青少年鼻咽血管纖維瘤中HSP90表達及臨床意義*

王娟 王澤 王雪霖 唐煥文

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第970醫院五官科,山東 煙臺 264000)

青少年鼻咽血管纖維瘤(Juvenile nasopharyngeal angiofibroma,JNA)是一種具有局部侵襲性但組織學上良性的血管腫瘤,幾乎只發生于青春期男性,約占所有頭頸部腫瘤的0.5%[1]。JNA呈擴張性和破壞性生長,其可以通過孔和裂擴散到鄰近的鼻腔、鼻咽、鼻旁竇、眼眶和顱底,常以啞鈴狀延伸至翼腭間隙、咀嚼肌間隙和顳下窩[2]。JNA常見的癥狀包括鼻塞(80%)和鼻出血(60%),而更晚期的腫瘤可以導致面部腫脹和視覺或神經障礙。由于JNA的癥狀與包括鼻炎、鼻竇炎和息肉在內的其他鼻咽疾病類似,因此存在延誤診斷的可能[3]。熱休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)是與癌癥進展相關的最活躍的伴侶蛋白之一[4],其在血管生成、細胞增殖、遷移、侵襲和轉移中有重要作用[5]。HSP90在多種癌癥中過度表達,并與其發生發展密切相關,尤其是前列腺癌等許多激素依賴性腫瘤[6]。研究認為其發病可能與雌激素(Estrogen,ER)不足或雄激素(Androgen,AR)相對過多有關[7]。有研究發現使用ER拮抗劑可以治療鼻咽血管纖維瘤,如早期使用雌激素可減少JNA術中失血,且大約50%的侵襲性纖維瘤病對抗雌激素治療有反應[8]。新生血管持續快速形成是腫瘤快速生長的關鍵因素之一,血管生成因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是最主要的調控腫瘤血管發生主要因子,其對血管內皮細胞的增殖及血管構建具有重要的特異性的調節作用。微血管密度(Microvascular density,MVD),又稱之為微血管計數,是衡量腫瘤血管生成的活躍程度的指標之一。MVD與VEGF表達水平可以協同預測評估良惡性腫瘤生長、轉移及復發趨勢[9-10]。HSP90與腫瘤發生密切相關,有研究顯示HSP90抑制劑可以通過抑制包括Akt/mTOR及HIF-1α/VEGF及激素受體等多個通路來調節腫瘤細胞的生長[11]。目前,在JNA中HSP90與VEGF或激素之間相關性的研究較少,因此,本研究擬通過使用組織微陣列(TMA)分析JNA樣本中HSP90的表達水平及其與VEGF與ER的相關性,從而評估HSP90對JNA預后的影響,為患者最佳治療方式的選擇提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年—2022年在我院接受手術治療的60例組織學診斷為JNA的男性患者。所有患者在治療前都提供了關于臨床信息的知情同意書。從醫療記錄中回顧性收集臨床數據。來自10例男性患者的正常中鼻甲樣本作為對照組;中鼻甲標本取自外傷性視神經病變、垂體腺瘤或腦脊液鼻漏患者,中位年齡為21.2歲(12～26歲)。接受手術的JNA患者的中位年齡為16.8歲(10～39歲)。這些患者接受了開放或內窺鏡(包括經鼻內鏡手術和內鏡輔助手術)手術。使用Radkowski系統進行腫瘤分期評估,并通過CT和/或MRI觀察腫瘤的最長直徑以確定腫瘤大小。本研究經醫院倫理委員會批準(批號:2018-01007)。

1.2 患者隨訪 平均隨訪時間為174.5個月(144～206個月)。10例患者失訪,18例患者復發。將沒有肉眼可見的殘留腫瘤定義為完全切除,并通過組織學以及術后CT或MRI進一步證實。患者術后第一年每3個月復查一次,次年每6個月復查一次,然后每年復查一次,直至成年。臨床或放射學上(內窺鏡檢查、CT和/或MRI)在鼻咽區域、鼻腔或鼻竇中發現腫瘤的患者為JNA復發。

1.3 組織微陣列 根據已報道的既定方案生成組織微陣列(TMA)[7]。將1組60個JNA(每個直徑為1.5 mm)在載玻片上隔開,并選擇來自10例男性患者的正常中鼻甲樣本作為正常對照。從每個代表性組織中取出2個核心,并將所有組織核心(直徑1.5 mm)放入可以覆蓋多達160個核心的TMA塊中。

1.4 免疫組織化學分析 采用多克隆抗HSP90(1∶100,Abcam,UK)作為一抗,GTVsion III檢測系統(GK500705,Gene Tec,Shanghai,China)作為二抗和彩色底物溶液。此外,本研究還檢測了VEGF、CD105和ER-α(1∶500,Abcam,UK)蛋白,并根據先前描述的方法計算了微血管密度(MVD)。對組織切片進行脫蠟和復水,抑制內源性過氧化物酶活性,經過洗滌和抗原修復后,在非免疫血清中封閉切片,再將切片與一抗孵育,然后二抗和彩色底物溶液孵育,最后用蘇木精對切片進行復染、洗滌、脫水和封片。以相同方式處理陰性對照,但不添加一抗。

