一種分區溫控的實時熒光PCR快速熱循環系統設計

陳爾東, 高孜航, 王坤東, 雷華明

(上海交通大學 電子信息與電氣工程學院,上海 200240)

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術可以實現體外快速擴增DNA片段,自1983年由Mullis等[1]發明以來被廣泛運用于基因檢測領域.由此發展而來的實時熒光定量PCR儀通過熒光分子插入DNA片段中實現對待測DNA樣本的定量檢測[2].PCR反應主要分為3步:變性、退火、延伸.重復這3個步驟實現DNA片段的分裂、配對和復制,該反應需要熱循環系統精確控制樣品在65～95 ℃循環[3-4].PCR的效率和速度取決于反應的內容如聚合酶濃度和引物設計[5],以及有效溫度循環、影響反應開始時的轉變溫度和斜坡溫度的持續時間[6].目前常見的PCR熱循環系統存在耗時長、操作復雜、設備成本高的問題[7].其通過保持試液靜止,控制加熱基座溫度變化對試液進行升溫和降溫[8],完成一次檢測需要進行35～40次溫度循環約2～3 h,時間大部分耗費在控制加熱基座和周圍環境的溫度變化上[9-11].針對上述問題,Wu等[12]開發了基于管道的油浴PCR加熱方法,通過多物理場仿真,確定合適的管道尺寸,利用液體自然對流實現不同溫度之間的循環流動.Li 等[13]使用半導體制冷器(Thermoelectric Cooler,TEC)作為熱源,通過改進的多模式比例積分微分 (Proportional Integral Derivative, PID)算法減少穩態時間、提高反應速率,該方法需要復雜的溫控算法,在溫度變化過程中容易受到超調、振蕩的不良影響[14].Trauba等[15]采用微流控技術使用4個銅塊作為熱源,20 μL樣品流經由聚碳酸酯制成的微流體管道實現加熱,約52 s 可以實現30次循環,但這類PCR制造成本高且后期不能修改循環次數[16].此外,也有學者使用非接觸式傳熱方式來提高效率,Lee等[17]采用激光對樣品進行加熱,與傳統方式相比激光能量密度高且沒有熱慣性,可以有效提高熱循環效率,但設備結構復雜、成本高且難以小型化.

隨著PCR技術的發展,研究人員發現將退火溫度和延伸溫度合為一個溫度也能實現基因擴增,即兩步法 PCR,常用于靶基因較短的擴增,該方法和需要3個不同溫度點的標準PCR反應相比,所需時間較短,控制較為方便[18].本研究采用二步法PCR方案,設計了PCR熱循環系統的機械結構及其溫控電路,使用增量式PID算法控制基座溫度穩定在65和95 ℃實現兩個恒溫區,通過使樣品盤在不同恒溫區域中旋轉,實現快速溫度循環.避免了加熱器件溫度反復變化,能明顯節約反應時間,提高檢測效率.同時,針對PCR試液溫度變化過程中的傳熱滯后效應[19-20],分析了該熱循環系統的結構并構建傳熱機理,采用Fluent軟件對試液加熱的延遲現象進行有限元分析.由上述仿真結果對該熱循環系統PCR試液的真實溫度變化規律進行合理預測并對溫度延遲時間補償,最后利用PCR熱循環系統樣機進行試驗驗證,得到試液的實際溫度變化,結果表明該設計PCR熱循環系統能提高檢測效率,滿足快速PCR檢測的需求.

1 PCR熱循環系統硬件設計

1.1 機械結構設計

PCR熱循環系統的機械結構主要包括加熱基座和試液盤,如圖1所示.加熱基座實現分區溫控,將溫度分為65 ℃恒溫區、95 ℃恒溫區、冷卻區.試液盤具有4個試液腔可以同時檢測4路樣品.腔體底部采用一層薄膜,隔絕外部環境又能保證與加熱塊緊密接觸增加傳熱效率.加熱基座包括6個紫銅加熱塊,用溫控電路將加熱塊穩定在設定溫度,加熱塊之間使用硅酸鋁棉包覆以降低與空氣的對流換熱系數,銅塊由下方的加熱陶瓷片進行加熱,溫度傳感器嵌入鋁塊和陶瓷加熱片之間檢測加熱基座的溫度.

將待測試液裝載樣品盤中后,上位機發送指令控制樣品盤旋轉,依次經過95 ℃恒溫區、冷卻區、65 ℃ 恒溫區,旋轉一周可實現2次熱循環.重復以上過程以實現DNA的擴增.在每次循環結束后,試液腔都會經過加熱基座上的熒光檢測開孔,激發光和熒光分別經過該孔入射和出射,實現實時熒光定量檢測功能.

1.2 電路設計

PCR熱循環的電路部分實現對兩個恒溫區溫度的高精度控制,確保PCR反應能正常進行.其電路的主要成如圖2所示,包括上位機、主控模塊、溫控驅動模塊、測溫模塊.

