禽流感火麻油佐劑滅活疫苗實(shí)驗(yàn)室乳化條件研究

陸有飛 黃慶南 李鳳梅 莫宏志 黃睿思 覃彬茜 陳超燕 謝江*

（1. 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，南寧 530007；2. 廣西麗誠東生物股份有限公司，南寧 530105；3. 平南縣上渡街道農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，廣西 貴港 537300）

禽流感（AI）是威脅人類和禽類健康的一種重要疾病，我國現(xiàn)將其列為重大動物疫病，采取強(qiáng)制免疫進(jìn)行防控。目前國內(nèi)外生產(chǎn)的禽流感疫苗多為以礦物油為佐劑的滅活疫苗，其優(yōu)點(diǎn)是價格便宜，疫苗免疫抗體效價高，免疫期持續(xù)期長；缺點(diǎn)是接種后不易吸收代謝，動物組織中殘留的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)入食物鏈會威脅人類健康［1-2］。不同來源的礦物油質(zhì)量各異，其免疫增強(qiáng)作用和安全性風(fēng)險也存在差異［3-5］，尋找無副作用、無殘留、免疫效果好的新型佐劑一直是疫苗的研究方向。

火麻是一種藥食同源的桑科植物，世界各地普遍種植。火麻油又稱火麻仁油，為火麻果仁壓榨出的一種可食用的植物油。世界長壽之鄉(xiāng)廣西巴馬縣盛產(chǎn)火麻油。火麻油富含油酸、亞油酸和α-亞麻酸等多種不飽和脂肪酸，具有降血脂、抗疲勞、抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用［6-9］，在食品、化妝品、保健品和藥品生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用［10-12］，在動物營養(yǎng)方面的應(yīng)用證實(shí)具有促進(jìn)生長和脂質(zhì)代謝、提高免疫力和抗氧化能力［13-14］，但是在獸醫(yī)生物制品方面的應(yīng)用尚未見報(bào)道。為尋找安全、無毒、無殘留的新型滅活疫苗佐劑，本研究使用火麻油代替礦物油作為疫苗佐劑，開展禽流感火麻油佐劑滅活疫苗實(shí)驗(yàn)室制備乳化條件研究，以確定疫苗的實(shí)驗(yàn)室制備工藝規(guī)程，現(xiàn)將初步結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料

1.1 疫苗毒株

禽流感H9 亞型HN03 株，由廣西麗誠東生物股份有限公司提供，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 種蛋購自淅江立華農(nóng)業(yè)科技有限公司。SPF雞由廣西麗誠東生物股份有限公司提供。

1.3 主要試劑

火麻油（壓榨一級）購自廣西巴馬千百年健康食品有限公司。吐溫-80、司班-80 購自國藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪胨瓊脂（G.A）和葡萄糖蛋白胨湯（G.P）購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 主要儀器和設(shè)備

高速乳化機(jī)購自青島雙峰壓力容器有限公司。高速離心機(jī)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。全自動孵化機(jī)購自青島興儀電子設(shè)備有限責(zé)任公司。旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)購自上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司。

2 方法

2.1 禽流感火麻油佐劑滅活疫苗制備工藝

2.1.1 抗原制備

禽流感（H9 亞型，HN03 株）合格抗原批號為20221110，由廣西麗誠東生物股份有限公司根據(jù)《禽流感（H9 亞型）滅活疫苗（HN03 株）生產(chǎn)工藝規(guī)程》［15］（以下簡稱《規(guī)程》）制備，經(jīng)甲醛滅活。

2.1.2 油相制備

取一定量的司班-80 加入60℃的火麻油中，攪拌均勻后置116℃高壓滅菌40 min，冷卻至25℃?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 水相制備

先將吐溫-80 置116℃高壓滅菌40 min 后冷卻至25℃，再取一定量的吐溫-80，加入禽流感滅活抗原液中，混合均勻后備用。

2.1.4 乳化方法

根據(jù)油相與水相比例設(shè)置，先將油相加入乳化缸內(nèi)，以1000 r/min 邊攪拌邊將水相加入油相中，再以6000~12000 r/min 轉(zhuǎn)速乳化5 min，即得油包水型禽流感火麻油佐劑疫苗。

