表面等離子體共振技術在外泌體表征鑒定中的研究進展

龔柯?蘇艷瓊?陸昆婕?許鳳娟?肖威?曹東林

【摘要】 外泌體是一種脂質雙分子層膜性囊泡，廣泛分布于外周血、唾液、尿液、腹水等多種液體中。外泌體中的多種腫瘤相關基因參與了腫瘤細胞與正常細胞之間的信息交流，以及腫瘤細胞增殖和轉移的過程，在腫瘤的發展中起著重要作用，是腫瘤液體活檢的潛在生物標志物。近年來，表面等離子體共振技術（SPR）因其靈敏度高、所需樣品量少、檢測時間短及背景干擾小等諸多優點，被認為在外泌體的表征鑒定中有巨大的應用潛力。該文主要介紹了SPR的基本原理及基于SPR的生物傳感平臺在外泌體表征鑒定中的應用前景。

【關鍵詞】 外泌體；外泌體檢測方法；表面等離子體共振

Research progress in surface plasmon resonance technology in exosome characterization and identification Gong Ke， Su Yanqiong， Lu Kunjie， Xu Fengjuan， Xiao Wei， Cao Donglin. Department of Laboratory Medicine， Guangdong Second Provincial General Hospital Affiliated to Jinan University， Guangzhou 510320， China

Corresponding author， Xiao Wei， E-mail： xkevent@foxmail.com; Cao Donglin， E-mail： caodl@126.com

【Abstract】 Exosomes are lipid bilayer membrane vesicles that are widely distributed in peripheral blood， saliva， urine， ascites and other fluids. A variety of tumor-related genes in exosomes are involved in the information exchange between cancer cells and normal cells， as well as the process of tumor cell proliferation and metastasis， play an important role in tumor development， and are potential biomarkers for tumor liquid biopsy. In recent years， surface plasmon resonance （SPR） is considered to have great application potential in the characterization of exosomes due to its high sensitivity， small sample size required for testing， short detection time and low background interference， etc. In this article， the basic principle of SPR and the application prospect of SPR-based biosensing platform in exosomes characterization were mainly illustrated.

【Key words】 Exosome； Exosome detection method； Surface plasmon resonance

外泌體是細胞內的多泡小體與細胞膜融合后釋放到細胞外的膜性小泡，為細胞間信息交流的載體。2007年Valadi等首次發現外泌體同時含有mRNA和microRNA（miRNA）。它們可以通過外泌體在細胞間自由穿梭，并在新的位置發揮功能，如免疫調節、凝血功能、介導細胞間的物質傳遞及信息交流等［1］。這表明外泌體在細胞間的通信交流方面起著至關重要的作用。人體的外周血、尿液、鼻腔灌洗液、唾液和母乳等都能檢測到外泌體，其攜帶的核酸、蛋白質、脂質等生物活性分子，且與惡性腫瘤的發生、發展密切相關［2-3］。研究表明，外泌體中的多種腫瘤相關基因參與了腫瘤細胞與正常細胞之間的信息交流，以及腫瘤細胞增殖和轉移的過程，在腫瘤的發展中起著重要作用，是診斷腫瘤的潛在生物標志物［4-6］。

一、常用外泌體鑒定技術及其優缺點

目前外泌體的鑒定技術主要有電鏡技術、免疫印跡技術、流式細胞術、納米顆粒跟蹤技術等［7］。電鏡技術分辨率高，但樣品處理的過程較為復雜，以至于檢測時間過長，因此不適用于快速檢測大量的樣品。免疫印跡技術簡便且靈敏度高，但提取的外泌體濃度較低，所以對單個外泌體難以鑒定。納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術分辨率高，但儀器較大，臨床應用受限。流式細胞術靈敏度高，但檢測時間較長，且操作過程復雜，需要專業技術人員操作并分析結果［8-9］。利用上述方法可以準確地鑒定外泌體，但是仍然存在明顯的缺點（圖1）。因此，臨床需要一種操作簡便、分析靈敏的高通量外泌體表征鑒定方法。表面等離子體共振技術（SPR）是一種實時測量、無標記的光學傳感技術，通過檢測和分析光學信號的改變而完成對外泌體的鑒定。基于SPR的生物傳感平臺已逐步成為生物傳感器研究領域的熱點，現常將SPR與其他技術相結合形成基于SPR的生物傳感平臺用于鑒定外泌體［10］。近年來，已有研究人員用基于SPR的生物傳感器檢測腫瘤細胞分泌的外泌體，如卵巢癌、白血病、肺癌等［11-12］。SPR相比其他鑒定外泌體技術的優點在于：樣品不需要進行提純，低成本和較少的試劑使用，且樣品無需進行標記就能實時檢測［13］。所以越來越多的研究人員開始利用SPR來建立一種高效、無創、新型檢測方法來鑒定外泌體，從而將SPR應用于腫瘤的臨床診斷中。