1.5 染色分數 由兩名對臨床數據不知情的獨立研究人員,通過光學顯微鏡半定量估計免疫染色的強度和陽性細胞的百分比。將HSP90表達>5%的樣本作為陽性樣本[9]。免疫反應評分如下:0(無染色);1(與陽性細胞百分比無關的弱免疫反應);2(<75% 的細胞有中度免疫反應性或<25%的細胞有強免疫反應性);3(75%的細胞具有中度免疫反應性或25%的細胞具有強免疫反應性)。每個樣品對應兩個染色缸,對每個染色缸進行評分,最終采用兩個染色缸的平均得分。為了進一步分析,將患者分為低(評分0～1)和高(評分2～3)HSP90表達組兩組。

1.6 統計學分析 采用SPSS 26.0軟件行統計學分析。通過卡方檢驗分析免疫反應標志物與臨床病理學變量的關聯。采用Spearman相關檢驗分析不同標記分子表達水平的相關性。通過Kaplan-Meier方法檢查復發時間(TTR),并通過對數秩檢驗評估TTR的差異。將本研究中達到統計學意義并在以前的研究中具有顯著價值的因素輸入Cox回歸模型進行多變量分析。繪制(ROC)曲線以確定各種參數的預測值。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學分析檢測JNA中HSP90的表達模式 JNA的病理特征包括不規則血管和間質成分,其中血管可分為較大的血管、正弦型血管和較小的毛細血管。TMA的免疫組織化學分析顯示HSP90位于基質成分中成纖維細胞的細胞質和細胞核中,在正弦型血管和較小的毛細血管中有明顯的HSP90表達,在成熟的大血管內皮細胞中僅觀察到微弱的HSP90信號。對照組(取自男性患者的10個正常中鼻甲樣本)中僅檢測到HSP90弱表達,見圖1。

圖1 HSP90染色的微陣列組織(400×)

2.2 臨床病理學特征與HSP90表達的關聯 評估了HSP90表達與JNA基本臨床特征的相關性后發現HSP90與患者年齡相關(P<0.05),但與任何其他基線臨床特征無關:包括腫瘤分期、JNA手術史、手術方法和手術期間出血(P>0.05),見表1。

表1 JNA患者HSP90表達的基本臨床特征的Pearson卡方檢驗分析

2.3 HSP90水平與病理特征的關聯 結果表明,MVD、ER-a和VEGF與JNA患者的HSP90表達顯著相關(P<0.05),見表2。

表2 JNA患者病理特征與HSP90表達的Spearman相關性檢驗分析

2.4 JNA復發患者HSP90水平與臨床病理特征的相關性 50例患者中,18例復發(5年復發率為36.0%),平均復發時間為20.18個月(2～92個月),基于50例患者復發的臨床病理學特征,見表3。與根治性切除后HSP90低表達的患者(20.00%)相比,高HSP90表達的患者復發率(52.00%)升高。晚期腫瘤、MVD較高、出血更明顯,且高ER-α水平患者的復發率顯著較高(P<0.05)。此外,HSP90和ER-α表達的組合也與疾病復發顯著相關(P<0.05)。而其他臨床病理學特征如JNA手術史、手術方式等方面與腫瘤復發差異無統計學意義(P>0.05)。這表明,高HSP90和/或ER-α水平高、MVD水平高、晚瘤分期更晚和手術期間出血更明顯的患者更有可能表現出侵襲性特征。

表3 JNA患者復發臨床病理特征的Pearson卡方檢驗分析

2.5 JNA患者的高HSP90表達與早期疾病復發相關性 在最后一次隨訪中,發現18例患者復發(36.0%)。HSP90高表達的JNA患者1年、3年和5年復發率分別為32.1%、52.8%和57.4%,而HSP90低表達的患者分別為7.5%、16.1%和18.2%。最后,通過Cox比例風險模型進行單變量和多變量分析,以評估HSP90和臨床病理因素對JNA患者復發時間(TTR)的影響,見表4。在單變量分析中結果顯示,HSP90表達顯著影響TTR。此外影響TTR的其他因素包括MVD、術中出血、腫瘤分期和年齡。而后本研究又在多變量Cox比例風險分析中進一步評估了單變量分析中篩選出的的重要因素。結果顯示HSP90、MVD和腫瘤分期是TTR的獨立預后因素。此外在所有臨床病理學特征中,HSP90高表達是預測預后的獨立因素,見表5。

表4 JNA患者復發時間(TTR)的單變量Cox回歸分析

表5 JNA患者復發時間(TTR)的多變量Cox回歸分析

3 討論

JNA復發率相對較高,目前主要的治療方式仍以內鏡切除為主,預防JNA復發,提高患者的預后仍然是外科醫生面臨的主要挑戰。探討JNA發病的機制及評估影響其復發的因素具有重要意義。

