祛腐生肌外治法對糖尿病潰瘍大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）及其相關(guān)信號通路影響的meta分析和系統(tǒng)評價(jià)*

蔣立新，朱思洵，2

1 江蘇省江陰市中醫(yī)院 江蘇無錫 214400

2 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇南京 210023

糖尿病足潰瘍（Diabetic Foot Ulcer，DFU）是指糖尿病患者在長期高血糖的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的不同程度的神經(jīng)、末梢血管病變，引起的下肢肢體的潰瘍、感染和（或）深層組織的破壞[1]。數(shù)據(jù)顯示，2019年全球約有4.63億20～79歲成人患糖尿病糖尿病患者，在未來30年里這個(gè)數(shù)字還將成倍增長。相比于西方國家，我國的糖尿病患者居于世界首位，形勢將更加嚴(yán)峻[2]。糖尿病患者中約 15 %會(huì)出現(xiàn)足部潰瘍，其中需要截肢的概率為 15%～20%[3-4]。人口老年化的加劇和糖尿病并發(fā)癥的高發(fā)，更是導(dǎo)致了DFU治療難度加大，病程長、花費(fèi)高昂，其顯著的影響著糖尿病患者的生活質(zhì)量及國家的財(cái)政負(fù)擔(dān)，是外科亟須解決的重大問題和難題[5-6]。

目前，除了控制血糖、清創(chuàng)、防治感染等基礎(chǔ)治療外，DFU的西醫(yī)治療方面發(fā)展出了很多高新技術(shù)，包括重組生長因子治療、基因治療、干細(xì)胞治療和生物材料等[7-10]。雖已有許多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)肯定了這些方法的治療效果，但其在臨床治療上不僅費(fèi)用昂貴，而且穩(wěn)定性、有效性及安全性等方面仍存在很多亟待解決的問題[11]。祖國醫(yī)學(xué)將糖尿病足潰瘍歸屬于“消渴脫疽”“筋疽”“瘡瘍”等范疇，臨床表現(xiàn)多為下肢末端的疼痛、潰瘍、感染，甚至壞疽等。中藥外用治療DFU歷史悠久，并在不斷的實(shí)踐中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，取得了獨(dú)特的療效，并形成了豐富的理論。有著療效顯著、毒副作用小，價(jià)格低廉、簡便容易操作的特點(diǎn)。在總結(jié)前人治療實(shí)踐的基礎(chǔ)上，現(xiàn)代眾多名醫(yī)名家提出了“祛腐生肌法”外治治療糖尿病足潰瘍，其理論基礎(chǔ)為“腐肉不祛，新肉不生”，并在不斷的實(shí)踐創(chuàng)新中取得了良好的療效。所以，發(fā)揮祛腐生肌外治法在治療DFU方面的優(yōu)勢，并不斷挖掘研究其藥理機(jī)制及作用原理，已然成為充分發(fā)揮中醫(yī)藥特色，實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的一個(gè)重要課題。

研究表明，血管內(nèi)皮生長因子VEGF（vascular endothelial growth factor，VEGF）介導(dǎo)的血管修復(fù)與再生是DFU愈合的重要環(huán)節(jié)。在糖尿病患者高糖狀態(tài)下，缺氧組織的正常生理反應(yīng)受到抑制，細(xì)胞再生能力降低、促愈細(xì)胞因子缺乏及血管化不足，加之創(chuàng)面區(qū)域存在血流灌注減少、細(xì)胞代謝異常等特點(diǎn)，最終導(dǎo)致DFU愈合時(shí)間大大延長，出現(xiàn)嚴(yán)重后果[12]。VEGF作為目前已知的特異性最高的、作用最強(qiáng)的促血管生長的多功能細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的增強(qiáng)微血管通透性的作用，能促使細(xì)胞轉(zhuǎn)移，加快復(fù)制，使血管壁內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)排到胞外，加快新生毛細(xì)血管生長[13-15]。因此促進(jìn)VEGF 水平表達(dá)在DFU皮膚及肌肉組織修復(fù)愈合的過程有決定性的作用。近年來從分子水平來探討中醫(yī)藥促愈機(jī)制的研究日益深入，多項(xiàng)關(guān)于糖尿病足潰瘍的臨床研究證實(shí)了祛腐生肌法中藥外用能夠促進(jìn)患者血清中VEGF水平的表達(dá)，從而幫助創(chuàng)面愈合。另外我們發(fā)現(xiàn)，大量研究表明VEGF在創(chuàng)面修復(fù)的過程中涉及多個(gè)信號通路，其機(jī)制十分復(fù)雜[16-18]。且對DFU患者進(jìn)行創(chuàng)面組織取樣的操作涉及到倫理規(guī)范，研究不便。故本研究旨在通過全面搜集有關(guān)VEGF在祛腐生肌法中藥外用對DFU大鼠模型中表達(dá)水平的研究，并挖掘其作用背后的信號通路機(jī)制，并為未來的研究提供有價(jià)值的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

