甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導

易元慧, 許丁帆, 董洪雨, 劉艷軍

(天津農學院園藝園林學院, 天津 300384)

甜瓜(CucumismeloL.)為葫蘆科一年生蔓性草本植物,又名哈密瓜、香瓜等。甜瓜可溶性糖含量高,且含有維生素C、蛋白質等營養物質[1]。近年來,中國的甜瓜國際貿易發展迅速,但市場上抗逆性強的優良品種較少,優良種質資源的缺乏使得生產成本不斷增加、生產技術難以支撐,制約了中國甜瓜產業國際競爭力的提升[2]。國內外對甜瓜的研究主要是栽培技術以及選種育種等方面[3-7],有關甜瓜的愈傷組織研究也較多,但多采用器官誘導不定芽等建立再生體系[8-12],這種再生苗生長勢弱,遺傳穩定性低,大大制約了種質資源創新、誘變育種等技術的發展。松散型胚性愈傷組織是具有獨特性質的愈傷組織,主要由彼此聯系且松散的愈傷組織細胞構成,特點是其具有一定的胚性,即這些細胞可以在一定條件下經過分化與分裂,逐步發育成胚狀體,進而形成一個完整植株。形成的再生體系能為植物組織脫毒、轉基因育種等研究提供平臺,從而有效解決甜瓜生產中枯萎病、炭疽病等[13-14]病蟲害以及坐果、含糖量等[15-16]問題。

松散型胚性愈傷組織的誘導是組織培養方法的一大創新,目前未見甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導的相關報道。本研究以甜瓜成熟葉片為外植體,誘導甜瓜松散型胚性愈傷組織,建立高效的甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導體系,為甜瓜種質資源創新、植物組織脫毒、人工種子研制及遺傳轉化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗選用天津津潤益農公司提供的薄皮甜瓜。截取一段已開花結果的甜瓜葉片作為外植體。

1.2 方 法

1.2.1外植體制備與消毒

用自來水將甜瓜葉片表面沖洗干凈,剪下備用。在超凈工作臺中將葉片剪成小塊,用70%乙醇浸泡2 s,再用2%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min,消毒期間不斷搖晃,充分消毒。消毒后用無菌水將葉片表面沖洗干凈,去除次氯酸鈉殘留。將洗凈的甜瓜葉片用無菌濾紙吸干表面水分備用。

1.2.2愈傷組織的誘導

以MS+7.0 g/L瓊脂為基本培養基,附加不同質量濃度的激素和蔗糖,pH值調節到5.8。

將消毒處理后的甜瓜葉片在超凈臺中剪成大小0.5～1.0 cm的小塊,并將其接種到MS培養基上進行愈傷組織誘導。接種的甜瓜葉片背面朝上,保證葉片與培養基緊密接觸。每個三角瓶中接種5～8塊外植體,每個處理接種10瓶,重復3次。30 d后統計愈傷組織誘導率。

1.2.3松散型愈傷組織的誘導

以MS+30 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂為基本培養基,附加不同質量濃度的激素,pH值調節到5.8。

將誘導出的甜瓜愈傷組織從葉片外植體上切下,轉接到含有不同激素的MS培養基上進行松散型愈傷組織誘導。每瓶接種5塊,每個處理接種10瓶,重復3次。經過3次繼代后,統計愈傷組織誘導情況。

1.2.4胚性愈傷組織誘導

以MS+7.0 g/L瓊脂為基本培養基,附加不同質量濃度的激素和蔗糖,pH值調節到5.8。

將誘導的甜瓜松散型愈傷組織轉接到含有不同激素的MS培養基上,進行松散型胚性愈傷組織誘導。每瓶接種5塊,每個處理接種10瓶,重復3次。15 d后,結合壓片觀察選擇結構松散且細胞個體小,細胞質濃度高,外形為球狀的愈傷組織團進行繼代轉接。5次繼代培養后,統計愈傷組織誘導情況。

