菌磷耦合下紫花苜蓿的干物質產量及磷素空間分布特征

劉選帥，孫延亮，馬春暉，張前兵

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003）

磷是植物生長發育過程中必需的三大營養元素之一，也是影響作物產量的關鍵因素。實際生產中，人們常通過施肥來增加土壤磷含量進而實現作物增產的目的。然而，施入土壤中的磷只有少部分被植株吸收利用，約有70%~90%的無機磷被鈣、鐵、鋁等金屬陽離子吸附固定形成難溶性磷酸鹽，導致磷素利用效率普遍較低，限制作物生長[1］。磷是地球上不可再生資源，大量施用磷肥不僅造成磷礦資源浪費，還會使磷在土壤富集，引起水體富營養化等環境問題[2］。因此，提高土壤磷素利用效率對農業減肥增效、高質量可持續發展及減少土壤磷污染均具有重要的現實意義。

土壤微生物對土壤有機質的分解和養分的循環發揮著關鍵的作用。在根際土壤微生物與植物形成的共生體中，根際土壤微生物能夠提高土壤中的可利用養分含量，并促進植物吸收利用養分[3］。叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）和解磷細菌（phosphorus solubilizing bacteria，PSB）均為土壤微生物中重要的有益菌群，在促進植物攝取養分方面起著重要作用[4］。AMF 能與宿主植物根系合作共生，其形成的特有菌根結構擴大了植物對土壤磷素的攝取范圍，從而改善了植物的磷營養[5］。同時，接種AMF 后，植物根系分泌的磷酸酶及有機酸含量增多，改變了根際土壤pH，這有利于難溶性磷酸鹽的水解[6-7］。研究表明，對玉米（Zea mays）及高粱（Sorghum bicolor）接種AMF 后，顯著提高了植株全磷含量[8］。PSB 發揮作用的基礎是其分泌的磷酸酶和有機酸等物質，通過酶解和酸解作用溶解土壤中不溶性磷酸鹽[9-10］，進而增加土壤中植物可吸收磷的濃度。另有研究表明，對小麥（Triticum aestivum）接種芽孢桿菌（Bacillussp.）后，其根際土壤磷含量及植株磷含量得到明顯改善[11］。相比于單一接種，混合接種AMF 和PSB 顯著增強了植物的生長，兩種菌間表現出了明顯的協同關系[12］。這是因為AMF與PSB 的聯合作用不僅提高了土壤肥力，而且增加了根系微生物的物種豐富度，這些因素共同構成了利于AMF與PSB 生存的根際土壤環境[13］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種多年生優質豆科飼草，種植苜蓿對優質畜牧業的高質量發展具有十分重要的意義。新疆石河子地區土壤速效磷含量較低，占比不到全磷的1%[14］，而苜蓿是一種磷敏感型植物，缺磷在影響苜蓿生長的同時還間接限制了其生物固氮效率，這最終嚴重制約了當地苜蓿的優質高效生產。雖然國內外眾多學者關于施磷及接菌對植物生長的影響進行了大量研究，但目前關于施磷條件下混合接種解磷菌對苜蓿生長的研究相對較少，尤其是施磷條件下接種不同混合比例AMF 與PSB 對苜蓿植株磷含量及土壤有效磷含量的影響及各指標之間關系的研究則罕見報道。因此，本試驗開展施磷條件下不同比例接菌對苜蓿植株磷含量、土壤有效磷含量及干物質產量的影響研究，闡明菌磷交互條件下苜蓿各指標間的相互關系，以期篩選出適合苜蓿高效生產的最佳菌磷互作模式，為提高紫花苜蓿的磷素利用效率及優質高效生產提供理論依據及數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿品種選用WL366HQ（購于北京正道生態科技有限公司），其產量高，抗寒能力優秀，耐刈割，持久性強。

AMF 菌劑為摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae），購自青島農業大學菌根技術研究所，以含有孢子、菌絲體的沙土及其寄主植物白三葉（Trifolium repens）的根段混合物作為菌種接種物，孢子密度為20~30 個·g-1，菌根侵染率大于80%。PSB 選用巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），由中國農業微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China，ACCC）提供，菌種編號為10011。巨大芽孢桿菌自-80 ℃冰箱取出，經活化后用LB 培養基（胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，pH 7.2）在37 ℃下培養24 h，再經滅菌生理鹽水調整至108cfu·mL-1濃度的菌液作為PSB 接種菌液。