資料與方法

1 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.1 研究類型 公開發(fā)表的，具有獨(dú)立治療組和對照組的隨機(jī)對照試驗(yàn)（randomized controlled trials，RCTs），語種限為中文和英文，無論是否采用盲法或分配隱藏。

1.2 研究對象 實(shí)驗(yàn)性糖尿病潰瘍大鼠模型，其動(dòng)物種屬、性別、年齡、造模方法不限。

1.3 干預(yù)措施 治療組均采用中藥祛腐生肌法外用，其中包括驗(yàn)方、組方（如金黃散、三黃生膚油等）及中成藥（如一效膏、生肌玉紅膏散等）。劑型包括膏劑、散劑、油劑、洗劑等。對照組采用常規(guī)換藥治療，可聯(lián)合抗生素軟膏、生長因子凝膠等制劑外用。對兩組的換藥方法、頻次、療程及方法等不做限制。

1.4 結(jié)局指標(biāo) 主要結(jié)局指標(biāo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF），根據(jù)實(shí)驗(yàn)中收集樣本為創(chuàng)面組織或血清的不同，定量測量方法為ELISA、Western Blot、Qpcr的不同。分為DU大鼠創(chuàng)面組織VEGF蛋白表達(dá)水平、創(chuàng)面組織VEGF mRNA水平及血清VEGF因子水平。次要結(jié)局指標(biāo)為在相關(guān)信號通路中影響VEGF表達(dá)水平的上下游因子，這些信號通路包括HIF-1/VEGF/VEGFR-2信號通路、PI3K/AKT信號通路、Wnt/β-catenin信號通路。納入文獻(xiàn)要求結(jié)局指標(biāo)要求必須包含主要結(jié)局指標(biāo)，可不包含次要結(jié)局指標(biāo)。

2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①非隨機(jī)對照動(dòng)物試驗(yàn)，包括個(gè)案報(bào)道、觀察性研究、綜述等；②中藥內(nèi)服、中藥灌胃以及中藥提取物外用治療的研究等；③藏藥、苗藥或合并中藥的研究；④實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為犬類、家兔、小鼠等非大鼠的研究；⑤重復(fù)發(fā)表的，保留一篇數(shù)據(jù)完整的；⑥結(jié)局指標(biāo)模糊，無法進(jìn)行數(shù)據(jù)合并的。

3 檢索策略

檢索建庫至2022年4月公開發(fā)表的關(guān)于中藥外用治療糖尿病潰瘍大鼠的RCT中英文文獻(xiàn)。檢索的中文數(shù)據(jù)庫包括中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)庫（wanfang data）及中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（CBM），檢索關(guān)鍵詞主要為為“糖尿病足/糖尿病潰瘍/代謝性潰瘍；外治法/中藥外用/祛腐生肌；膏劑/散劑/洗劑/油劑；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；大鼠”。檢索英文數(shù)據(jù)庫PubMed、Cochrane library及EMbase，檢索關(guān)鍵詞主要為“Diabetic foot/ diabetic ulcer/ metabolic ulcer；External therapies/ external application of traditional Chinese medicine/ Qufushengji；Ointment/Powder/lotion/oil； vascular endothelial growth factor/ VEGF；Rats等”。采用“主題詞”和“自由詞”相結(jié)合的檢索策略，會(huì)議論文、學(xué)位論文及灰色文獻(xiàn)亦在檢索范圍內(nèi)。

