,0.75%,1.0%的TTC溶液,置于棕色瓶中于4 ℃冰箱避光保存備用。

2.6.2不同預濕處理組

將種子置于密封玻璃瓶中,每份加入等量溫水(30 ℃)至完全浸沒種子,充分振搖讓種子完全浸濕。分別預濕4 h、8 h、12 h、16 h、20 h使種子充分吸水完全浸在其中,每個重復隨機數取15粒進行后續試驗,重復3次。

2.6.3染 色

為了使胚的主要構造和有活性的營養組織充分暴露出來,便于TTC試劑快速而充分地浸入種子,將預濕后軟化的種子沿種胚中央橫切,取胚保留較好的一半種子,整個操作過程中將種子放于濕潤的濾紙上。將每份種子(15粒)放入染色盤內,加入等量的0.3%,0.4%,0.5%,0.75%,1.0% TTC溶液至完全浸沒種子,置于25 ℃的恒溫箱內,分別避光染色1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后取出種子,倒掉培養皿中的藥液,用蒸餾水沖洗2次后,吸干種子表面水分。40×解剖鏡下觀察染色效果,記錄染色種子的數量。確定種子是否有活力,一般的鑒定原則為凡是胚的主要構造或有關活的營養組織全部染成有光澤的鮮紅色或染色最大面積大于規定且組織狀態正常的為正常有生活力的種子,否則為無生活力的種子(圖1)。

圖1 TTC染色法生活力強弱差異 Fig.1 Difference of viability by TTC staining

2.7 種子萌發率測定

參照GB/T 3543.4—1995《農作物種子檢驗規程 發芽實驗》[17]的規定采用紙床法進行預實驗。

2.7.1不同浸種條件

選取同批次飽滿的白前種子分為3組,每組約200粒種子,分別用自來水、超純水、1% H2O2浸種,24 h后用蒸餾水沖洗干凈備用。各處理組取90粒種子平均分為3組,置于鋪有2層濾紙的培養皿中,加入適量超純水,置于人工氣候箱中于25 ℃、濕度75%條件下進行避光萌發試驗。適時更換濾紙,以防雜菌滋生,每天觀測種子發芽數,30 d后結束發芽率測定。

2.7.2不同光照條件和發芽溫度

選取飽滿的白前種子約900粒分為3組,采用1% H2O280 mL浸種24 h后,分別進行避光萌發試驗(24 h黑暗且種子表面覆蓋濾紙)、弱光萌發試驗(光照13 h、黑暗11 h且種子表面覆蓋濾紙)、LD萌發試驗(光照13 h、黑暗11 h,種子表面不覆蓋濾紙),各萌發試驗組取270粒種子分為3組各采用不同溫度(17 ℃、25 ℃、30 ℃)進行培養,每個溫度下設置3組重復。每天觀測種子發芽數,30 d后結束發芽率測定。

種子發芽率與發芽勢按照GB 5520—85《糧食、油料檢驗 種子發芽試驗》[18]方法計算。

發芽率/%=(M1/M)×100%;

發芽勢/%=(M2/M)×100%,

式中:M1為全部正常發芽種子粒數;M2為發芽高峰期發芽的種子粒數;M為供試種子粒數。

2.8 新陳種子發芽率測定

取新洲李家崗的白前種子,分別于2020年12月和2021年12月進行種子發芽率的測定。

2.9 數據分析

用Excel2003軟件對種子質量各指標進行統計分析和區間估計,其他分析使用SPSS20.0軟件進行。

3 結果與分析

3.1 性狀分析

白前種子正面為扁卵狀披針形,外種皮深棕色或黑褐色,表皮細胞邊緣略隆起,表面凹陷呈網狀[21]。由圖2和表3可以看出,各產地種子長度均值范圍在15.89～17.40 mm之間,寬度在2.47～2.83 mm之間,厚度在0.71～1.02 mm之間。經SPSS20.0軟件分析,新洲徐古鎮產區種子長度較長,羅田李婆墩鎮產區長度最短,其他各產區種子長度沒有顯著差異;麻城三河口鎮產區種子寬度最寬,麻城夫子河鎮產區種子寬度最窄,其他各產區種子寬度之間無顯著差異;團風賈廟鄉種子厚度最厚,種子更飽滿,新洲徐古鎮種子厚度最小,種子普遍干癟、皺縮。其他各產區種子厚度之間無顯著差異。結果可見,麻城夫子河鎮和新洲徐古鎮種子厚度較小,種子多瘦小干癟。