2.1.5 疫苗乳化條件的優(yōu)化

2.1.5.1 單因素試驗(yàn) 分別考察吐溫-80 占比、司班-80 占比、油相與水相比例和轉(zhuǎn)速對疫苗乳化效果的影響。采用固定3 個變量，變化考察變量。吐溫-80 占比、司班-80 占比為其用量占乳化總量的體積百分比。

（1）吐溫-80 占比 吐溫占比分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，司班-80 占比為2.5%，油相與水相比例為2∶1，轉(zhuǎn)速為9000 r/min，分別進(jìn)行乳化。按《規(guī)程》進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)：取疫苗10 mL 加入離心管中，以3000 r/min 離心15 min，測定水相析出的量。

（2）司班-80 占比 司班-80 占比分別為2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%，吐溫-80 占比為試驗(yàn)（1）中得到的較優(yōu)值，油相與水相比例為2 ∶1，轉(zhuǎn)速為9000 r/min，分別進(jìn)行乳化，按《規(guī)程》進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

（3）油相與水相比例 油相與水相比例分別為3∶1、7∶3、2∶1、3∶2、1∶1，吐溫-80 占比與司班-80 占比采用試驗(yàn)（1）（2）中所得到的較優(yōu)值，轉(zhuǎn)速為9000 r/min，分別進(jìn)行乳化，按《規(guī)程》進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

（4）乳化轉(zhuǎn)速 轉(zhuǎn)速分別為6000 r/min、7000 r/

min、8000 r/min、9000 r/min、10000 r/min，吐溫-80占比、司班-80 占比及油相與水相比例采用試驗(yàn)（1）（2）（3）中所得到的較優(yōu)值，分別進(jìn)行乳化，按《規(guī)程》進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

2.1.5.2 正交試驗(yàn) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，正交試驗(yàn)以吐溫-80 占比（A）、司班-80 占比（B）、油相與水相比例（C）、乳化轉(zhuǎn)速（D）4 個因素為考察對象，選擇每個因素最優(yōu)點(diǎn)及其前后各一點(diǎn)共3 個水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)（表1）分別開展。

表1 L 9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.2 疫苗試制與檢驗(yàn)

根據(jù)方法2.1 確定禽流感火麻油佐劑滅活疫苗最優(yōu)乳化條件，參照《規(guī)程》規(guī)定的抗原含量（每毫升乳劑含禽流感抗原0.24 mL），用火麻油代替礦物油制備禽流感火麻油佐劑滅活疫苗3 批，進(jìn)行物理性狀及無菌檢驗(yàn)。

2.2.1 疫苗物理性狀檢驗(yàn) 取試制疫苗每批5 瓶，參照《規(guī)程》中《性狀檢驗(yàn)操作細(xì)則》進(jìn)行檢查。方法如下：

2.2.1.1 外觀：取疫苗加入無色透明玻璃瓶，在2000 Lx 日光燈光照度下，目測疫苗顏色。

2.2.1.2 劑型：為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量試制疫苗滴于冷水中，除第一滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。

2.2.1.3 穩(wěn)定性：吸取疫苗10 mL 加入離心管中，以3000 r/min 離心15 min，取出觀察乳劑管底水相析出的量，應(yīng)不超過0.5 mL。

2.2.1.4 黏度：用旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)測定，應(yīng)＜200 cP。

2.2.2 疫苗的無菌檢驗(yàn)：取試制疫苗每批5 瓶，按《規(guī)程》中《無菌/純粹檢驗(yàn)操作細(xì)則》進(jìn)行檢驗(yàn)。無菌取樣分別接種含硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T·G），酪素胰酶瓊脂（G·A）及葡萄糖蛋白胨湯（G·P）培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)96 h，觀察有無細(xì)菌、霉菌生長。