4 資料提取

由2名科研人員獨(dú)立進(jìn)行資料提取，根據(jù)預(yù)先制定的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行文獻(xiàn)篩選、資料提取及文獻(xiàn)質(zhì)量評價(jià)。若有分歧，則通過第3名研究者參與共同研究解決。資料提取表以Excel文件保存，提取內(nèi)容主要包括納入文獻(xiàn)的作者、出版年份、動(dòng)物種類、體質(zhì)量、樣本量、造模方法、干預(yù)措施、療程、結(jié)局指標(biāo)以及設(shè)計(jì)偏倚風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的具體信息。對于文章中有多個(gè)對照組時(shí)，選取指標(biāo)改善最明顯的一組；當(dāng)治療組中藥外用有多個(gè)研究劑量時(shí)，同樣選取療效最優(yōu)組。對于論文中結(jié)局指標(biāo)比較只給出柱狀圖、折線圖等，未給出表格及具體數(shù)值時(shí)，采用GetData 2.20軟件由2名科研人員分別進(jìn)行數(shù)值提取，最后取2人截取的平均值作為結(jié)局指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

5 文獻(xiàn)質(zhì)量評價(jià)

資料提取 1.4.1 質(zhì)量評價(jià)使用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)評價(jià)中心（SYRCLE）偏倚風(fēng)險(xiǎn)評估工具。SYRCLE由Cochrane發(fā)展而來，包含10相條目，其中涉及選擇性偏倚，實(shí)施偏移，測量偏倚，損耗偏倚，報(bào)告偏倚和其他偏倚 6 種偏倚[19]。通過對工具的每個(gè)域評分“是”，表明存在偏見的風(fēng)險(xiǎn)較低；“否”，表明存在很 大的偏見風(fēng)險(xiǎn)；如果報(bào)告的詳細(xì)信息不足，則可以對內(nèi)部評價(jià)和外部有效性進(jìn)行評分“不確定”。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel統(tǒng)計(jì)納入文獻(xiàn)的相應(yīng)數(shù)據(jù)，并采用Review Manager 5.4.1進(jìn)行Meta分析。所有結(jié)果均視為連續(xù)型數(shù)據(jù)，采用標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（standardized mean difference，SMD）評估效應(yīng)量大小，結(jié)局指標(biāo)的合成結(jié)果均以效應(yīng)值及其95%可信區(qū)間（Confidence interval，CI）表示，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對有各項(xiàng)研究進(jìn)行異質(zhì)性分析，若不存在異質(zhì)性（I2＜50%），采用固定效應(yīng)模型；若存在異質(zhì)性（I2＞50%），采用隨機(jī)效應(yīng)模型。但是結(jié)局中相關(guān)蛋白及分子指標(biāo)的測定與試劑盒的廠家和型號、研究的年份遠(yuǎn)近、研究人員的操作方法和主觀判斷等因素相關(guān)，必然存在一定的臨床異質(zhì)性，故對于異質(zhì)性較大的研究組，我們?nèi)匀粚ζ溥M(jìn)行Meta合成，并采用采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。對數(shù)量≥10的研究進(jìn)行亞組分析，并繪制漏斗圖判斷是否存在發(fā)表偏倚。另外對不良反應(yīng)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。對數(shù)量≥10的研究進(jìn)行亞組分析，并繪制漏斗圖判斷是否存在發(fā)表偏倚。

結(jié) 果

1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

通過對數(shù)據(jù)庫檢索得到相關(guān)文獻(xiàn)119篇，剔除重復(fù)文獻(xiàn)后為58篇，通過閱讀標(biāo)題、摘要和全文，并基于納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后，最終納入分析的文獻(xiàn)有19篇，均為中文期刊文獻(xiàn)。篩選流程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

2 納入研究的基本特征

共納入19個(gè)研究，文獻(xiàn)發(fā)表時(shí)間為2010年10月至2022年4月，納入508例實(shí)驗(yàn)大鼠模型，其中試驗(yàn)組254例，對照組254例，最大樣本量為30，最小為5，最短療程10d，最大療程21d。大鼠品種為 Sprague-Dawley（SD）大鼠和 Wistar 大鼠。14個(gè)研究采用SD大鼠，5個(gè)研究采用Wistar大鼠，15個(gè)研究僅采用雄性，4個(gè)研究雌雄不限或未提及性別。18個(gè)研究采用腹腔注射STZ進(jìn)行糖尿病建模，1個(gè)研究采用腹腔注射ALX進(jìn)行糖尿病建模。12個(gè)研究采用全程皮膚缺損法進(jìn)行潰瘍造模，1個(gè)研究采用壓力損傷法進(jìn)行潰瘍造模，5個(gè)研究采用蒸汽或恒溫燙傷法進(jìn)行潰瘍造模，1個(gè)研究采用缺血外傷法進(jìn)行潰瘍造模。納入研究的基本特征見表1。