1.3 培養條件

試驗過程中培養基均采用100 mL廣口三角瓶為容器,每個三角瓶加入約30 mL的培養基,pH值調至5.8～6.0,121 ℃、0.1 MPa下滅菌30 min。培養條件均為24 h光照,光照強度為2 000 lx,培養溫度為(23±2)℃。

1.4 數據統計分析

試驗數據采用Excel2013軟件統計分析。

愈傷組織誘導率/%=(形成愈傷組織的外植體數/外植體總數)×100%;

胚性愈傷組織誘導率/%=(核占比大于30%的細胞數/總的細胞數)×100%。

用測微尺分別測量被觀測細胞核與細胞的直徑,再計算比值。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導情況

接種甜瓜葉片后,大約培養10 d,在葉片傷口部位有明顯愈傷組織。從表1可知,在不添加任何激素處理下,外植體出愈率為12.25%,顯著低于其他處理,隨著培養時間增長,葉片變黃,傷口褐變。在添加2,4-D的培養基中均能誘導出愈傷組織,且2,4-D濃度為2.0 mg/L時愈傷組織誘導速度較快,在接種5 d后葉片體積膨大,15 d左右有明顯愈傷組織形成。降低蔗糖含量至20 g/L能有效地提高葉片誘導愈傷速度,培養10 d后有大量愈傷組織形成。在2,4-D的作用下誘導出的白色且結構松散、質地較軟的松軟型愈傷組織,后期多數會褐變死亡。加入一定量的分裂素能有效控制褐變情況,當6-BA濃度為0.1 mg/L時(圖1),愈傷組織呈黃綠色且結構松散、質地較硬,具有多種應用方向,可以持續誘導,產生不同類型的愈傷組織。但從愈傷組織生長速度和形態來看,蔗糖用量與分裂素配合使用都會對誘導結果產生較大的影響。因此,理想的甜瓜愈傷組織誘導培養基為:MS+0.1 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D+20 g/L蔗糖。

表1 不同培養基對甜瓜葉片外植體愈傷組織誘導結果Table 1 Callus induction results of Cucumis melo L. leaf explants in different media

2.2 松散型愈傷組織誘導情況

從表2可以看出,在原培養基上持續誘導,會使得愈傷組織質地變軟,隨著分裂素的增加,愈傷組織質地越來越硬,過高濃度的分裂素使得生長速度變慢,且結構變得緊密。與6-BA相比分裂素KT與2,4-D組合誘導的愈傷組織生長速度慢且結構更加緊密,質地硬,顏色呈黃色(圖2A1),細胞組織化嚴重(圖2A2),達不到理想的松散狀態。而0.5 mg/L的6-BA與2.0 mg/L 2,4-D結合處理下可以誘導出松散型的愈傷組織,但高濃度的2,4-D會使得愈傷組織快速生長,細胞分裂減少,體積膨大,形成細胞核較小的大細胞(圖2B1),導致愈傷組織稀軟(圖2B2),不利于后期愈傷組織的胚性化。當降低2,4-D濃度至1 mg/L時,結合0.1 mg/L低濃度的6-BA愈傷組織(圖2C1)呈現出結構松散、質地軟的狀態且顏色為黃白色,而壓片觀察發現細胞體積大都呈長條形,核占比小(圖2C2)。當2,4-D濃度為1 mg/L時,提高分裂素6-BA能改變愈傷組織質地,當6-BA濃度為0.5 mg/L時,愈傷組織結構松散、質地較硬,且生長速度較快,呈黃綠色(圖2D1),顯微鏡下細胞近似圓形,體積適中,數目較多(圖2D2)是松散型愈傷組織的最佳狀態。綜上所述,理想的甜瓜松散型愈傷組織誘導培養基為:MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖。

圖1 0.1 mg/L BA+2.0 mg/L 2,4-D下誘導的松軟型愈傷組織 Fig.1 Soft callus induced under 0.1 mg/L BA+2.0 mg/L 2,4-D

