超聲評估糖尿病性胃輕癱大鼠胃動力

韓 鎳,李冠恒,陸玲玲,夏佳靖,金 琳*

(1.上海中醫藥大學附屬光華醫院超聲科,上海 200052;2.上海體育學院運動健康學院,上海 200438)

糖尿病性胃輕癱(diabetic gastroparesis, DGP)是以非機械梗阻胃延遲排空為主要特征的綜合征[1],早期常伴噯氣、惡心、嘔吐及上腹痛等癥狀,嚴重影響患者生活質量,且近年來發病率迅速增長。另一方面,由于糖尿病引發胃動力障礙的機制較為復雜,導致成模率較低,目前尚無獲得廣泛認可的DGP動物模型[2]。超聲可用于評估胃動力,但相關動物模型研究較少,且缺乏統一標準。本研究通過小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)聯合不規律高脂高糖飲食法構建大鼠DGP模型,觀察超聲用于評估其胃動力的價值。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性6周齡SD大鼠26只[動物許可證號:SCXK(滬)2022-0004],體質量(200±20)g;飼養條件:溫度(22±2)℃,相對濕度40%～60%,24 h自由飲水。本實驗經機構倫理委員會批準(批準號:20221130)。

1.2 主要儀器及試劑 羅氏血糖儀;佳能Aplio i800超聲診斷儀,配備18 MHz線陣探頭、速溶胃腸超聲助顯劑;成都泰盟HV1403多通道數據采集和分析系統。STZ、卡巴膽堿(carbachol, CCh)、戊巴比妥鈉(美國Sigma);檸檬酸鈉緩沖液(北京索萊寶科技有限公司);磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)(蘇州君欣生物科技有限公司);克-亨液(Krebs-Hensleit's solution)(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.3 建立大鼠DGP模型 將接受普通飼料(含碳水化合物50%、脂肪10%、蛋白質20%)適應性飼養1周的26只大鼠隨機分為模型組(n=18)和對照組(n=8),分別以高脂高糖飼料(基礎維持飼料68.8%、豬油10%、蔗糖20%、膽固醇1%、膽酸鈉0.2%)和普通飼料飼養1周。于實驗第3周始對模型組大鼠經腹腔注射1% STZ溶液(以pH 值為4.4的0.1 mol/L檸檬酸緩沖溶液配制)20 mg/kg體質量,72 h后經尾靜脈取血,測定非空腹血糖,以>16.7 mmol/L為建模成功[3];否則再經腹腔注射STZ溶液25 mg/kg體質量,72 h后測定非空腹血糖,若仍未建模成功繼續重復上述干預,直至建模成功或死亡。對照組大鼠經腹腔注射等量檸檬酸緩沖溶液。建模期間對模型組大鼠均以不規律高脂高糖飲食法飼養,單數日上午進食、雙數日下午進食;對照組大鼠以規律普通飼養法飼養。每周記錄大鼠體質量和非空腹血糖,共持續8周。

1.4 測試口服葡萄糖糖耐量(oral glucose tolerance test, OGTT) 成功建模后對2組大鼠停飼但不禁飲12～14 h,之后以50%葡萄糖溶液(2 ml/kg體質量)灌胃,分別于灌胃后0(即刻)、30、60、90及120 min經尾靜脈取血,檢測血糖值。

1.5 超聲檢查 檢查前對2組大鼠停飼8 h。以100℃飲用水沖泡50 g胃腸超聲助顯劑至約250 ml,冷卻至37℃,以強飼法予大鼠5 ml助顯劑實驗餐。腹部檢查區域備皮后,將大鼠置于鼠套中,以半仰臥位保定于可塑性軟墊中,盡量使其處于較自然狀態,于鼠套中央開口以暴露腹部。將探頭置于左肋弓下,觀察胃竇、胃體和胃底區域,以超聲全胃圓柱體法(ultrasonic whole stomach cylinder method, UWSCM)公式計算實驗餐后0(即刻)、30及60 min全胃腔容積[4];以左肝、腸系膜上靜脈及腹主動脈為定位標志,獲取胃竇短軸切面,計算實驗餐后0(即刻)、30及60 min胃竇面積[5];分別按照以下公式計算胃排空率(gastric emptying rate, GER)、胃竇收縮頻率(antrum contraction frequency, ACF)、胃竇收縮幅度(antrum contraction amplitude, ACA)及胃竇動力指數(motility index, MI):胃竇GER=(1-實驗餐后不同時間點胃竇面積/實驗餐后即刻胃竇面積)×100%,全胃腔GER=(1-實驗餐后不同時間點全胃腔容積/實驗餐后即刻全胃腔容積)×100%, ACF=進食實驗餐后前9 min內每3 min胃竇收縮次數的平均值, ACA=[胃竇最大舒張面積(Areamax)-胃竇最小收縮面積(Areamin)]/胃竇最大舒張面積×100%, MI=ACA×ACF。

1.6 離體胃竇肌條實驗 以過量戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠,取胃竇近幽門部位組織并制成10 mm×3 mm平滑肌條,置于4℃ PBS中備用;將肌條一端固定于恒溫浴槽底部、另一端與拉力傳感器感應頭相連,使肌條處于完全松弛狀態并垂直浸沒于37℃恒溫浴槽中;加入10 ml克-亨氏液,持續混合后通入95% O2和5% CO2;牽拉肌條至最適張力[(1.2±0.1)g],平衡約30 min后向浴槽滴加0.5 mol/L CCh,以多通道數據采集和分析系統記錄張力;記錄肌條最大收縮力,即最大刺激后張力與刺激前張力之差。