表1 納入文獻(xiàn)的基本特征

3 納入研究的質(zhì)量評價(jià)

共納入19項(xiàng)研究，根據(jù)SYRCLE的偏倚風(fēng)險(xiǎn)工具，納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)為3～5分（總 10 分）。2項(xiàng)研究獲得3分（10.53%）；15項(xiàng)研究獲得4分（78.95%）；2項(xiàng)研究獲得5分（10.53%）。見表2。

表2 納入研究的方法質(zhì)量學(xué)評估

4 Meta分析的各項(xiàng)結(jié)果

4.1 DUF大鼠創(chuàng)面組織VEGF蛋白水平 納入的10篇文獻(xiàn)[20，22-24，27-30，35，37]報(bào)道了創(chuàng)面組織VEGF蛋白水平。異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示兩組間異質(zhì)性顯著（P＜0.00001，I2＝84%），采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta合成。結(jié)果 顯示，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD =1.39，95%CI（0.67，2.10），P=0.000 2]，表明相比于對照組，中藥外用能夠促進(jìn)創(chuàng)面組織中VEGF蛋白水平的表達(dá)。見圖2。同時(shí)根據(jù)對照組干預(yù)措施進(jìn)行亞組分析，Meta分析顯示：相比于常規(guī)換藥組和抗生素?fù)Q藥組，中藥外用促進(jìn)DU大鼠創(chuàng)面VEGF蛋白表達(dá)的優(yōu)勢明顯[SMD =2.02，95%CI（1.27，2.78），P=0.000 2；SMD=2.06，95%CI（0.16，3.96），P=0.03]；但是相比于生長因子換藥組，二者相比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，尚不能證明中藥外用組在促進(jìn)DU大鼠創(chuàng)面VEGF蛋白水平表達(dá)方面優(yōu)于生長因子換藥組[SMD =0.04，95%CI（-0.52，0.61），P=0.88]見圖3。

圖2 兩組創(chuàng)面組織VEGF蛋白水平Meta分析圖

圖3 兩組創(chuàng)面組織VEGF蛋白水平亞組分析Meta分析圖

4.2 DUF大鼠創(chuàng)面組織VEGF mRNA水平 4項(xiàng)研究[30-32，34]報(bào)告了血清VEGF表達(dá)量，分析顯示4項(xiàng)研究間統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性較大（P＜0.000 01，I2=97% ），故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。結(jié)果 顯示：中藥外用治療組較對照組能明顯提高DU大鼠組織中VEGF mRNA表達(dá)量，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD =5.53，95%CI（0.58，10.11），P=0.03]。見圖4。

圖4 兩組創(chuàng)面組織VEGF mRNA水平Meta分析圖

4.3 DUF大鼠創(chuàng)面血清VEFG因子水平 7項(xiàng)研究[21，25-26，30，33，36，38]報(bào)告了血清EGF表達(dá)量，分析顯示7項(xiàng)研究間統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性較大（P＜0.000 01，I2=89% ），故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。結(jié)果 顯示：中藥外用治療組較對照組能明顯提高DU大鼠血清中VEGF的表達(dá)量，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD =1.91，95%CI（0.73，3.09），P=0.002]。見圖5。

圖5 兩組血清VEGF水平Meta分析圖

4.4 HIF-1α/VEGF/VEGFR-2信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平 3項(xiàng)研究[24，27，37]報(bào)告了DUF大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α蛋白表達(dá)量，分析顯示3項(xiàng)研究間統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性較大（P=0.008，I2=79% ），并考慮臨床異質(zhì)性，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。結(jié)果 顯示：中藥外用治療組較對照組能明顯DU大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α蛋白表達(dá)量，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD=2.35，95%CI（1.11，3.59），P=0.000 2]。2項(xiàng)研究[22，24]報(bào)告了DU大鼠創(chuàng)面組織中VEGFR-2蛋白表達(dá)量，分析顯示2項(xiàng)研究間統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性較大（P=0.002，I2=89% ），并考慮臨床異質(zhì)性，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。結(jié)果 顯示：中藥外用治療組較對照組能明顯DU大鼠創(chuàng)面組織中VEGFR-2蛋白表達(dá)量，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD =4.52，95%CI（0.63，8.42），P=0.02]。見圖5，圖6。