二、基于納米粒子增強的 SPR 傳感平臺檢測外泌體

2018年Nie等［14］將DNA四面體探針（DTP）修飾的Au 薄膜與雙金納米粒子（AuNP）的催化生長相結合，開發了一種在復雜基質中檢測miRNA 的低污染、靈敏的SPR傳感器。該傳感器檢測外泌體中的 miRNA的結果與實時熒光定量PCR（RT-qPCR）的結果非常吻合，檢測限僅為0.8 fm。這種方法使檢測外泌體變得更加簡便。2019年 Wang等［15］利用AuNP輔助信號放大的SPR技術檢測外泌體，對捕獲的DNA的Au薄膜進行功能化處理，實現了雙納米顆粒信號放大（圖2）。這種直接測量外泌體的方法靈敏度高，檢測限（LOD）為5×106/L，與商品化ELISA相比，LOD提高了104倍。2020年同課題組的Liao等［16］利用基于適體識別和多巴胺功能化的金納米顆粒（Au@PDA NP）輔助信號放大的SPR技術測定外泌體。該研究利用CD63適配子連接的Au@PDA NP識別肝癌來源的外泌體并進行信號擴增，無需任何預處理即可在肝癌患者血清中特異性檢測肝癌來源的外泌體。總之，無論是基于DNA雜交的檢測方法還是使用了多巴胺功能化的AuNP方法來檢測外泌體，靈敏度都比傳統方法高，但檢測過程復雜，僅限于實驗室使用。

三、基于表面等離子體共振成像傳感平臺檢測外泌體

2014年Zhu等利用表面等離子體共振成像 （SPRi）結合抗體微陣列，定量檢測腫瘤細胞培養基中的外泌體。該研究中將跨膜蛋白（例如CD9等）固定在鍍金的傳感器芯片上，無需純化即可檢測來自人肝癌細胞來源的外泌體。該方法不僅可監測外泌體水平的變化還能預測癌癥患者的預后。2018年Picciolini等［17］設計了一種SPRi傳感器測定外泌體，這種檢測方法使用特定抗體，能精準地分離并檢測來自神經元和少突膠質細胞的外泌體。2020年Fan等［18］提出了一種基于抗CD63、抗表皮生長因子受體（EGFR）和抗上皮細胞黏附分子（EpCAM）修飾的SPRi陣列的方法檢測多重非小細胞肺癌（NSCLC）相關外泌體的多重表征，在功能性AuNP的幫助下，該方法LOD達到1.00×1010/L的水平。2021年Wu等［19］提出了一種利用金對銀異質結構和DNA四面體框架（DTF）的SPRi傳感器，同時檢測臨床樣品中的NSCLC相關外泌體的miRNA，借助DNA編程的Au-on-Ag異質結構和DTF，基于SPRi的生物傳感器具有2 fm～20 nm的超寬檢測范圍，1.68 fm的超低檢測限，該方法不僅提高了捕獲效率，還提高了防污能力。2020年Chen等［20］報道了一種基于水凝膠-金納米粒子超分子球（H-AuNP）的無標記實時SPRi生物傳感器（圖3）。利用AuNP的局域表面等離子體共振和累積多層多孔水凝膠的信號放大效應增強了該平臺的靈敏度。該生物傳感器表現出1.00×108～1.00×1010/L的寬線性范圍，檢測限低至1.00×108/L。上述結果均表明SPR是外泌體表征鑒定的有效工具。

