淫羊藿苷對錳致小鼠精母細胞死亡的抑制作用*

賀佳琪，田春花，胡元梅，蔡仁蓮，檀軍，陸祥，田瑩

1 遵義醫科大學，組織學與胚胎學教研室 貴州遵義 563000

2 遵義醫科大學，形態學實驗室 貴州遵義 563000

錳，廣泛存在于自然界中，常見于以化合物的形式存在，在地殼內其平均含量為0.1%，是已知元素的第十五位[1]。其在機體正常發育、脂類、氨基酸和葡萄糖代謝及細胞能量調節中發揮著重要作用[2]。錳是國民經濟中重要的基礎物資和國家重要戰略資源之一，我國是全球最大的錳生產國、消費國和出口國，錳礦在西南地區主要分布于重慶和貴州等地[3]。但近年來，隨著無鉛汽油、農藥代森錳等的廣泛使用，以及錳礦的開采、錳合金的冶煉、電焊時的大量煙塵，造成環境中錳的含量逐漸升高，增加了普通人群接觸錳的機會，導致錳在體內的濃度失衡[4]，誘發誘發嚴重不可逆的精神和錐體外系運動功能障礙，出現帕金森綜合征的臨床表現，過量錳進入人體也會影響生殖功能[5]。研究顯示，錳可使男工的生殖能力減弱，其妻子自然流產率和死胎率可隨著其丈夫接觸錳時間的增加而升高[6]。國發[2022]2號文件指出“實施磷、錳、赤泥、煤矸石污染專項治理……”可見國家對錳污染危害的重視。

淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim，EbM），別名仙靈脾，是臨床常用的傳統補益中藥。據《中華人民共和國藥典》（2020版）記載，EbM主要功能有溫補肝腎、強健筋骨、祛風濕等[7]。研究表明，EbM主要含有黃酮類、多糖類、揮發油、生物堿及鉀、鈣、鎂等多種微量元素，具有清除自由基、抗氧化、抑制DNA損傷、調節雄性生殖功能的作用，其主要活性成分為淫羊藿苷（Icariin，ICA）[8]。研究報道，ICA可通過抵抗氧化損傷、抑制生精細胞凋亡來改善由尼古丁、酒精所致的睪丸損傷，但是，ICA能否抑制錳誘導的生殖細胞損傷？本文在前期對錳影響生殖功能研究的基礎上，對小鼠精母細胞GC-2spd（ts）進行一定劑量的錳染毒，探討ICA對錳致生殖損傷是否具有修復作用，為錳致不育癥及生殖損傷的治療提供實驗依據。

儀器與材料

1 實驗儀器

CO2細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific，美國，型號：Forma3121）；生物安全柜（Midea，中國，型號HR60-ⅡA2）；酶標儀（SpectraMax M2，MolecuLar Devices，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus Corporation，日本，型號：CKX53）。

2 材料

GC-2spd（ts）細胞株購自中科院細胞庫；ICA（純度98.61%，批號：160920）購自成都植標化純生物技術有限公司；MTT（貨號：ST316）、二甲基亞砜溶液（DMSO，貨號：ST038）均購自上海碧云天生物技術有限公司；DMEM（貨號：8121045）、胰酶均為美國Gibco公司產品；胎牛血清為杭州四季青產品；甲醇（分析純）。

3 實驗方法

3.1 藥物配制 稱取3.38 mg ICA粉末溶于100 μL甲醇中，在37℃水浴箱中加熱5 min后，在搖床上震蕩，待ICA完全溶解，即配制500 μmol/L ICA（母液），取母液稀釋使用，ICA在細胞培養液中終濃度為0.05、0.5、5、50 μmoL/L。

3.2 細胞染毒 GC-2spd（ts）采用DMEM高糖培養基（含1% Glutamax，100 mmoL/L Sodium Pyruvate Solution），添加10%胎牛血清，置于37°C、5% CO2培養箱中培養，分為空白對照組（Control）、陰性對照組（含等體積溶劑甲醇）、錳染毒模型組（MnCl2）、淫羊藿苷組（ICA）、淫羊藿苷干預組（ICA+MnCl2）、溶劑與淫羊藿苷組（甲醇+ICA），每一組設置5個復孔，實驗重復三次。參考前期預實驗摸索的MnCl2作用于GC-2spd（ts）細胞24 h、72 h的IC50加MnCl2（24 h的IC50為5.23×10-3mol/L，72 h的IC50為3.23×10-4mol/L）。3.3 MTT法檢測GC-2spd（ts）細胞活力 將對數生長期的GC-2spd（ts）細胞制成細胞懸液，用血球計數板進行細胞計數，接種至96孔板中，每孔100 μL，接種細胞數量為每孔5×103個，每一組設置5個復孔，實驗重復三次[9]，于37℃、5% CO2培養箱中培養，48 h后，向每孔分別加入10 μL MTT試劑（5 mg/mL），避光培養4 h后[10]，棄上清，每孔分別加入100 μL DMSO，振蕩5 min，再放入培養箱繼續培養30 min，以 確 保 結 晶 充 分 溶 解。甲瓚充分溶解后用酶聯免疫檢測儀于570 nm波長處測量吸光度（OD）值[11]，計算各組細胞存活率。細胞存活率（%） =（實驗組OD值-空白組OD值） /（對照孔OD值-空白組OD值） × 100% 。