圖6 兩組創(chuàng)面組織HIF-1α蛋白水平Meta分析圖

圖7 兩組創(chuàng)面組織VEGFR-2蛋白水平Meta分析圖

4.5 PI3K/AKT信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平 1項(xiàng)研究[34]報(bào)告了DUF大鼠創(chuàng)面組織中PI3K蛋白表達(dá)量，其研究表明中藥外用治療組較對照組能明顯抑制DU大鼠創(chuàng)面組織中PI3K蛋白表達(dá)量，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD =-0.94，95%CI（-1.08，-0.80），P=0.00001]。1項(xiàng)研究[27]報(bào)告了DU大鼠創(chuàng)面組織中AKT蛋白表達(dá)量，其研究表明中藥外用治療組較對照組能明顯促進(jìn)DU大鼠創(chuàng)面組織中AKT蛋白表達(dá)量，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [SMD =0.28，95%CI（0.22，0.34），P＜0.000 01]。

4.6 Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平1項(xiàng)研究[36]報(bào)告了DUF大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin蛋白表達(dá)量，其研究表明中藥外用治療組較對照組能明顯促進(jìn)DU大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin蛋白表達(dá)量，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD =0.23，95%CI（0.19，0.27），P＜0.000 01]。1項(xiàng)研究[36]報(bào)告了DU大鼠創(chuàng)面組織中GS3K-β蛋白表達(dá)量，其研究表明中藥外用治療組較對照組能明顯促進(jìn)DU大鼠創(chuàng)面組織中GS3K-β蛋白表達(dá)量，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [SMD =0.44，95%CI（0.06，0.82），P=0.02]。1項(xiàng)研究[36]報(bào)告了DU大鼠創(chuàng)面組織中Cym-c蛋白表達(dá)量，其研究表明中藥外用治療組較對照組能明顯抑制大鼠創(chuàng)面組織中Cym-c蛋白表達(dá)量，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[SMD =-0.47，95%CI（-0.72，-0.22），P=0.000 2]。

5 發(fā)表偏倚

結(jié)局指標(biāo)中DUF大鼠創(chuàng)面組織VEGF蛋白水平研究納入10項(xiàng)，通過漏斗圖初步判斷是否存在發(fā)表偏倚，結(jié)果顯示各研究點(diǎn)在漏斗圖兩側(cè)分布不對稱，提示可能存在發(fā)表偏倚，其偏倚的發(fā)生可能于研究的年份，研究的造模方法，對照組干預(yù)措施，實(shí)驗(yàn)室的工作環(huán)境，試劑、儀器的不同型號以及研究人員的主觀判斷等因素有關(guān)。結(jié)果 見圖8。

圖8 兩組創(chuàng)面組織VEGF蛋白水平漏斗圖分析

討 論

1 DFU與VEGF的中西醫(yī)研究進(jìn)展

血管生成是指現(xiàn)存的血管出芽形成新的血管從而恢復(fù)創(chuàng)面組織的血液和氧氣供應(yīng)[39]，這個(gè)過程在創(chuàng)面修復(fù)中的重要性不言而喻。血管生成減少不僅導(dǎo)致創(chuàng)面氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)不足，而且使經(jīng)新生血管進(jìn)入創(chuàng)面的其他修復(fù)細(xì)胞減少，是創(chuàng)面難以愈合的重要原因。在DFU中，因患者高血糖帶來的局部血流動(dòng)力學(xué)異常，伴隨著周圍神經(jīng)病變、代謝紊亂、慢性炎癥、氧化應(yīng)激、以及內(nèi)皮功能障礙等一系列問題，導(dǎo)致創(chuàng)面區(qū)域存在血管灌注不足、細(xì)胞生長因子分泌減少，血管的生成受損，使得DFU創(chuàng)面相較于其他慢性創(chuàng)面更加遷延難愈[40]。因此，促進(jìn)DFU患者局部創(chuàng)面中的生長因子分泌，促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織中血管生成，改善創(chuàng)面局部血流供應(yīng)，是幫助DFU傷口愈合的重要手段[41]。