注:A1為外源激素KT作用下愈傷組織;A2為A1對應的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);B1為高濃度(2.0 mg/L)2,4-D下誘導的愈傷組織;B2為B1對應的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);C1為0.1 mg/L BA+1.0 mg/L 2,4-D下誘導的愈傷組織;C2為C1對應的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);D1為理想的甜瓜松散型愈傷組織;D2為D1對應的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm)。圖2 不同外源激素下誘導的愈傷組織狀態以及細胞學鑒定Fig.2 Callus state induced by different exogenous hormones and cytological identification

表2 不同激素配比對甜瓜松散型愈傷組織的影響Table 2 Effects of different hormone ratios on loose callus of Cucumis melo L.

2.3 松散型胚性愈傷組織誘導情況

將甜瓜松散型愈傷組織轉接到胚性愈傷組織誘導培養基上,培養一段時間后,愈傷組織質地變得較硬,顏色加深,外表光滑,不同培養基下愈傷組織外觀差異不大,但經顯微鏡檢查發現,愈傷組織細胞的形態和特性有明顯差異。從表3可知,在原培養基的基礎上,降低2,4-D濃度,愈傷組織生長速度逐漸減慢,質地逐漸變硬,當2,4-D濃度為0.25 mg/L時,愈傷組織出現少量胚性細胞(圖3A1)所示,胚性愈傷組織誘導率為18.75%,顯著高于原培養基的誘導率。但愈傷組織質地硬,游離細胞少,多數組織化,顏色呈發黃且生長速度慢,老化快(圖3A2)。單一的降低2,4-D濃度可以誘導產生部分細胞胚性化,但相對高濃度的6-BA就會降低愈傷組織生長速度,導致愈傷組織質地過硬,出現組織化的現象。當6-BA濃度為1.0 mg/L,2,4-D濃度為0.5 mg/L時胚性愈傷組織誘導率為15%,顯著高于1,2,3組處理,但愈傷組織生長狀態與2,4-D濃度為0.25 mg/L時相同,壓片觀察不同視野下,細胞總數少。從而說明胚性愈傷組織的誘導不僅需要調節6-BA與2,4-D濃度的高低,二者比例大小的調節也至關重要。當2,4-D濃度為0.5 mg/L時,隨著6-BA濃度的降低愈傷組織生長速度逐漸加快,降至0.25 mg/L時,愈傷組織結構松散,質地較硬,生長速度較快呈黃綠色(圖3B2),但胚性愈傷組織誘導率較低,細胞多數進行無絲分裂形成體積較大,核較小的大細胞(圖3B1)。在0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D上誘導時發現降低6-BA濃度能加快生長速度,細胞數量增多(圖3C1、C2),但胚性愈傷組織誘導率與在0.5 mg/L6-BA+0.25 mg/L 2,4-D上誘導的無差異。配合蔗糖用量的改變,調節培養基的滲透壓,能有效控制愈傷組織生長速度以及胚性化程度。提高蔗糖用量,增加培養基滲透壓利于愈傷組織細胞向著胚性轉變。當蔗糖提高到40 g/L時,胚性愈傷組織誘導率顯著提高,添加濃度為0.25 mg/L 6-BA以及0.5 mg/L 2,4-D時,愈傷組織顏色加深,生長速度較快,細胞數量增多,細胞體積小,核占比較大(圖3D1、D2),胚性愈傷誘導率為33.58%,顯著高于同樣激素下30 g/L蔗糖的誘導率。在0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖培養基上繼代培養4～5代后可明顯觀察到愈傷組織細胞變小、細胞質濃度增大和細胞核加大等胚性細胞的一些特征(圖3E1、E2),胚性愈傷誘導率顯著高于其他處理,達69.44%。綜上試驗結果,理想的甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導培養基配方為:MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖。