1.7 病理檢查 對胃竇組織行HE染色,之后于光鏡下觀察胃竇黏膜層及肌層細胞形態。

1.8 統計學分析 采用SPSS 27.0統計分析軟件。以±s表示計量資料,行兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

模型組首次注射后8只建模成功,其余10只未能成功;第二次注射后4只建模成功、4只未成功;第三次注射后2只建模成功、2只死亡。

2.1 體質量、血糖及OGTT 第6～8周,模型組大鼠體質量均明顯低于對照組(P均<0.05,圖1A)。第3周始模型組大鼠非空腹血糖顯著升高(P均<0.05,圖1B),各時間點糖耐量水平均顯著高于對照組(P均<0.05,圖1C)。

圖1 大鼠體質量、血糖及糖耐量變化曲線 A.體質量; B.非空腹血糖; C.糖耐量 (*:P<0.01)

2.2 超聲 相比對照組,模型組大鼠實驗餐后30、60 min GER顯著降低(表1);模型組Areamin大于、ACA和MI均小于對照組(P均<0.001,表2);見圖2。

表1 模型組與對照組大鼠實驗餐后GER比較(%)

表2 模型組與對照組大鼠胃竇動力相關指標比較

圖2 超聲聲像圖示大鼠實驗餐后胃排空表現 A.全胃腔容積(箭); B.胃竇面積(箭)

2.3 離體胃竇平滑肌條實驗 模型組大鼠離體胃竇平滑肌肌條最大收縮力[(0.58±0.32)g]小于對照組[(1.12±0.24)g](P<0.001,圖3)。

圖3 滴加0.5 mol/L CCh后大鼠離體平滑肌條實驗 A.收縮反應圖; B.最大收縮力柱狀圖

2.4 病理學所見 模型組大鼠胃竇黏膜層胃小凹溝紋不均勻,部分上皮細胞脫落,主細胞及壁細胞減少(圖4A);對照組大鼠胃竇黏膜結構層次清晰,腺體分布規則,排列致密、整齊(圖4B)。模型組大鼠胃竇平滑肌細胞變小,可見空泡樣改變,細胞核不規則、核膜皺縮明顯(圖4C);對照組大鼠胃竇平滑肌細胞多呈梭形,細胞核規則,呈長橢圓形,核膜相對平滑,褶皺少而淺(圖4D)。

圖4 胃竇組織病理圖 A、B.模型組(A)及對照組(B)大鼠胃竇黏膜層(HE,×200); C、D.模型組(C)及對照組(D)大鼠胃竇肌層(HE,×400)

3 討論

理想的動物模型對探索糖尿病DGP病理生理機制及治療方法十分重要。糖尿病引起胃排空障礙不僅與胃排空延遲有關,還與胃排空加速有關[6];但在建立DGP動物模型過程中,胃延遲排空并非必然現象,導致成模率較低。

目前常見DGP動物模型主要分為糖尿病自然模型和糖尿病非自然模型,后者指在糖尿病基礎上聯合不規律高脂高糖飲食所建立的DGP模型。本研究通過小劑量多次注射STZ聯合不規律高脂高糖飲食成功建立了大鼠DGP模型。相比單次大劑量注射STZ,小劑量多次注射可使血糖水平逐步上升,逐漸破壞大鼠胰島β細胞,降低其酮癥死亡率,且更接近于人類DGP發生發展過程[7-8];聯合不規律高脂高糖飲食可進一步縮短后續胃輕癱發展時間,以于較短時間內成模,且所獲模型較為穩定[2,9]。

核素檢查為診斷胃排空延遲的金標準,但費用較高、難以推廣。根據動物癥狀可評估DGP大鼠建模成功與否[10],但受觀察者主觀影響較大,且胃排空減緩程度與癥狀嚴重程度并非呈線性關系,不足以準確判斷[1]。亦可采用終末性測試檢測胃排空情況評估建模成功與否,該方法經濟、簡便、對設備要求低,但檢測后動物無法繼續存活,不支持重復測量。超聲為非終末性檢查方法,不僅可實時評價GER和胃動力功能[11],且不影響動物存活;予大鼠口服超聲助顯劑后,胃底出現容受性舒張,助顯劑在胃底、胃體部逐步充填并向胃竇部推進,期間全胃腔容積及胃竇面積逐步減小,可利用超聲動態觀察胃收縮、蠕動及排空全過程,進而評價胃動力情況[11-14]。WU等[5,15]以胃竇單平面測量法評估DGP大鼠胃排空。本研究在其基礎上進一步評估全胃腔容積及相關胃動力參數,結果顯示模型組大鼠GER顯著下降,符合DGP特征;其胃竇收縮功能和胃竇動力指數明顯受損而胃竇舒張功能和收縮頻率未見明顯變化,原因可能與DGP病程發展有關,或與不同部位其病理損傷類型不同有關。同時,本研究離體胃竇平滑肌條實驗結果顯示模型組大鼠胃平滑肌收縮力顯著下降,與超聲表現一致,符合DGP病理學表現。

綜上所述,超聲可用于評估DGP大鼠模型胃動力。受氣體干擾,本研究超聲顯示大鼠局部胃壁與助顯劑分界面稍欠清晰,可能對測量結果造成影響,有待后續加以改進。