VEGF是一種與血管生長相關(guān)的特異性生長因子，是肝素結(jié)合性雙價(jià)蛋白，正常條件下由中性粒細(xì)胞及血小板分泌，在缺氧條件下由角質(zhì)形成細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌[42]。VEGF在正常人體皮膚組織中表達(dá)較少，在機(jī)體創(chuàng)傷時(shí)則大量釋放。其可以與內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，有效刺激細(xì)胞的有絲分裂，使其增殖，從而促進(jìn)新生血管的生成；也可以增加血管的通透性，使血管內(nèi)成分滲漏，給血管內(nèi)皮的形成和遷移提供基質(zhì)，進(jìn)而上調(diào)血管的生成。創(chuàng)面血管形成決定創(chuàng)面愈合速率及質(zhì)量。VEGF在維持和恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性中發(fā)揮重要作用，還可增加側(cè)枝循環(huán)血量，起到保護(hù)作用；還能刺激肉芽組織及上皮的形成、角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的移行，進(jìn)而促進(jìn)潰瘍面愈合[43]。

DFU屬中醫(yī)學(xué)“消渴脫疽”“筋疽”“瘡瘍”等范疇，多發(fā)于老年人或素體虧虛的患者。屬本虛標(biāo)實(shí)之證，發(fā)病與濕熱、痰濁、火毒、氣滯血瘀及氣虛、陰虛等關(guān)系密切。因虛感邪，邪氣致瘀，瘀阻傷正，化腐致?lián)p為其病理過程。中藥外用治療糖尿病足潰瘍由來已久，所謂“腐肉不去，新肉不生”，其核心理論基礎(chǔ)為“祛腐生肌”之法。魏子孝[44]強(qiáng)調(diào)糖尿病足潰瘍愈合是“腐祛肌生，肌平皮長”的過程，提出“給邪出路，祛腐生肌”中西醫(yī)結(jié)合外治的方法。闕華發(fā)[45]認(rèn)為“虛”“邪”“瘀”為該病變化之機(jī)，并提出“祛瘀化腐”“活血生肌”外治法理論。呂延偉[46]組方治以摻藥、圍藥、熏洗藥、油膏等調(diào)和后敷于局部皮膚壞死邊緣，對于控制壞疽發(fā)展，促其分界，提出了“引邪外出，祛腐生新”的外治原則。以上可以看出，濕、熱、痰、瘀、毒、濁統(tǒng)稱為“腐”，腐邪阻絡(luò)、營衛(wèi)不和，經(jīng)脈、絡(luò)脈 閉塞是主要病機(jī)[47]。而“新肉”可以指新生的血管、皮膚、組織、肌肉，從我們本文的研究來看，VEGF在幫助DFU創(chuàng)面血管肉芽新生、組織皮膚生長、細(xì)胞纖維增殖方面效果顯著。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)外用中藥通過多條信號通路發(fā)揮作用，激活DFU創(chuàng)面及血清中VEGF的表達(dá)，是中醫(yī)“祛腐生肌”理論在創(chuàng)面中發(fā)揮作用的核心細(xì)胞因子。

2 VEGF與HIF-1α/VEGF/VEGFR-2、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信號通路

在糖尿病足潰瘍中，有缺氧→HIF-1α→VEGFVEGFR-2這一調(diào)控鏈存在。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）是一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它具有氧濃度依賴性，能夠調(diào)控包括VEGF在內(nèi)的多個(gè)靶基因，進(jìn)一步調(diào)控由于缺氧誘導(dǎo)的多種機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)，比如新血管的生成、代謝和細(xì)胞凋亡[48]。從機(jī)制上，由于局部組織的缺氧和缺血，激活人體內(nèi)源性的防御和修復(fù)機(jī)制，從而導(dǎo)致缺氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物 HIF-1α 的增加，影響糖代謝，上調(diào) HIF-1α 誘導(dǎo)基因 VEGF 的表達(dá)[49-50]，促進(jìn)血管的新生，從而改善缺血缺氧癥狀。目前為止，已發(fā)現(xiàn)有3種VEGF受體存在人體中，其中血管內(nèi)皮生長因子受體-2（Vascular endothelial growth factor Receptor-2，VEGFR-2）分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，它的主要作用是與VEGF藕聯(lián)，以此介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分 裂和增生，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，增加血管的通透性等[51]。由此可見HIF-1α→VEGFVEGFR-2這一信號通路在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及血管的生成等方面發(fā)揮著重要作用。

PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是執(zhí)行細(xì)胞黏附、向外遷移和血管生成等功能的中心環(huán)節(jié)[52]。多種生長因子可通過激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)血管生成[53-54]。磷脂肌醇3-激酶（phosphninositide3-kinase，PI3K）是細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的一種，與細(xì)胞的增殖分化、葡萄糖分子的轉(zhuǎn)運(yùn)等密切相關(guān)。如PI3K下游的靶分子磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸酯可通過募集并調(diào)節(jié)蛋白激酶B（proteinkinase B，Akt）等多種效應(yīng)因子，控制血管新生相關(guān)蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的增殖和遷移等[55]。Bhattacharya D等[56-57]的研究顯示，VEGF與其受體-2結(jié)合后可通過正反饋調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路，進(jìn)一步促進(jìn)AKT的活化而參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及創(chuàng)面血管的新生。

Wnt/β-catenin通路對細(xì)胞的多種生物學(xué)行為均具有調(diào)控作用，上游信號分子Wnt 1將生物信號傳入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)GSK-3β對β-catenin的降解活性減弱并引起β-catenin堆積，進(jìn)而通過β-catenin的生物學(xué)活性來發(fā)揮促生長、抗調(diào)亡的作用[58]。β-catenin在細(xì)胞內(nèi)蓄積后能夠調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，包括多種具有促生長作用的細(xì)胞因子。趙亞男等[59]的研究在糖尿病大鼠中發(fā)現(xiàn)：DF創(chuàng)面內(nèi)受抑制的Wnt /β-catenin通路能夠影響創(chuàng)面內(nèi)細(xì)胞的生長，進(jìn)而阻礙創(chuàng)面的修復(fù)，包括VEGF在內(nèi)的眾多生長因子的含量明顯降低且與 Wnt 1、β-catenin呈正相關(guān)，與GSK-3β呈負(fù)相關(guān)[60]。

由此可見，以上三條信號通路在DFU的愈合過程中，均可以通過上下游分子的調(diào)控，影響促進(jìn)VEGF的表達(dá)。本研究則發(fā)掘了目前中醫(yī)祛腐生肌外治法分子研究機(jī)制的相關(guān)文獻(xiàn)，初步證明其可能是通過激活以上信號通路，正反饋上調(diào)VEGF因子的表達(dá)，從而促進(jìn)DFU傷口的愈合。

3 研究的局限性

本研究主要異質(zhì)性存在于治療組干預(yù)措施方面，中藥外用的劑型、用藥、功效等均有不同，但其核心理論都是“去腐生肌”法，其異質(zhì)性在可接受范圍內(nèi)。在對照組方面，我們針對其用藥種類不同進(jìn)行了亞組分析，對異質(zhì)性進(jìn)行了定性。但是，在包括造模方法、換藥間隔、換藥天數(shù)、大鼠種類等方面也存在異質(zhì)性，考慮其影響較小，未作處理。另外，本研究納入語種僅為中文和英文，而英文文獻(xiàn)未有一篇進(jìn)入最終Meta分析，大多數(shù)研究質(zhì)量偏低，總樣本量偏少，且考慮納入研究中，因?qū)嶒?yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)器械、主觀操作、統(tǒng)計(jì)方法等不同，造成Meta合并結(jié)果偏倚的可能性較高。因此，結(jié)論的確切性仍需要更大的樣本，更合理的設(shè)計(jì)以及高質(zhì)量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)行進(jìn) 一步的驗(yàn)證。

總結(jié)與展望

祛腐生肌外治法歷史悠久，其理論體系完善，劑型選擇性多，工藝較為成熟，臨床療效滿意。本次研究驗(yàn)證中藥外用對DFU大鼠模型中VEGF表達(dá)的影響作用，包括血清VEGF分子表達(dá)、創(chuàng)面VEGF mRNA表達(dá)及創(chuàng)面VEGF蛋白表達(dá)。相對于常規(guī)換藥組及抗生素?fù)Q藥組，中藥外用促進(jìn)VEGF表達(dá)的效果明顯，但是與生長因子換藥組相比，中藥外用無明顯優(yōu)勢。其機(jī)制與調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF/VEGFR-2、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)。但其部分制劑易對皮膚刺激性較大，易造成皮膚色素沉著，甚至有加重疼痛感，產(chǎn)生皮膚毒性，造成肝腎損害的可能。因此，我們?nèi)孕枰啻髽颖尽⒏哔|(zhì)量、設(shè)計(jì)更合理的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證療效，并評估其安全性標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，也需要更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)對祛腐生肌法治療糖尿病足創(chuàng)面的藥理活性成分、分子作用靶點(diǎn)等進(jìn)行更加深入的研究挖掘。