盆栽基質為滅菌土與珍珠巖（防止土壤板結）[3∶1 （v∶v）］的混合物，供試土壤為灰漠土，采自石河子大學試驗站二連牧草試驗地（44°20′ N，86°30′ E）0~20 cm 耕層，土壤容重1.46 g·cm-3，有機質24.2 g·kg-1，土壤全氮1.53 g·kg-1，堿解氮68.3 mg·kg-1，全磷0.22 g·kg-1，速效磷15.7 mg·kg-1，速效鉀132.6 mg·kg-1。土樣風干后過5 mm 篩，剔除石塊和植物根段，高壓蒸汽滅菌（115 kPa，121 ℃）備用。

1.2 試驗設計

試驗采用雙因素完全隨機設計。設接菌和施磷兩個因子，其中接菌因素設5 個雙接菌比例（AMF∶PSB），分別為：3∶7（施摩西管柄囊霉3 g·pot-1，巨大芽孢桿菌7 mL·pot-1）、4∶6、5∶5、6∶4 和7∶3，依次簡記為J1、J2、J3、J4和J5。施磷（磷源為磷酸一銨，含P2O552%）設2 個磷素水平，分別為施P2O5：0（P0）和100 mg·kg-1（P1，當地苜蓿高產田施用量）。共計10 個處理，每個處理重復10 次。

盆栽試驗在石河子大學農學院試驗園（44°18′ N，86°03′ E）進行。挑選籽粒飽滿、大小相近的帶包衣的種子于2021 年5 月1 日種入已經提前裝入盆栽基質及接過菌劑的花盆中（每盆約含3 kg 盆栽基質），種植深度為2 cm。試驗用花盆規格為23 cm×15 cm×17 cm（盆口直徑×盆底直徑×高），花盆在種植前用75%酒精消毒備用。待苜蓿幼苗長至三葉期進行間苗，留10 株長勢均一的苜蓿植株用于后續指標測定。

在幼苗生長期間每隔7 d 施加一次無磷Hoagland’s 營養液（每盆200 mL），同時每天傍晚澆水以保證花盆土壤水分的相對恒定（保持在田間持水量的65%~75%）。于2021 年6 月18 日將提前計算好施用量的磷肥一次性隨水施入。為消除磷酸一銨（含N 11.2%）中N 對試驗結果的影響，本試驗在P0處理施入尿素（含N 46.0%）以使各處理含等量的N。苜蓿在初花期（開花15%）進行收割，共收割3 茬，具體時間為2021 年7 月4 日、8 月15 日和9月21 日。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 干物質產量的測定 每個處理選取長勢均勻的苜蓿植株3 盆，用剪刀在距花盆土壤表面2 cm 處剪下植株的地上部分稱質量，所得質量即為苜蓿植株的鮮質量。隨后將采取的苜蓿鮮樣在烘箱中于105 ℃下烘干30 min 后，再于65 ℃下烘干至恒質量，此質量即為苜蓿干物質產量。

1.3.2 苜蓿植株磷的測定 待苜蓿烘干稱重后，按苜蓿植株不同部位（地上部上、中、下）及不同器官（莖、葉、花、根）進行人工分離并用小型粉碎機粉碎，采用H2SO4-H2O2消煮-鉬銻抗比色法[15］分別測定苜蓿地上部上1/3、中1/3 和下1/3 植株磷含量及莖、葉、花和根中的磷含量。

1.3.3 土壤有效磷的測定 采用抖根法[15］收集土壤，直接從苜蓿根上抖落下來的土為非根際土，用毛刷從根上刷下來的土視為根際土。采回的非根際土和根際土經自然風干過0.83 mm 篩后，采用0.5 mol·L-1的NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法[15］測定土壤有效磷含量。

1.3.4 磷素利用效率的測定 具體公式[16］為：

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2019 和DPS 7.05 軟件進行統計分析，采用新復極差法（Ducan’s multiple range test，DMRT）進行差異顯著性分析，用Origin Pro 2022（Origin Lab，美國）軟件進行作圖和皮爾遜相關分析。采用隸屬函數分析法[17］綜合評價出最優處理，具體公式為：