圖2 10批次白前種子形態 Fig.2 Seed morphology of 10 batches of Cynanchum stauntonii

圖3 不同溫度下白前種子避光萌發狀況 Fig.3 The germination status of seeds of Cynanchum stauntonii under different temperatures in the dark

表3 不同產地白前種子形態分析Table 3 Morphological analysis of seeds of Cynanchum stauntonii from different producing areas

經調查走訪發現,湖北的白前主要集中在黃岡、新洲、羅田一帶,其地理位置較為接近,但土壤性質存在差異。新洲李家崗接近舉水河,新洲舊街近沙河,土壤發育于河流沖積物,為潮土土屬[25],黃岡、羅田地區氣候適宜,土壤透氣性較好,結合白前喜陽、忌干旱,多生于溪旁、湖邊、渠道、塘邊、溝旁以及河灘砂磧的潮濕土地這一生境特點,可知這些地區是白前適宜的生境環境。而麻城地區地處湖北省東北部,土壤為黃棕壤,土層深厚,質地偏黏。據調查,麻城產區種子溯源為新洲所產移種,造成麻城種子形態差異的原因可能是該取樣地區的土壤環境不適合種植白前。

3.2 凈度分析

由表4可見,除麻城夫子河、新洲徐古鎮產區外,其他不同產地的白前種子總體凈度均在89%以上,其中新洲李家崗種子凈度最高,為98.09%;團風賈廟鄉產區凈度次之。不同產地白前種子凈度差異可能與種子自身成熟度、當地氣候環境、采集時間和方式及采集后儲存方法有關。

表4 不同產地白前種子凈度分析Table 4 Purity analysis of seeds of Cynanchum stauntoniifrom different producing areas

3.3 千粒重及含水量分析

由表5可見,各產地白前種子的千粒重均值在13.49～22.09 g之間,其中團風杜皮鄉、黃岡浠水縣產區種子千粒重較重,種子飽滿,形態較大。而麻城夫子河鎮和新洲徐古鎮的兩個產區種子千粒重明顯低于其他產區,且凈度值也很低,觀察發現該兩個產區的種子多瘦小干癟、種子外表皮多皺縮。特別是新洲徐古鎮種子果莢細長,顏色偏黃,種子多無胚乳,僅由上下表皮組成,外表皮呈淺黃棕色,多有黃褐色斑點。

表5 不同產地白前種子千粒重及含水量分析Table 5 Analysis of 1 thousand-grain weigh and water content of seeds of Cynanchum stauntonii from different producing areas

不同產地白前種子的含水量均值在7.56%～11.10%之間,各產區之間含水量存在顯著性差異。特別是同在新洲的3個產區含水量差異明顯,據調查,當地農戶采摘被果莢包裹的種子后采用晾曬干燥再儲存的方式保存種子,新洲舊街產區的種子采摘時間較早,且因氣候原因導致晾曬不充分,而后便直接裝袋貯藏,造成果莢潮濕,種子內部含水量高。而新洲李家崗2021年年均降水量較低,年均氣溫比其他兩地皆高,采收時節更為適宜。其他產區的含水量均有一定的差異。

結合千粒重的數據,考慮到氣候因素是造成種子繁衍的一個重要因素[26],不同產地白前種子千粒重及含水量差異與其采收時間過早、當地氣候環境有關。在凈度結果基礎上結合外觀性狀可知,2021年團風賈廟鄉的種子千粒重較重,含水量較低,種子大小均一且飽滿,商品性較好。

3.4 生活力測定分析

正交試驗結果表明,采用TTC定量法測定白前種子活力較好處理組為A2B5C1、A3B5C2、A4B5C3,白前種子染色4 h、5 h時染色情況較好,二者無顯著差異(表6)。且染色時間、TTC濃度、浸種時間3個因素對白前種子活力具顯著性影響。影響白前種子生活力的因素依次為染色時間>TTC濃度>浸種時間,見表7。白前種子生活力與染色時間呈正相關,染色時間越久,強活力種子著色數量越多,著色越深,著色面積越大。當TTC濃度逐漸升高時,白前種子生活力增強,但當濃度超過0.5%時,白前種子生活力下降。綜上所述,白前種子的TTC生活力測定最佳方案為:TTC濃度0.3%～0.4%,浸種時間8～16 h,染色時間4～5 h。

表6 白前種子TTC測定正交試驗結果Table 6 Orthogonal test results of TTC determination of seeds of Cynanchum stauntonii

表7 白前種子方差分析結果Table 7 Results of variance analysis of seeds of Cynanchum stauntonii