圖2 PCR熱循環系統電路構成Fig.2 Circuit composition of PCR thermal cycling system

主控模塊由STM32C8T6及外圍電路組成,主要控制脈沖寬度調制(Pulse Width Modulation, PWM)驅動電路加熱陶瓷片、讀取溫度值以及將溫度數據通過控制器局域網總線(Controller Area Network, CAN)通信協議傳輸給上位機模塊.

溫度驅動模塊主要由L6203橋式驅動芯片和加熱陶瓷片組成,主控模塊產生PWM信號,通過SN74LVCT45將晶體管-晶體管邏輯(Transistor-Transistor Logic, TTL)電平轉換為+5 V電平的同時增加驅動能力,最后輸出到L6203芯片產生最大5 A的電流驅動加熱陶瓷片.采用的薄膜陶瓷片內阻為10 Ω,考慮芯片的散熱條件,最大加熱功率能達到10 W,系統啟動時加熱基座能到達最快6 ℃/s 的升溫速率.

測溫模塊能實時采集加熱基座的溫度,并作為溫控程序的反饋信號,以保證溫度恒定,使PCR反應能正常完成.該模塊主要包括溫度傳感器和AD采集電路,反應溫度主要集中于50～100 ℃的中低溫范圍,溫度傳感器采用Pt100鉑電阻,其精度高、穩定性好,若將溫度傳感器直接放入樣品腔中能直接測出試液溫度但容易污染試液,因此將Pt100嵌入陶瓷加熱片上,后續通過分析傳熱過程預估試液的真實溫度.AD采集電路部分使用24位模數轉換器LTC2440,采用三線制電橋法測量Pt100阻值變化,隨后通過AD620儀表放大器,放大倍數設15倍使其輸出接近AD的量程,達到最佳精度.經測試,溫度采集精度能到達±0.1 ℃.

2 試液溫度仿真分析

2.1 傳熱機理分析

PCR熱循環系統使用的熱傳遞方式主要為熱傳導.試液加瓷加熱片—質加熱基座—試管—試液,這是一個非穩態熱傳遞過程.在經過一定時間后,試液溫度才能逐漸穩定在設定溫度上.因此試液在每個恒溫區的停留時間為反應時間和溫度穩定需要的時間之和.試液處在一個體積小、密封的環境中做旋轉運動,難以布置傳感器在不影響反應的情況下直接測得試液溫度,因此采用Fluent對該瞬態熱傳遞過程進行有限元分析得到試液的真實溫度變化曲線.

2.2 仿真模型構建

由熱力學原理可知,熱傳遞可分為3類邊界條件:①給定邊界溫度;②給定邊界熱流密度;③給定邊界換熱系數和流體溫度.PCR熱循環系統的熱傳遞涉及流固耦合傳熱,使用Fluent進行仿真分析.由于試液腔下方與加熱基座直接接觸,所以加載第一類邊界條件,樣品盤上方及左右與空氣直接接觸加載第三類邊界條件.4個試液位置對稱且傳熱條件一致,因此只對其中一個樣品的傳熱過程進行仿真.各材料對應熱性能參數如表1所示.

表1 傳熱模型各區域熱物性參數

首先使用meshing進行網格劃分,全局網格尺寸設置為0.2 mm,在不同材料的傳熱表面對網格進行膨脹加密以提高計算準確性.總共生成節點數量 98 426,單元數量 349 878,反應網格質量的偏態(skewness)系數為0.208,表明具有較好的網格質量,網格模型如圖3所示.

圖3 傳熱模型網格劃分和仿真溫度云圖Fig.3 Meshing and simulation temperature cloud map of heat transfer model

2.3 仿真結果分析

反應的每個階段保持時間取決于檢測目標和引物的種類[21-22],以目前常見的PCR反應為例進行仿真.設定在單次循環過程中,需在95 ℃溫度(T)下保持時間(t)15 s,65 ℃保持40 s.如圖4所示,將該溫度曲線加載為試液的邊界條件進行仿真,取試液中心點的溫度值繪制曲線.在變性階段試液溫度從65 ℃升溫到95 ℃,此過程僅耗時5.8 s,保持該溫度15 s,隨后試液溫度經過6.1 s從95 ℃下降并穩定在65 ℃進入退火/延伸階段.在每個擴增循環中試液的升溫和降溫過程中損耗的時間僅為11.9 s,完成一次循環所需的時間為68 s.相較傳統的變溫式加熱方法有效提升了反應速率.