式中：Xij為第i個處理中第j個指標的觀測值；Ximax、Ximin分別為所有處理中第j項指標的最大值和最小值。UX（+）為正向指標隸屬函數值，UX（-）為負向指標隸屬函數值。隸屬函數值的范圍為0~1。綜合所有指標的隸屬函數值可以得到各處理的平均隸屬函數值，平均隸屬函數值越大，相應處理的綜合效果越好。

2 結果與分析

2.1 不同處理下紫花苜蓿的植株磷含量

各茬次的接菌、施磷及菌磷交互效應對苜蓿磷含量均有顯著影響（P<0.05）（表1 和圖1）。相同接菌條件下，除第3 茬J5處理下的苜蓿磷含量為P1與P0之間無顯著差異外（P>0.05），其余各茬次各處理的磷含量均表現為P1處理顯著大于P0處理（P<0.05）。P0條件下，除第2 茬的苜蓿磷含量為J3處理顯著大于J1、J2、J4和J5處理外（P<0.05），第1 和3 茬均為J5處理顯著大于其他處理（第3 茬的J3處理除外） （P<0.05）；P1條件下，前兩茬苜蓿磷含量均為J5處理顯著大于其他處理（第2 茬的J3處理除外）（P<0.05），而第3 茬各接菌處理間的苜蓿磷含量均差異不顯著（P>0.05）。

圖1 不同處理下苜蓿植株磷含量Fig.1 Phosphorus content in alfalfa under different treatments

表1 紫花苜蓿磷含量相關指標的主效應均值和統計分析結果Table 1 Main effect means and statistical analysis results of phosphorus content related indexes of alfalfa

2.2 不同菌磷處理下紫花苜蓿不同器官的磷含量

不同菌磷處理下紫花苜蓿不同器官磷含量的結果表明（表1 和圖2），施磷、接菌和菌磷互作對苜蓿各器官中磷含量均具有極顯著影響（P<0.01）。

圖2 不同處理下苜蓿不同器官的磷含量Fig.2 Phosphorus content in different organs of alfalfa under different treatments

相同接菌條件下，除第1 茬的J5處理、第3 茬的J3和J5處理外，苜蓿莖稈磷含量均為P1處理顯著大于P0處理（P<0.05）（圖2A）；除第3 茬的J5處理外，苜蓿葉片磷含量均為P1處理顯著大于P0處理（P<0.05）（圖2B）；苜蓿花中磷含量表現為除第1、2 茬的J5處理和第3 茬的J2處理中P1處理與P0處理間差異不顯著外（P>0.05），其余茬次中各接菌處理均為P1處理顯著大于P0處理（P<0.05）（圖2C）；除第1 茬的J2、J4處理及第2 茬的J1、J4和J5處理外，P1處理下的根中磷含量顯著大于P0處理（P<0.05）（圖2D）。P0條件下，除第2 茬的J2與J5處理間差異不顯著外（P>0.05），苜蓿莖稈磷含量各茬次均表現為J5處理顯著大于其他各處理（P<0.05）；苜蓿葉片和花中磷含量也均為J5處理顯著大于其他各處理（除花中第1、2 茬的J3處理外，P<0.05）；苜蓿根中磷含量除第1 茬外，后兩茬均表現為J4、J5處理顯著大于J1、J2和J3處理（P<0.05）。P1條件下，苜蓿各器官各茬次磷含量各不相同，無明顯規律。苜蓿不同器官磷含量由高到低依次為：花>葉>根>莖。

2.3 不同菌磷處理下紫花苜蓿地上部不同部位磷含量

菌磷交互效應對苜蓿地上部不同部位的磷含量均具有極顯著影響（P<0.01）（表1 和圖3）；苜蓿上、中、下部位磷含量均對接菌效應有極顯著響應（P<0.01）；施磷效應對苜蓿各部位磷含量均有極顯著影響（P<0.01）。

圖3 不同處理下苜蓿地上部不同部位磷含量Fig. 3 Phosphorus content in different parts of alfalfa shoots under different treatments