注:A1為A2對應的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);A2為0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下誘導的愈傷組織;B1為B2對應的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);B2為0.25 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D下誘導的愈傷組織;C1為C2對應的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);C2為0.25 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下誘導的愈傷組織;D1為D2對應的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);D2為0.25 mg/L BA+0.5 mg/L2,4-D下誘導的愈傷組織(高滲透壓);E1為E2對應的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);E2為0.25 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下誘導的愈傷組織(高滲透壓)。圖3 不同激素與滲透壓下誘導的愈傷組織狀態以及胚性化程度的細胞學鑒定Fig.3 Callus state induced by different hormones and osmotic pressure and cytological identification for degree of embryogenesis

表3 激素與滲透壓對甜瓜愈傷組織胚性化的影響Table 3 Effects of hormones and osmotic pressure on embryogenesis of Cucumis melo L. callus

3 結論與討論

誘導胚性愈傷是一個前后連接的過程,前期愈傷組織的性質會影響后期愈傷組織的胚性化程度,因此誘導愈傷組織的選材非常關鍵,不同外植體誘導的愈傷其生理特性也有所不同。在甜瓜愈傷組織誘導的研究進程中,大多數研究者采用無菌苗的子葉和下胚軸為外植體,魏曉明等[17]、駱開明等[18]利用子葉以及下胚軸研究不同激素對愈傷誘導率的影響;陳千紅和管和[19]利用甜瓜下胚軸研究外源激素對愈傷的組織效應,王愛玲等[20]、趙燕等[21]利用子葉下胚軸建立再生體系。本研究采用了經開花結果的甜瓜莖段作為外植體,對于無菌苗的子葉以及下胚軸來說成熟的莖段生長能力以及細胞分裂能力相對較低,誘導愈傷組織的時間可能較長。如武云鵬等[22]、喬永旭[11]研究表明,子葉和下胚軸的誘導愈傷組織的速度明顯高于真葉,且子葉誘導的愈傷組織生長速度最快、品質最好、數量最多。而劉麗鋒等[23]研究發現,田間葉片誘導愈傷組織效率高于無菌苗葉片?？紤]到甜瓜品種以及實驗環境的不同從而導致二者的結論的相悖。在生產上,真葉的誘導實用性更強,取材更加直觀、便捷,節約生產成本。外植體幼嫩程度也可能會在誘導出的松散型胚性愈傷形成胚狀體過程中有一定影響,本次試驗誘導出了松散型胚性愈傷還有待進一步研究體胚的誘導。

碳源在誘導愈傷組織過程中是必不可少的,尤其在誘導胚性愈傷過程中[25]。植物愈傷組織誘導中蔗糖在眾多碳源中被普遍運用,本試驗研究發現,適當升高蔗糖的濃度到40 g/L更加利于甜瓜胚性愈傷的誘導。這一現象在洋蔥以及珍珠黃楊等胚性愈傷誘導上同樣適用。代月等[25]研究發現,適當增加蔗糖濃度有利于洋蔥胚性愈傷的誘導。李華[26]研究得出胚性愈傷組織狀態調整中,最適蔗糖濃度為45～55 g/L。提高蔗糖濃度一方面增加了營養的供給,另一方面也適當增加了培養基滲透壓。高滲透壓下更有利于細胞體積變小,液泡濃縮,細胞核增大。研究表明,胚胎發生細胞的共同特征包括小尺寸,致密的細胞質內容物,大核,突出的增大的核,小液泡[25],根據愈傷組織狀態提高蔗糖濃度能達到此種狀態特征,從而高效的誘導胚性愈傷。

本試驗以成熟葉片為外植體誘導甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導,以MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖為最佳培養樣基,為甜瓜快速繁殖、大規模量產、體細胞離體誘變育種及植物組培脫毒等研究提供參考。有關甜瓜胚性愈傷組織的體細胞胚胎發生還在進一步研究中。