四、基于SPR的等離子體顯微鏡傳感平臺檢測外泌體

2018年Yang等［21］提出了一種使用干涉等離子體顯微鏡（SPRM）以無標記方式對單個外泌體成像的光學方法。2020年該課題組利用基于功能化表面SPR生物傳感器和先進的SPRM，在單粒子水平上捕獲和成像外泌體［22］。SPRM通過結合免疫傳感和單粒子分析可以對外泌體進行物理和化學表征。研究者應用其分析人肺癌A549細胞系分泌的外泌體大小、濃度。由于SPRM具有單個成像及能多重分析的能力，在臨床應用中具有很大的價值，但其檢測過程比較復雜導致耗時較長，故臨床潛力相對較低。

五、基于納米孔的SPR傳感器平臺檢測外泌體

基于納米孔的SPR傳感器備受關注。2014年Im等報道了納米等離子體外泌體（nPLEX）技術，其用周期性納米孔陣列傳輸 SPR連續并分離、檢測和高通量定量外泌體。nPLEX將納米孔芯片陣列與微型成像裝置相結合，形成了第一個具有高水平集成和多路復用能力的微流體平臺。每次測量所需的樣品體積僅為0.3 μL，卻顯示出很高的診斷準確性。這種方法不僅靈敏度高（約3 000個外泌體），更重要的是在檢測不同蛋白標志物上具有更高的準確性。2019年Lim等［23］提出放大等離子外泌體（APEX）技術，該方法利用局部光學沉積物和雙層等離子體納米結構的原位酶促轉換來實現多路復用，靈敏度高（約200個外泌體），并能夠在外泌體中實現多種靶標共定位的檢測。然而復雜且昂貴的納米結構限制了納米等離子體生物傳感器的適用性。

六、總結與展望

相對于傳統的外泌體鑒定技術，基于SPR傳感原理的外泌體鑒定技術具有以下優點：①可以對外泌體進行多重分析，以提高診斷的特異度；②對單一的外泌體鑒定有著巨大的潛力；③對靶標及生物標志物能更好地放大信號，從而提高診斷疾病的靈敏度。然而，基于SPR傳感技術平臺還存在一些應用挑戰，難以滿足外泌體的臨床鑒定要求，主要包括如下幾點：①SPR傳感平臺在復雜樣品中的檢測準確性是較低的，難以在復雜樣品中排除非特異性吸附；②大多數基于SPR 的平臺仍處于概念驗證水平，與其他檢測方法（如ELISA）相比，它們的精確度是比較差的；③盡管有緊湊型的SPR傳感平臺，但是絕大多數的SPR傳感平臺儀器較大且昂貴，不利于便攜式快速檢測。綜上所述，SPR是一種非常有價值的鑒定外泌體的分析技術，具有巨大的臨床轉化潛力，但基于SPR傳感平臺還存在一些不足，研究者需要從臨床實際需求出發，開發便攜式的SPR測量設備、提高其在復雜樣本中的檢測精準度，從而推動其臨床實際應用，為基于外泌體的臨床檢驗新技術提供方法學支持。

參 考 文 獻

［1］ Familtseva A， Jeremic N， Tyagi S C. Exosomes： cell-created drug delivery systems. Mol Cell Biochem， 2019， 459（1/2）： 1-6.

［2］ Caby M P， Lankar D， Vincendeau-Scherrer C， et al. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol， 2005， 17（7）： 879-887.

［3］ De M A. Human urine exosomes： another important member of the liquid biopsy family. Methods Enzymol， 2020， 645： 195-208.

［4］ Kalluri R. The biology and function of exosomes in cancer. J Clin Invest， 2016， 126（4）： 1208-1215.

［5］ 王林， 易基群， 江高峰. 外泌體lncRNA H19在miR-7/KLF4/VEGF調控人肺腺癌細胞遷移和侵襲中的作用研究. 新醫學， 2021， 52（10）： 745-751.