圖4 PCR單次循環試液溫度仿真Fig.4 Temperature simulation of PCR single cycle test solution

3 溫控算法設計

在PCR技術中,對溫度的控制非常重要.在高溫變性階段如果溫度過高會影響聚合酶的活性降低DNA擴增效率,如果溫度過低會導致變性不充分,極可能出現假陰性;在低溫退火階段溫度過高或者過低則會影響PCR反應的特異性.尤其對于定量PCR儀而言,需要盡可能保持每次循環溫度穩定.因此,對于PCR的溫度控制要求控制精度高、超調小、調節時間短.該設計采用分區溫控的熱循環方式,可以簡化溫控算法,只需保證有較小的調節時間和靜態誤差,無需讓加熱片反復升溫和降溫.因此采用經典PID控制,其是最早發展起來的控制策略之一,算法簡單、魯棒性好、可靠性高,被廣泛應用于工業過程控制[23].PID算法可表示為

(1)

式中:Kp為比例控制系數;Ki為積分控制系數;Kd為微分控制系數;e(t)為當前值與目標值的誤差.Kp能加快系統響應速度,但數值過大容易產生超調;Ki能減小系統靜態誤差,積分過大容易影響系統穩定性;Kp根據偏差變化趨勢調節系統,能降低調節時間,但過大會引起系統振蕩.為了減小誤差累加,增加系統抗干擾能力,采用增量式PID算法,其算式為

Δu(k)=Kp(e(k)-e(k-1))+Kie(k)+

Kd(e(k)-2e(k-1)+e(k-2))

(2)

式中:Δu(k)為控制量的增量;e(k)、e(k-1)和e(k-2)為最近3次采樣的誤差值.Δu(k)僅與最近3次的采樣值有關,與位置式PID相比占用內存小,改善了積分飽和現象.

最后利用Ziegler-Nichols方法進行參數整定.首先對65 ℃加熱模塊進行整定,將Kd=0、Ki=0,Kp設置為較小的值,隨后逐漸增大Kp使系統出現等幅振蕩,記錄此時的增益和振蕩周期,最后用經驗公式求得PID參數為Kp=210、Ki=32、Kd=18.采用類似方法得到95 ℃的PID參數為Kp=100、Ki=110、Kd=250.該參數下基座的升溫曲線實驗結果如圖5～6所示.

圖5 65 ℃恒溫區基座升溫曲線Fig.5 Heating curve of constant temperature zone of 65 ℃

圖6 95 ℃恒溫區基座升溫曲線Fig.6 Heating curve of constant temperature zone of 95 ℃

由加熱曲線可以看出,65 ℃恒溫區的超調量為0.96%,調節時間為31.2 s,靜態誤差為0.05 ℃;95 ℃ 恒溫區的超調量為0.83%,調節時間為 23.5 s,靜態誤差為0.07 ℃.65 ℃恒溫區面積較大熱容量也較大,因此在功率相同的情況下65 ℃恒溫區調節時間比95 ℃恒溫區長.結果表明,該加熱基座設計滿足PCR系統穩態精度高的要求.

4 樣機試液溫度試驗

搭建試驗樣機如圖7所示,上位機控制試液盤在恒溫區中進行旋轉運動.使用50 μL水代替反應試液,將K型熱電偶插入試液腔中對試液溫度進行測量.在反應過程中,每個階段時間應包含上文中仿真得到的熱延遲時間,因此95和65 ℃的停留設置為20.8和46.1 s.采集其中兩個循環的試液溫度變化曲線如圖8所示.

圖7 PCR樣機試液測溫裝置圖Fig.7 Temperature measuring device of PCR prototype test solution

圖8 試液溫度變化曲線Fig.8 Temperature of test solution

該結果表明,反應過程中試液溫度達到穩態后與目標溫度差小于±0.2 ℃,試液熱延遲引起的時滯后效應大致符合上文的仿真結果,加熱時間為7.9 s,與仿真結果相差1.1 s;冷卻時間為6.8 s,與仿真結果相差0.7 s,表明該仿真模型能較好地預測試液的實際變化規律,較準確地補償實際工作中每階段的停留時間.此外,試液在升溫過程中不會受到超調的影響,實際升溫速度達到3.8 ℃/s,實際降溫速度達到4.4 ℃/s.實驗結果顯示,基于分區溫控的PCR熱循環系統能有效縮短PCR反應所需時間,較好實現了預期指標.

5 結語

PCR自發明以來,已成為遺傳分析的強大工具.PCR反應時間與溫度循環密切相關.為縮短反應時間,設計一種用于實時熒光PCR的熱循環系統,采用恒溫區切換的方式對試液進行加熱.通過結構和軟件設計,實現了±0.1 ℃的恒溫區溫控精度和試液最高3.8 ℃/s的升溫速度以及4.4 ℃/s的降溫速度.結果證明,該溫控系統滿足了PCR的要求,為DNA擴增提供了可靠快速的反應環境.同時,與傳統變溫式加熱PCR儀相比,該設計避免了需控制基座反復達到目標溫度的時間,縮短了單次PCR循環的過程,提高了核酸檢測效率.理論仿真結合實驗驗證了該分區溫控方案能有效提高PCR熱循環效率,所提出的PCR熱循環系統具有小型化、易操作、低成本的特點,從而為正在研制的實時熒光PCR儀提供了理論依據和堅實基礎.