結(jié)果判定：樣品應(yīng)5/5 無菌生長。如發(fā)現(xiàn)污染雜菌或結(jié)果可疑時，可抽取10 瓶樣品重檢，重檢結(jié)果仍有雜菌，應(yīng)判為不合格。

3 結(jié)果與分析

3.1 疫苗乳化條件的優(yōu)化

3.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

通過穩(wěn)定性檢驗(yàn)以試制疫苗水相析出的量多少來評價其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，吐溫-80 占比為3.0%時，疫苗水析出量最小；司班-80 占比為4.5%時，疫苗水析出量最小；油相與水相比例為7∶3 時，疫苗水析出量最小；乳化轉(zhuǎn)速10000 r/min 時，疫苗水析出量最小（圖1）。因此確定吐溫-80 占比3.0%、司班-80 占比4.5%、油相與水相比例7∶3、乳化轉(zhuǎn)速10000 r/min 為各因素最佳水平。

圖1 單因素試驗(yàn)對水析出量的影響

3.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。根據(jù)表2 極值（R）的大小可知各因素對疫苗乳化效果的影響依次為C ＞D ＞A ＞B，即油相與水相比例對疫苗乳化效果的影響最大，司班-80 占比（%）對乳化效果影響最小；由k（同一因素同一水平三個試驗(yàn)結(jié)果的均值，k 值越小說明析出水量越小）值可知，疫苗乳化條件最優(yōu)組合為A2B3C2D2，即吐溫-80 占比3.0%，司班-80 占比4.5%，油相與水相比例為7∶3，乳化轉(zhuǎn)速10000 r/ min。由方差分析結(jié)果（表3）可知，各因素對疫苗乳化結(jié)果影響無顯著性差異。因此選取最優(yōu)組合A2B3C2D2即吐溫-80 占比3.0%，司班-80 占比4.5%，油相與水相比例7∶3，轉(zhuǎn)速10000 r/min 為疫苗試制最佳乳化條件。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.2 疫苗試制與檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)疫苗乳化條件最優(yōu)組合試制禽流感火麻油佐劑滅活疫苗3 批，按照《規(guī)程》中《性狀檢驗(yàn)操作細(xì)則》和《無菌/純粹檢驗(yàn)操作細(xì)則》進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果見表4，驗(yàn)證了最優(yōu)組合試制的疫苗最穩(wěn)定。

表4 疫苗檢驗(yàn)結(jié)果

4 討論

乳化條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，吐溫-80 占比為3%、司班-80 占比為4.5%、油相與水相比例7∶3、乳化轉(zhuǎn)速為10000 r/min 是疫苗最佳乳化條件，制備的疫苗穩(wěn)定性最佳。試制的禽流感火麻油佐劑滅活疫苗為微黃白色油包水型均勻乳劑，黏度合格，無細(xì)菌、霉菌污染，經(jīng)3000 r/min 離心15 min 劑型穩(wěn)定。本試驗(yàn)結(jié)果與黃慶南等［16］的火麻油乳劑穩(wěn)定性研究結(jié)果一致，經(jīng)3000 r/min 離心15 min 不分層。閆馨月等［17］研究通過適當(dāng)?shù)某曁幚砜商岣呋鹇橛腿閯┑姆€(wěn)定性，該方法可為疫苗乳劑制備工藝的進(jìn)一步研究提供借鑒。

火麻油中必需脂肪酸的組成與比例更符合動物代謝需要，在動物營養(yǎng)方面的研究極具功能性開發(fā)潛力，在新型無殘留的動物疫苗佐劑方面的應(yīng)用探索也具有進(jìn)一步研究的價值，但火麻油佐劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其配方的優(yōu)化、疫苗免疫持續(xù)期、疫苗保存期等有待后續(xù)的深入規(guī)范研究。

5 結(jié)論

本研究首創(chuàng)采用火麻油代替礦物油作為佐劑，實(shí)驗(yàn)室研究能夠制備出穩(wěn)定的禽流感火麻油佐劑滅活疫苗。