枳葛口服液通過Syk/Ras/ERK信號通路防治酒精性肝損傷機制研究*

茍沙沙，黃曉平，李波，王曉棟，黃素瓊，魏嵋

西南醫科大學附屬中醫醫院 四川瀘州 646000

酒精性肝病（Alcoholic liver disease，ALD）是由于長期大量飲酒導致的肝臟疾病，初期表現為酒精性脂肪肝，進而發展為酒精性肝炎，若不加治療將引起酒精性肝硬化甚至發展為肝癌[1]。當前對于酒精性肝病的治療主要在于戒酒、保肝、營養支持等對癥治療，暫無逆轉酒精性肝病的特效藥物。隨著中醫藥研究的崛起，越來越多研究發現中醫藥在預防和治療酒精性肝病方面具有良好的前景。目前研究認為酒精引起的肝細胞損傷在ALD的發生發展過程中扮演了重要角色，防治酒精性肝損傷已經成為當前研究熱點[2]。

枳葛口服液（原名枳葛解酒方）是由我院全國名中醫孫同郊教授，通過中國古典方劑的運用和自身臨床經驗累積，總結出來的解酒保肝經驗方，該方主要由枳椇子、葛根、白茅根等六味藥食同源的中藥材所構成，其主要功效為解酒降脂、保肝護胃、清熱除濕。本方中所含枳椇子，具有利水消腫、止煩除渴、醒酒安神等功效，是方中君藥。據《滇南本草》記載，枳椇子善解酒毒[3]，Ra-Yeong Choi等[4]則表明枳椇子可明顯降低甘油三酯并下調抗炎基因的表達，促進乙醇代謝從而發揮保護肝臟的作用。葛根具有解熱除煩、生津止渴等功效，同為方中君藥，是《神農本草經》中收載的一種中品藥材[5]。孫思邈曾在《千金要方》中提及：搗爛鮮葛根，飲其汁水，可治酒醉不醒，且葛根性味甘涼，有鼓舞胃氣、減輕酒后嘔吐等作用[6]。涂世偉等[7]研究顯示葛根素可減少促炎細胞因子的釋放，減輕細胞炎癥損傷等作用。白茅根為臣藥，具有涼血止血，生津止渴，利尿通淋等作用。馬成勇等[8]實驗表明白茅根具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、改善糖脂代謝、保肝等多種藥理作用。綜上，諸藥相伍，清泄并舉、攻補兼施，使枳葛口服液全方具有解酒降脂、保肝護胃的功效[6]。

在臨床應用中枳葛口服液對于酒精性肝損傷療效突出，其機制可能與抑制肝臟炎癥通路活化，從而減輕肝臟炎癥相關。為明確枳葛口服液是否通過抑制Syk/Ras/ERK信號通路防治酒精性肝損傷，本研究制造酒精性肝細胞損傷模型，予以枳葛口服液高中低三個組的枳葛口服液含藥血清進行干預，同時設置美他多辛組進行對照實驗，探討枳葛口服液含藥血清對BRL3A大鼠肝細胞酒精性肝損傷炎癥反應的防治機制，為枳葛口服液防治酒精性肝損傷機制提供理論依據。

材料與方法

1 實驗動物及細胞

清潔級雄性SD大鼠50只，體質量（200±25）g，由西南醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK（川）2018-065。普通飼料由西南醫科大學實驗動物中心提供。飼養于動物房，動物飼養條件：溫度（23±2）℃，相對濕度（55±10）%。大鼠正常肝細胞株（BRL3A大鼠肝細胞），由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。本實驗經過本院倫理委員會的審批，審批編號NO.20211206-001。

2 實驗藥物及試劑

枳葛口服液由西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室提供，規格20mL×6支/盒，處方組成有枳椇子、葛根、白茅根等，有效期2年，批號：20210222。美他多辛片，由山東齊都藥業有限公司生產，生產日期2021年9月10日，規格0.5g/片，批號：102109005。實驗試劑LDH、GGT試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；細胞增殖毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK8）試劑購自碧云天生物技術有限公司，胎牛血清購自美國ZEALWAY公司。