3.5 發芽率結果分析

3.5.1浸種預處理溶濟的確定

由表8可見,進行浸種預處理試驗有利于提高白前種子發芽率,各預處理溶劑浸種24 h后白前種子發芽率從高到低為:1% H2O2、超純水、自來水,采用1% H2O2浸種預處理的發芽率較高,可能是1% H2O2浸種預處理具有一定的除菌作用,能改善種子發芽過程中的霉變現象,有利于種子正常發芽,提高種子的發芽率。

表8 浸種條件試驗Table 8 Soaking condition test

3.5.2光照條件和發芽溫度的確定

由表9可知,溫度對白前種子的發芽影響顯著,低溫(17 ℃)不利于白前種子的萌發,且導致萌發率下降明顯,使種子難發芽或不發芽。隨著溫度逐漸升高,白前種子發芽率逐漸增大,高溫(30 ℃)條件下萌發率最高,另外光照對白前種子發芽率也有影響,較溫度的影響小。對比避光萌發、弱光萌發、LD萌發3組試驗結果,發現光照對白前生長周期有一定影響。充足的光照有利于白前種子的平均萌發時間提前0～1 d,使白前種子的發芽持續周期平均縮短5.67～6.00 d。

表9 不同溫度和光照條件對白前種子發芽率的影響Table 9 Effects of different temperature and light conditions on germination rate of Cynanchum stauntonii seeds

3.5.3不同產區白前種子的發芽率結果

白前種子經1% H2O2浸泡24 h預處理,高溫(30 ℃)條件下光照、不蓋濾紙處理組發芽率最高,在此基礎上考察不同產地白前的發芽率情況。白前種子萌發過程見圖5,結果見表10,由此可見,不同產地的白前種子發芽率存在顯著差異,其中,團風回龍山鎮、麻城三河口鎮、賈廟鄉、新洲舊街區的種子發芽率高于其他產區。麻城夫子河鎮、新洲徐古鎮產區發芽率低于其他產區,且與其他大部分產區存在顯著差異。這與前文中麻城夫子河鎮、新洲徐古鎮種子形態多干癟皺縮;凈度、千粒重過低有關。黃岡浠水縣產區的白前種子發芽率最低是因為種子未完全成熟,農戶收割后產區當月降雨天氣居多,儲存過程中種子容易霉變。

圖5 白前種子萌發生長動態模擬 Fig.5 Dynamic simulation of seed germination and growth of Cynanchum stauntonii

表10 不同產地白前種子發芽率比較Table 10 Comparison of germination rate of Cynanchum stauntonii seeds from different producing areas

3.6 新陳白前種子發芽率比較

通過對不同儲藏年限的白前種子進行發芽率測定,發現新種子的發芽率在86.67%左右,高于陳種子發芽率(77.78%)。原因可能是隨著種子儲存時間的延長,種子生活力下降。羅倩等[27]研究不同儲藏條件對獨活種子發芽率影響時便發現種子貯藏時間延長會導致種子活力下降甚至衰老死亡。

圖4 30 ℃不同萌發方案下白前種子萌發狀況 Fig.4 Germination status of seeds of Cynanchum stauntonii under different germination schemes at 30 °C

3.7 白前種子質量分級標準的初步制定

用 SPSS20.0 軟件對6項指標檢測數據進行分析,結果見表11。可知種子寬度大小可以作為衡量白前種子質量標準的指標之一。團風杜皮鄉、黃岡浠水縣的白前種子形態、凈度正常,但在處理過程中發現種子果莢霉變現象嚴重且發芽率過低,是因為農戶采摘種子時間過早,采摘后由于當月降雨天氣居多,導致種子多受潮變質。為避免影響種子質量分級,故將二者去除。對其他8個產地的樣品進行K-means聚類分析,初始聚類中心值見表12。結合表5不同產地的白前種子由于采收后儲存方式導致含水量差異顯著的結果,為避免分級出現偏差,故除去含水量這一指標,以白前種子寬度、厚度、千粒重、強生活力及發芽率這5項指標的最終聚類中心值作為白前種子的質量分級參考值,結合不同產地白前種子凈度,制定了白前種子質量分級標準,分級方法采用最低定級原則,任何一項指標不符合規定標準都不能作為相應等級的合格種子,見表13。