相同接菌條件下，苜蓿植株上部磷含量（圖3A）除在第1 茬的J5處理、第2 茬的J3處理和第3 茬的J5處理外，其余各處理均為P1顯著大于P0（P<0.05）；苜蓿植株中部磷含量（圖3B）除在第1 茬的J4和J5處理、第2 茬的J3處理、第3 茬的J5處理外，其余各處理均為P1顯著大于P0（P<0.05）；除第1 茬的J3、J4和J5處理、第2 茬的J3和J5處理及第3 茬的J2和J5處理外，苜蓿下部磷含量均表現為P1處理顯著大于P0處理（P<0.05）（圖3C）。P0條件下，除第2 茬的J3處理和第3 茬的J2處理外，苜蓿上部磷含量均為J5處理顯著大于其他各處理（P<0.05）；除第1 茬的J4和J5處理顯著大于J1、J2和J3處理外（P<0.05），其余兩茬的苜蓿中部磷含量均為J5處理顯著大于其他各處理（P<0.05）；苜蓿下部磷含量為除第3 茬外，前兩茬表現為J5處理顯著大于其他各處理（P<0.05）。P1條件下，苜蓿各部位各茬次磷含量各不相同，無明顯規律。苜蓿地上部不同部位磷含量由高到低依次為：上部>中部>下部。

2.4 不同菌磷處理下土壤有效磷含量

不同菌磷處理下土壤有效磷含量如表1 和圖4 所示，除第3 茬非根際土壤有效磷和第2 茬根際土壤有效磷外，菌磷交互均對土壤有效磷含量有極顯著影響（P<0.01）；除第3 茬非根際土壤有效磷含量對接菌的響應不顯著外（P>0.05），接菌效應對各茬次根際和非根際土壤有效磷含量均有極顯著影響（P<0.01）；施磷對土壤有效磷含量具有極顯著影響（P<0.01）。

圖4 不同處理下土壤有效磷含量Fig.4 Soil available phosphorus content under different treatments

相同接菌條件下，除第1 茬的J4處理與第3 茬的J1和J2處理外，非根際土壤有效磷含量均為P1處理顯著大于P0處理（P<0.05）；根際土壤有效磷含量均為P1處理顯著大于P0處理（P<0.05）。P0條件下，第1 茬非根際土壤有效磷含量為J5處理顯著大于J1處理（P<0.05），而J2、J3和J4間差異不顯著（P>0.05），后兩茬各接菌處理間也均不顯著（P>0.05）；苜蓿根際土壤有效磷含量在第1 茬表現為J2處理顯著大于其他各處理（P<0.05），第2 茬J2處理顯著大于J1和J4處理（P<0.05），而 第3 茬 為J1處 理 顯 著 小 于J3和J4處 理（P<0.05）。P1條件下，除第2 茬外，其余兩茬的根際土壤有效磷含量均表現為J1處理顯著大于其他各處理（P<0.05）；非根際土壤有效磷在P0條件下無明顯規律。不同處理下根際土壤有效磷含量大于非根際土壤。

2.5 不同菌磷處理下紫花苜蓿的干物質產量和磷素利用效率

苜蓿干物質產量受接菌和施磷的影響顯著（表1和表2）。相同接菌條件下，P1處理下的干物質產量均大于P0處理，但只在第1 茬的J1和J4處理、第2 茬的J3處理及第3 茬各處理下，P1處理與P0處理存在顯著差異（P<0.05）。P0條件下，第1 茬干物質產量為J1、J2、J3和J4處理顯著大于J5處理（P<0.05），第2 茬干物質產量雖仍表現為J1、J2、J3和J4處理大于J5處理，但僅在J1和J4處理表現為顯著大于J5處理（P<0.05），第3 茬各接菌處理間均差異不顯著（P>0.05）；P1條件下，第1 茬干物質產量均為J1、J2、J3和J4處理顯著大于J5處理（P<0.05），而第2 茬各接菌處理間均差異不顯著（P>0.05），第3 茬僅在J1處理顯著大于J5處理（P<0.05）。在不同接菌比例下，P1處理的總苜蓿干物質產量相比P0處理增大了12.65%~19.85%，在J4P1處理下達到最大值，為49.31 g·pot-1。苜蓿磷素利用效率在不同接菌比例下表現不同，最大值出現在J4P1處理，為27.23%，相比磷素利用效率最低的處理（J5P1處理）提高了65%。