3 實驗儀器

全自動酶標儀，BioTek；低速離心機，中國長沙湘智離心機儀器有限公司；二氧化碳孵箱，Thermo；冷凍離心機，Eppendorf。

4 制備含藥血清

選用50只雄性SD大鼠，隨機的分為3組：枳葛口服液組30只、美他多辛組10只和空白對照組10只。全部大鼠參照本課題組既往實驗[9-10]并參考相關文獻[11-13]，適應性喂養1周后灌胃，其中枳葛口服液組按生藥8.85g/（100g·d）灌胃，陽性對照組按0.1g美他多辛/（100g·d）灌胃，空白組按同等體積生理鹽水灌胃，2次/d，每次間隔12h，連續5d。末次給藥前12h禁食不禁水，于末次給藥1.5h后，予以腹腔注射2%戊巴比妥鈉（5mL/kg）麻醉大鼠，腹主動脈取血，標本血液室溫下靜置2h，3000r/min離心10min，分離血清。組內血清可混勻，后于生物安全柜內用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，放入56℃恒溫水浴箱中滅活30min，按1.5ml/管分裝于EP管中，注明編號，-80℃冰箱保存備用。

5 培養細胞

將BRL3A大鼠肝細胞培養在含10%胎牛血清的完全培養基中，放入濕度95%、溫度37℃、含5%CO2的培養箱中培養，待細胞長至80%時進行傳代，取對數生長期者用于實驗。

6 BRL3A大鼠肝細胞酒精性肝損傷細胞模型造模

6.1 確定酒精性肝損傷細胞模型的乙醇作用濃度將處于對數生長期的BRL3A大鼠肝細胞用胰酶消化后，配制成1×106個/L的細胞懸液，接種于96孔板，100μL/孔。待細胞完全貼壁后分為空白對照組及6個不同濃度梯度的乙醇組，每組5個復孔，空白組加入完全培養基，6個乙醇組分別加入含終濃度為1%、1.5%、2%、2.5%、3%、5%乙醇的培養基，分別培養12h、24h、48h后用CCK8法檢測細胞存活率，用正置顯微鏡觀察細胞狀態及生長狀況，根據CCK8結果及細胞活力確定乙醇造模的最佳濃度。

6.2 確定酒精性肝損傷細胞模型的乙醇作用時間將處于對數生長期的BRL3A大鼠肝細胞加入不同濃度梯度的乙醇培養液中培養12h、24h、48h后收集細胞培養液，用酶標法檢測各組細胞上清液中GGT、LDH含量，根據GGT、LDH結果及細胞活力確定乙醇造模的最佳時間。

7 枳葛口服液含藥血清干預乙醇誘導的大鼠肝細胞酒精性肝損傷模型相關實驗指標檢測

將處于對數生長期的BRL3A大鼠肝細胞消化后，制成細胞密度為2×105個/mL并接種于6孔板中，實驗分為6組（見表1），每組設4個復孔，分別處理BRL3A大鼠肝細胞24h后收集細胞上清液，用酶標法檢測各組細胞上清液中GGT、LDH含量；RT-PCR法測定各組細胞內Syk、Ras、MEK1/2、ERK1/2、c-Fos mRNA表達情況。

表1 實驗組溶液配置

8 統計學處理

所得數據采用SPSS17.0進行統計分析，計量資料采用（±s）表示，組間均數比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果分析

1 BRL3A大鼠肝細胞酒精性肝損傷細胞模型造模

1.1 確定酒精性肝損傷細胞模型的乙醇作用濃度與空白對照組相比較，不同濃度梯度的乙醇干預12h、24h、48h后，細胞存活率隨著乙醇濃度的增大而逐漸降低，當乙醇濃度在2.5%時，12h、24h的細胞存活率均大于50%，但在48h時細胞活力下降，存活率明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 不同濃度乙醇及時間對 BRL3A大鼠肝細胞存活率的影響（ ±s，n=5）

表2 不同濃度乙醇及時間對 BRL3A大鼠肝細胞存活率的影響（ ±s，n=5）

注：與空白對照組（0%）比較，*P＜0.05，**P＜0.01。組別中0%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，5%為不同濃度乙醇含量體積比。