目前JNA的發病機制尚有爭議,有研究提出JNA患者體內性激素不平衡學說。后續發現應用雌激素治療兩例JNA患者后腫塊縮小,基于此有研究提出JNA發病可能與患者體內性激素水平失去平衡有關,即患者體內雌激素(ER)、孕激素(PR)不足,促進促性腺激素釋放,進而導致JNA組織增生[12]。

JNA復發與VEGF高表達有關。JNA具有良性腫瘤的形態學特征和惡性腫瘤的生物學特征,研究JNA生長的調節因素對于全面了其發病機制與提高患者預后具有重要的價值。腫瘤中血管增殖活躍程度與其生物學行為密切相關,如腫瘤的生長、浸潤、轉移均與血管生成密切相關,腫瘤內VEGF與MVD水平是重要的反應良惡性腫瘤增殖狀況的指標。與其他具有廣泛作用的成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor,FGF)、血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor,PDGF)等不同的是,VEGF是唯一對血管形成具有特異性促進增殖作用的因子。因此有必要進一步評估JNA與VEGF的臨床相關性。過往研究顯示JNA本質為真性血管瘤,其組織內血管處于過度增殖狀態,而VEGF在JNA中有較高表達,對有較強的促血管生成作用[13]。此外在JNA中TGF-β、HIF-1α表達異常增高、進而調控VEGF表達增高,促進瘤體血管生成。

HSP90與腫瘤促生成因子VEGF及激素如ER之間具有復雜的交叉調控網絡。HSP90分子伴侶是一個普遍存在的蛋白質家族,其通過調節大型多蛋白復合物和配體蛋白的折疊和/或組裝來參與多種細胞功能,直接或間接地調節包括適應壓力、細胞增殖、運動、信號轉導和血管生成在內的多種細胞過程[14]。HSP90下游大概約200多種靶蛋白,其中大部分與腫瘤發生、發展以及轉移密切相關,是腫瘤號通路的一個關鍵靶點[15]。有研究顯示HSP90-ERK-VEGF信號通路在腸癌所致血管內皮細胞遷移和管狀生成中發揮重要作用[16]。也有研究顯示抑制HSP90活性是治療胰腺癌的有效方式,抑制HSP90可中斷對吉西他濱和5-FU耐藥的胰腺癌細胞中包括VEGF信號通路在內的多個關鍵致癌信號級聯反應,進而有效的抑制癌細胞抗凋亡和增殖[17]。此外最近的研究表明,HSP90與多種腫瘤的發生和發展密切相關,其中包括許多激素依賴性腫瘤[18]。從機制上來講HSP90可以通過與ER、PR和糖皮質激素等游離類固醇激素受體結合來維持激素的穩定和失活狀態進一步調控腫瘤的發生發展。此外還有研究顯示激素受體和VEGF之間的相互作用可能參與JNA的發生和發展[19]。

本研究評估了HSP90的表達并評估了其與JNA臨床病理學變量之間的關聯,發現JNA中HSP90的高表達與原發腫瘤切除后的高復發率相關。這與之前的研究結果一致,即HSP90的高表達是多種癌癥預后不良的標志物[20]。此外本研究還發現HSP90的表達與MVD和VEGF等腫瘤血管生成相關因子顯著正相關。這些結果預示著HSP90可能是阻斷JNA術后復發的有效分子靶點之一。

目前已知的HSP90抑制劑主要有格爾德霉素及其衍生物、根赤殼菌素、新生霉素以及以嘌呤結構為基礎的化合物4大類[21-24]。這些抑制劑可以通過抑制HSP90功能來破壞分子伴侶復合物結構,推動下游蛋白酶體降解,進一步增加腫瘤細胞對治療的敏感性并優化藥物功效。此外更多的HSP90抑制劑正在進行藥物試驗中,考慮到JNA的惡性腫瘤的生物學特征,進一步評估HSP90抑制劑在JNA治療中的價值對于防治JNA及改善JNA患者預后是有必要的。本研究尚存在一些局限性,由于JNA是一種侵犯顱底孔、神經和血管的腫瘤,臨床實踐中存在難以準確評估邊緣狀態的困難。目前尚缺乏HPS90在JNA中的分子機制研究。因此,多中心、前瞻性研究及進一步深入的機制研究是必須的,這有助于進一步闡明HSP90在JNA復發中的功能及意義,從而為臨床防治JNA及改善預后提供有益參考價值。

4 結論

本研究表明HSP90高表達與JNA復發相關,HSP90可能通過穩定雌激素受體及血管生成因子來發揮促JNA復發作用。此外本研究從臨床角度強調了應用HSP90抑制劑是預防JNA術后復發、改善JNA患者預后的潛在的有效方法之一。