表2 不同處理下紫花苜蓿的干物質產量和磷素利用效率Table 2 Dry matter yield and phosphorus use efficiency of alfalfa under different treatments

2.6 相關性分析

苜蓿植株磷含量、根際土壤有效磷含量、非根際土壤有效磷含量、磷素利用效率和總干物質產量兩兩互為正相關（表3）。其中，總干物質產量與根際土壤有效磷含量和磷素利用效率呈極顯著正相關（P<0.01），與非根際土壤有效磷含量呈顯著正相關（P<0.05）；植株磷含量與根際土壤有效磷含量和磷素利用效率均呈極顯著正相關（P<0.01），與非根際土壤有效磷含量呈顯著正相關（P<0.05）；根際土壤有效磷含量與非根際土壤有效磷含量和磷素利用效率呈極顯著正相關（P<0.01）；非根際土壤有效磷含量與磷素利用效率呈極顯著正相關（P<0.01）。

表3 各指標相關性分析Table 3 Correlation analysis of each index

2.7 隸屬函數分析

為了綜合評價各處理的優劣和避免單一指標分析的片面性，本試驗選取了10 個處理的苜蓿植株磷含量、非根際土壤有效磷含量、根際土壤有效磷含量、干物質產量和磷素利用效率5 個指標采用隸屬函數法進行綜合評價。對10 個處理的隸屬函數平均值進行排序（表4），J1P1處理的平均隸屬函數值最大，為0.798，其次是J3P1和J4P1處理，平均隸屬函數值分別為0.797 和0.762。

表4 不同處理下各指標隸屬函數分析Table 4 Membership function analysis of each index under different treatments

3 討論

磷作為植物生命活動中重要的營養因子，參與植物體細胞的構成和多種活動的代謝，與植物的產量密切相關。研究表明，適量施磷促進了作物的生長發育[18］。AMF 和PSB 都是解磷微生物的一大類群，解磷微生物可明顯改善植物磷營養。根際互作（包括植物根系分泌物和土壤中真菌、細菌的互作）對植物養分的周轉和獲取至關重要[19］。AMF 與植物建立共生關系后，一方面，可以通過AMF 龐大的菌絲網絡攝取土壤中的磷及其他礦質元素并運送至宿主植物中，從而促進植物生長[5，20］；另一方面，AMF 可通過影響根際土壤磷酸酶的活性及有機酸的組成和含量來活化土壤中的難溶性磷酸鹽化合物[7，21］，且酸解過程中釋放出的質子能夠降低根際土壤pH，這進一步加強了螯合態磷酸鹽的活化[7］。此外，PSB 與AMF 的合作顯著增強了作物的生長[4，12］。

本研究結果表明，施磷和接菌對苜蓿植株磷含量的影響十分顯著，相同接菌條件下，施磷處理的苜蓿相比于未施磷處理具有更高的植株磷含量，這是因為施磷擴大了植物吸收的磷源，而磷是光合作用的底物，施磷可通過增加苜蓿葉片的葉綠素含量和光合性能來進一步促進苜蓿干物質產量的形成[22］。可見，苜蓿磷含量與苜蓿干物質產量呈正相關。本研究中，相同施磷條件下，各茬次不同比例接種AMF 與PSB 對苜蓿磷含量的影響不盡相同，總體來看，J5處理下的植株磷含量顯著大于其他處理，各器官及各部位的磷含量也表現出相同規律。這與植物的根際環境緊密相關，混接處理下的根際環境因比例不同其促生效應可能也存在較大差異。大多情況下，AMF 與PSB 有著良好的協同關系[23］，但在土壤C/P 較高時，PSB 也會與AMF 競爭土壤中的磷[24］。本研究結果表明，在AMF 與PSB 為7∶3 的混合比下（J5處理），苜蓿具有較大的磷含量，說明土壤C/P 較低，此時AMF 與PSB可能具有較好的協同關系。