組別12h24h48h OD值存活率/%OD值存活率/%OD值存活率/%0%1.11±0.10100.00±10.630.89±0.07100.00±9.431.48±0.25100.00±18.93 1%1.10±0.1099.50±9.970.87±0.0798.19±9.541.31±0.1187.28±7.94 1.5%1.08±0.06*96.86±6.270.84±0.19*94.15±25.861.21±0.14*79.85±10.56 2%1.04±0.05**93.66±4.91**0.82±0.16**91.12±20.87**1.04±0.24**66.74±17.85**2.5%1.03±0.07**91.74±6.82**0.78±0.09**85.53±12.42**0.81±0.14**49.25±10.35**3%1.00±0.10**89.00±10.65**0.75±0.12**82.47±15.76**0.78±0.28**47.69±20.78**5%0.90±0.13**78.25±13.66**0.70±0.15**75.96±20.08**0.66±0.19**38.50±14.34**

1.2 確定酒精性肝損傷細胞模型的乙醇作用時間當乙醇培養細胞24h，濃度為2.5%時，GGT、LDH水平增高與空白組具有顯著差別（P＜0.01），見表3。顯微鏡下可見BRL3A大鼠肝細胞較空白對照組漂浮細胞增多，體積增大，見圖1。

圖1 BRL3A大鼠肝細胞酒精性肝損傷模型

表3 不同濃度乙醇及時間對BRL3A大鼠肝細胞中GGT、LDH含量的影響（ ±s，n=4）

注：與空白對照組（0%）相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別12h24h48h GGT/U·L-1LDH/U·L-1GGT/U·L-1LDH/U·L-1GGT/U·L-1LDH/U·L-1 0%9.75±0.53100.52±4.2310.74±1.24102.62±7.8612.38±2.06116.46±9.52 1%10.87±0.59112.04±12.1411.82±1.34116.14±5.3613.13±0.95121.84±8.58 1.5%12.06±2.13120.18±16.7712.08±1.55135.51±11.6914.20±1.32132.89±17.72 2%12.78±1.77138.82±20.25*12.72±1.39184.39±29.35**15.41±1.56154.07±21.98 2.5%14.63±2.93**150.22±30.77**13.89±1.33**200.37±34.15**17.13±1.85**175.32±27.95**3%15.92±2.81**164.34±36.76**15.02±1.41**236.25±38.49**19.65±2.47**220.29±42.40**5%17.67±2.40**174.49±25.75**17.43±2.05**277.15±31.87**24.20±4.44**280.27±39.77**

2 確定酒精性肝損傷細胞模型

根據上述結果并結合鏡下觀察所見最終確定采用2.5%乙醇誘導BRL3A大鼠肝細胞24h進行造模。

3 枳葛口服液含藥血清對乙醇誘導的大鼠肝細胞酒精性肝損傷模型上清液中GGT、LDH含量的影響

GGT含量與模型組比較：正常組、枳葛高劑量組及陽性對照組上清液中GGT水平顯著降低（P＜0.01），枳葛中劑量組上清液中GGT水平明顯降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較：模型組及枳葛低劑量組上清液中GGT水平顯著上升（P＜0.01）。LDH含量與模型組比較：正常對照組、枳葛高劑量組、枳葛中劑量組及陽性對照組細胞上清液中LDH水平顯著降低（P＜0.01）；與陽性對照組相比較：模型組、枳葛低劑量組細胞上清液中LDH含量顯著升高（P＜0.01）。見表4。

表4 枳葛口服液含藥血清對乙醇誘導的大鼠肝細胞酒精性肝損傷模型上清液中GGT、LDH含量的影響（ ±s，n=4）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別GGT/U·L-1LDH/U·L-1正常組14.27±3.61**116.98±8.15**模型組24.40±1.85##203.77±16.01##陽性對照組14.22±0.90**118.87±11.32**枳葛低劑量組23.23±1.61##196.23±14.78##枳葛中劑量組20.92±2.73*##138.68±13.56**#枳葛高劑量組12.54±1.36**119.81±12.47**