表11 各指標之間的相關性分析Table 11 Correlation analysis between various indices

表12 K類中心聚類的最終聚類中心值Table 12 Final cluster center value of K-class center cluster

4 討 論

中藥材種子的優劣情況直接影響中藥材的生長狀態和后期質量,影響其質量差異的因素有很多,包括海拔、氣候、土壤肥力、種子采收時間、采收后的儲存方法及種子本身成熟度[10]。從本實驗可知,不同產地的白前種子質量差異明顯,主要表現在種子形態、千粒重和萌發狀態等方面。種子的凈度問題最能反映各個地區種子采收時的真實情況。麻城夫子河鎮、新洲徐古鎮產區的種子凈度普遍低于其他產區,且種子成熟度也不如其他產區,廢種子較多。在藥用牡丹[28]種子的收集過程中發現,由于存在提前搶收的問題導致部分產區牡丹種子凈度降低,種胚霉爛。本研究中麻城夫子河鎮、新洲徐古鎮產區的種子凈度、成熟度普遍低于其他產區,不排除當地農戶采摘時出現搶收、以次充好和采收時節不合時宜等情況。新洲3個產地的種子含水量差異較大,新洲舊街種子含水量高是因當地農戶采摘后沒有及時曬干處理而直接儲存至陰涼處,導致果莢偏綠,種子潮濕含水量偏高。同時種子成熟度對發芽率影響較大。除去黃岡浠水縣產區種子或存在質量問題外,麻城夫子河鎮、新洲徐古鎮產區種子成熟度不如其他產區,種子外表皮多皺縮干癟,種子霉爛情況較多,故其發芽率較低。團風賈廟鄉產區的白前種子成熟度較好,大小均一且飽滿,因此發芽率較高。表明白前種子產地、采摘時間、種子成熟度的不同,使得種子質量差異較大,后續可繼續對不同產地的白前苗整齊度、后期長勢及品質進行分析對比。本試驗可知,從白前種子寬度、厚度、千粒重、強生活力及發芽率綜合因素考慮,團風賈廟鄉、新洲舊街產區的種子質量優于其他產區。

韓金龍等[19]對白前同屬植物徐長卿種子品質檢驗及其質量分級標準研究中發現,TTC染色法適用于徐長卿種子生活力的測定,同時,種子生活力的測定受到浸種時間、染色時間及TTC濃度的影響。因此,在本研究中亦比較了浸種時間、染色時間及TTC濃度對種子生活力的影響,并得出了較合適的TTC生活力測試方案,為其他同屬植物的生活力測試提供參考。萌發試驗發現,白前種子易發生霉變,種子表皮出現黑色或白色霉菌菌絲,底部鋪蓋濾紙上出現黃褐色或粉紅色霉斑,不利于種子的正常萌發,而白前的采收期集中在12月,湖北屬濕潤地區,12月溫度較低且濕度大,白前種子如果保存不當易發生霉變從而影響發芽率。本研究發現,采用1% H2O2溶液浸種預處理能很好地提高種子的發芽率,同時溫度和光照對種子的發芽生物學特征影響明顯,其中溫度對白前種子的發芽率影響尤其顯著。周義峰等[22]對徐長卿種子生活力檢測及發芽生物學特性觀察的研究發現,采用1% H2O2浸種預處理的徐長卿種子發芽率高于對照組,隨著溫度的升高,徐長卿種子的發芽率也隨之增加,與本研究結果趨勢一致。并且溫度和光照對種子生長周期也有一定影響,光照對白前種子發芽率的影響較溫度對白前種子發芽率的影響小。在25 ℃條件下,白前種子進行避光萌發的發芽率高于弱光萌發的發芽率,與李龍等[23]對蘿藦種子萌發檢驗標準化研究中的結果趨勢一致。結果表明,充足的光照更有利于縮短白前種子的出芽時間和和發芽持續時間,使種子出芽更快,出芽時間更集中。同時對比同一批白前種子不同儲藏年限的發芽率可知,新種子發芽率高于陳種子。與周義峰等[22]對徐長卿種子生活力檢測及發芽生物學特性觀察的研究結果一致。綜上所述,在白前種子實際育苗生產中,選擇一年生白前種子進行1% H2O2浸種處理并在高溫(30 ℃左右)及充足光照的條件下進行種子育苗能得到更高的出苗率并縮短白前種子的萌發周期,更快出苗。這對白前種子優選和育苗具有重要意義,也為研究開發新的白前育苗方式提供指導作用。

本實驗以白前種子為對象,研究了不同產地種子的凈度、千粒重、含水率、生活力及發芽率,初步制定了以寬度、厚度、千粒重、生活力、發芽率、凈度為指標的白前種子質量分級標準。為白前種子的質量評價和優化選種育苗提供了科學可行的參考依據;白前種子質量分級標準的制定為其作為湖北地道藥材申請地方標準乃至國家標準提供了科學有利的依據。