本研究中，苜蓿花和葉的磷含量以及植株上部的磷含量較大，這主要是因為磷含量多存在于植物幼嫩的葉及根尖組織中，此外，在苜蓿由營養生長階段進入繁殖生長階段后，植物為了繁殖需要，植株體內的磷含量更多地由葉片向植物的繁殖器官（花）集中[25］，而莖稈本身纖維含量較多，磷素含量較少，且隨著其生育時期的推進加劇了莖稈的木質化，這也解釋了本試驗中不同器官及不同部位磷含量的分布情況。

土壤有效磷指植物短期可直接吸收利用的磷，一般以HPO42-和H2PO4-形式為主[26］，是評價土壤供磷能力的重要指標[27］。研究表明，施磷能夠提高土壤的有效磷含量，但施入土壤中的磷極易被吸附固定，導致土壤有效磷含量較低，有效磷的缺乏嚴重限制了作物的生長發育[1］。AMF 與PSB 等解磷微生物可以通過多種途徑活化難溶性磷酸鹽來提高土壤中磷的有效性，進而促進植物對土壤磷素的吸收利用及其產量的積累[28］。本研究結果表明，根際土壤有效磷含量和非根際土壤有效磷含量均與苜蓿總干物質產量呈極顯著正相關。可見，苜蓿的干物質產量形成與土壤有效磷含量密切相關。土壤微生物磷是植物磷營養極其重要的來源，在土壤磷素的攝取和運輸中發揮著重要作用[29］。研究表明，接種AMF 的根際土壤微生物量磷顯著高于非根際土壤[7］。本研究結果表明，根際土壤有效磷含量明顯大于非根際土壤有效磷含量，這與前人的研究結果一致。有研究發現，植物根際土壤解磷菌數量遠大于其他區域土壤的數量[30］，這也佐證了本研究觀點，說明根際解磷微生物在改善植株磷素吸收方面發揮著重要的作用。

干物質產量是苜蓿生產性能的直接體現，而磷素利用效率反映了作物將磷肥同化為自身營養物質時的效率，與作物產量的形成密不可分[31］。本研究中，磷素利用效率與苜蓿總干物質產量、植株磷含量、土壤有效磷含量均呈極顯著正相關，說明AMF 與PSB 具有良好的協同效應，苜蓿能夠最大程度地利用土壤磷素，改善其磷營養，進而提高苜蓿的磷素利用效率。盡管本試驗中干物質產量和磷素利用效率均在J4P1處理達到最大值，但單個指標分析不足以涵蓋所有信息，故對各指標進行了綜合分析。本研究隸屬函數分析結果得出：最大平均隸屬函數值出現在J1P1處理，即在100 mg·kg-1的施磷條件下，以3∶7 的比例混合施入摩西管柄囊霉和巨大芽孢桿菌對苜蓿的促生作用較為顯著。因此，在實際生產中，合理施用磷肥再配以解磷菌劑是提高苜蓿干物質產量和磷素利用效率的重要措施。

根際微生物間的互作關系與植物的生長密切相關，而這種關系（協同或者拮抗）又受到多種因素的影響，包括微生物的數量、種類、磷濃度等。盡管本試驗對不同接菌比例下苜蓿的干物質產量及磷素空間分布特征進行了探討，但由于本試驗選用的是摩西管柄囊霉和巨大芽孢桿菌這兩種菌，未在其他菌上進行驗證，其他菌間是否出現協同效應尚不清楚。此外，土壤磷濃度對AMF 與PSB 的菌間關系也有顯著影響，但磷如何影響菌間關系進而影響植物生長的具體機制仍有待進一步的深入研究。

4 結論

施磷可以明顯促進紫花苜蓿的生長。不同比例接種AMF 和PSB 對苜蓿生長的影響顯著。苜蓿植株磷主要集中在上部，在器官上主要傾向于向花和葉分布，土壤有效磷主要集中在根際區域。在不施磷條件下，5∶5 的AMF 與PSB 的雙接菌比例能夠最大程度提高苜蓿的生產；在100 mg·kg-1的施磷（P2O5）條件下，以3∶7 的比例混合施入AMF 和PSB，能夠較大程度改善苜蓿的磷營養，從而提高苜蓿的干物質產量和磷素利用效率。