4 枳葛口服液含藥血清對乙醇誘導的大鼠肝細胞酒精性肝損傷模型細胞內Syk、Ras、MEK1/2、ERK1/2、c-Fos等mRNA表達的影響

與正常組比較：模型組細胞內Syk、Ras、MEK1/2、ERK1/2、c-Fos mRNA表達顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較：正常組、陽性對照組及枳葛高劑量組細胞內Syk、Ras、MEK1/2、ERK1/2、c-Fos等mRNA表達顯著降低（P＜0.01），枳葛中劑量組Ras、ERK1/2、c-Fos等mRNA表達顯著降低（P＜0.01），Syk、MEK1/2等表達明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

討 論

Syk/Ras/ERK信號通路是調節細胞生長、分化、凋亡的經典通路[14]。酪氨酸激酶（Syk）是一種非受體蛋白激酶，介導各種細胞因子的信號傳導[15]。Syk具有廣泛的生物學功能，主要包括促進細胞的增殖與分化、抑制腫瘤細胞、影響細胞因子分泌等。已有研究表明，Syk在肝實質細胞和非實質細胞中表達，并與酒精性肝病、各種病毒性肝炎、肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎和肝細胞癌等肝臟疾病的發病機制及防治密切相關，在肝細胞中，Syk主要通過G蛋白偶聯受體激活MAPKs[16]。激活的Syk可以和下游信號傳導效應因子相互結合，進而影響轉錄因子的激活，參與促炎基因的表達[17]。已有相關研究證明[18]，酒精性肝損傷患者肝臟中Syk表達和磷酸化水平增加，大量炎癥因子釋放使Syk磷酸化被激活后，進一步激活多個下游及相關信號通路[19]，如控制細胞增殖的Ras/ERK等。RasGRP是含有C1結構域的一個鳥苷交換因子，將Ras蛋白從無活性的GDP形式變成有活性的GTP形式，從而使Ras活化[20-21]。Ras激活后，依次激活下游的Raf、Mek、ERK三個激酶。磷酸化的ERK轉移到細胞核內，激活AP-1家族的兩個關鍵轉錄因子c-JUN和c-Fos[22-23]。這些信號通路激活后產生級聯反應，共同調節著細胞的生長、分化、炎癥反應等多種重要的細胞生理、病理過程。因此，對于酒精性肝損傷的炎癥機制研究從Syk/Ras/ERK信號通路入手是有理論依據支撐的。

酒精性肝損傷發病的根本原因在于長期過度的酒精攝入，該病發生的主要危險因素與飲酒的量和時限、性別、年齡、生活方式等密切相關[24]。本研究應用乙醇造模時發現，代表酒精性肝損傷炎癥指標的GGT及LDH顯著升高（P＜0.01），表明肝細胞明顯損傷，造模成功。模型組細胞內Syk、Ras、MEK1/2、ERK1/2、c-Fos mRNA表達顯著升高（P＜0.01），表明酒精相關肝細胞損傷產生大量炎癥因子刺激Syk使其活化，可見Syk-Ras-ERK信號通路被激活，一系列炎癥級聯反應出現。乙醇造模同時予以不同濃度枳葛口服液含藥血清組及美他多辛含藥血清組（陽性對照組）干預后，發現枳葛高劑量組及陽性對照組細胞上清液中GGT、LDH水平顯著下降（P＜0.01），表明予以枳葛口服液干預后炎癥指標下降，肝臟炎癥得到明顯改善；枳葛高、中劑量組及陽性對照組細胞內Syk、Ras、MEK1/2、ERK1/2、c-Fos mRNA表達顯著降低（P＜0.01/0.05），提示一定濃度的枳葛口服液可能通過抑制Syk-Ras-ERK信號通路的活化，從而改善酒精引起的肝細胞炎癥損傷，且枳葛口服液抗炎作用隨著枳葛口服液濃度的增加而增大，這與本課題前期實驗結果一致[6，9-10]。

綜上所述，本研究結果顯示，枳葛口服液可以促進體內新陳代謝，加強肝臟解毒功效，減輕酒精對肝細胞的損傷，增強肝臟抗炎能力，其機制可能與抑制Syk/Ras/ERK信號通路的活化，從而改善酒精性肝損傷有關。