［6］ 王成， 汪俊軍. 細胞外囊泡miRNA作為腫瘤新型液體活檢分子指標的價值. 中華檢驗醫學雜志， 2021， 44（3）： 250-254.

［7］ 王耀杰， 顏晰， 趙立波， 等. 外泌體分離和純化方法研究進展. 中華檢驗醫學雜志， 2021， 44（2）： 167-170.

［8］ Cizmar P， Yuana Y. Detection and characterization of extracellular vesicles by transmission and cryo-transmission electron microscopy. Methods Mol Biol， 2017， 1660： 221-232.

［9］ Drula R， Ott L F， Berindan-Neagoe I， et al. MicroRNAs from liquid biopsy derived extracellular vesicles： recent advances in detection and characterization methods. Cancers （Basel）， 2020， 12（8）： 2009.

［10］ Xie X， Liu J， Wang X. Design， synthesis and biological evaluation of （2’， 5’ and 3’5’-linked） cGAMP analogs that activate stimulator of interferon genes （STING）. Molecules， 2020， 25（22）： 5285.

［11］ Fathi F， Rahbarghazi R， Movassaghpour A A， et al. Detection of CD133-marked cancer stem cells by surface plasmon resonance： its application in leukemia patients. Biochim Biophys Acta BBA Gen Subj， 2019， 1863（10）： 1575-1582.

［12］ Ribaut C， Voisin V， Malachovská V， et al. Small biomolecule immunosensing with plasmonic optical fiber grating sensor. Biosens Bioelectron， 2016， 77： 315-322.

［13］ Xu L， Shoaie N， Jahanpeyma F， et al. Optical， electrochemical and electrical （nano）biosensors for detection of exosomes： a comprehensive overview. Biosens Bioelectron， 2020， 161： 112222.

［14］ Nie W， Wang Q， Zou L， et al. Low-fouling surface plasmon resonance sensor for highly sensitive detection of microRNA in a complex matrix based on the DNA tetrahedron. Anal Chem， 2018， 90（21）： 12584-12591.

［15］ Wang Q， Zou L， Yang X， et al. Direct quantification of cancerous exosomes via surface plasmon resonance with dual gold nanoparticle-assisted signal amplification. Biosens Bioelectron， 2019， 135： 129-136.

［16］ Liao G， Liu X， Yang X， et al. Surface plasmon resonance assay for exosomes based on aptamer recognition and polydopamine-functionalized gold nanoparticles for signal amplification. Microchim Acta， 2020， 187（4）： 1-9.

［17］ Picciolini S， Gualerzi A， Vanna R， et al. Detection and characterization of different brain-derived subpopulations of plasma exosomes by surface plasmon resonance imaging. Anal Chem， 2018， 90（15）： 8873-8880.

［18］ Fan Y， Duan X， Zhao M， et al. High-sensitive and multiplex biosensing assay of NSCLC-derived exosomes via different recognition sites based on SPRi array. Biosens Bioelectron， 2020， 154： 112066.

［19］ Wu W， Yu X， Wu J， et al. Surface plasmon resonance imaging-based biosensor for multiplex and ultrasensitive detection of NSCLC-associated exosomal miRNAs using DNA programmed heterostructure of Au-on-Ag. Biosens Bioelectron， 2021， 175： 112835.

［20］ Chen W， Li J， Wei X， et al. Surface plasmon resonance biosensor using hydrogel-AuNP supramolecular spheres for determination of prostate cancer-derived exosomes. Microchim Acta， 2020， 187（11）： 1-10.

［21］ Yang Y， Shen G， Wang H， et al. Interferometric plasmonic imaging and detection of single exosomes. Proc Natl Acad Sci U S A， 2018， 115（41）： 10275-10280.

［22］ Yang Y， Zhai C， Zeng Q， et al. Multifunctional detection of extracellular vesicles with surface plasmon resonance microscopy. Anal Chem， 2020， 92（7）： 4884-4890.

［23］ Lim C Z J， Zhang Y， Chen Y， et al. Subtyping of circulating exosome-bound amyloid β reflects brain plaque deposition. Nat Commun， 2019， 10： 1144.

（收稿日期：2022-12-15）

（本文編輯：林燕薇）