4 統計學分析

所有數據采用GraphPad Prism 8.3.0進行統計分析，數據均以均值±標準誤表示，組間采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度的ICA對GC-2spd（ts）細胞增殖活性的影響

MTT法檢測用甲醇溶解的不同濃度（0.05、0.5、5、50μmol/L）ICA處理的GC-2spd（ts）細胞，在作用48 h之后檢測細胞存活率。甲醇組的存活率為（99.40±2.24）%，0.05、0.5、5、50 μmol/L ICA干預組的GC-2spd（ts）存活率為（108.04±4.83）%、（111.86±3.67）%、（106.43±3.67）%、（115.58±2.95）%，上述結果顯示，與空白對照組相比，雖然各濃度ICA干預組的細胞存活率都略高于對照組，但只有50 μmoL/L ICA具有統計學意義（P＜0.05），其中，ICA濃度為5 μmoL/L時，細胞存活率略低，ICA濃度為50 μmoL/L的時候，細胞存活率相對較高，表明50 μmoL/L ICA可促進小鼠精母細胞GC-2spd（ts）增殖。

2 ICA作用48 h對MnCl2誘導GC-2spd（ts）細胞死亡的抑制作用

MnCl2組與空白對照組相比細胞存活率顯著下降（P＜0.05），錳染毒組加入溶劑（甲醇）以及不同濃度ICA（0.05、0.5、5、50 μmol/L）進行干預，發現ICA對于MnCl2損傷的GC-2spd（ts）細胞有顯著的修復作用（P＜0.05）。其中，甲醇組的存活率為91.59±3.41%，MnCl2染毒組的存活率為（8.31±0.70）%，0.05、0.5、5、50 μmol/L ICA干預組的GC-2spd（ts）細胞存活率分別為（79.48±1.87）%、（81.58±1.51）%、（75.68±1.98）%、（68.87±1.58）%，MnCl2與甲醇共同作用組的存活率為（64.66±2.60）%。上述結果表明，各濃度ICA干預組的細胞存活率都高于MnCl2組，差異顯著（P＜0.05），其中，ICA濃度為0.5 μmol/L時，細胞存活率最高，ICA濃度為50 μmol/L的時候，細胞存活率相對較低。

圖1 ICA作用48 h對GC-2spd（ts）細胞存活率的影響

圖2 ICA作用48 h對MnCl2誘導GC-2spd（ts）細胞死亡的抑制作用

討 論

錳在自然界中分布廣泛，隨著我國錳礦開采，錳中毒所帶來的問題也隨之而來。研究表明，錳對性功能有一定的影響，主要體現在性欲減退、排精障礙、早泄、陽痿等；錳礦工人的妻子流產率、死胎率在上升。錳可使細胞產生大量自由基，損傷線粒體，致使ATP合成明顯減少或使上調促凋亡蛋白表達而誘導細胞凋亡[12]。但目前尚無有效的預防及治療措施。

淫羊藿苷（ICA）對下丘腦-垂體-性腺軸功能、性激素生成、性器官及性功能有一定促進作用，可以促進睪酮合成、促進精子生成并改善精子生成的微環境。ICA對男性生殖系統損傷具有保護作用，可改善環磷酰胺誘導大鼠睪丸生精障礙[13]、酒精致雄性小鼠生殖損傷[14]，以及改善 GC-1細胞DNA氧化損傷[15]，其還可促進陰莖勃起，治療早泄等[16]。但ICA對于錳致的生殖損傷是否有修復作用，目前尚未見報道。

本課題組前期研究發現高劑量錳對于生精母細胞GC-2spd（ts）有損傷作用，基于此，我們進一步探究ICA對錳致精母細胞GC-2spd（ts）的損傷是否具有修復作用。研究結果表明，錳染后GC-2spd（ts）細胞皺縮、漂浮，使用ICA進行干預后，GC-2spd（ts）細胞恢復正常，且細胞存活率得到明顯提高。研究表明，九香蟲提取物對MnCl2致生殖損傷具有一定修復作用，可能是通過抑制凋亡相關基因如Bax、Cyt c以及Caspase 3的表達從而抑制其凋亡，但ICA對MnCl2致生殖損傷修復作用的機制尚不明確，可進行深入的研究，本文所使用的小鼠的精母細胞GC-2spd（ts）轉染了SV40大T抗原基因，其p53抑癌基因（溫度敏感）發生突變，該細胞經過G418篩選，已喪失其分化潛能，處于減數分裂前期，故可利用該細胞在體外進行生殖損傷修復研究。但其與精母細胞在體內生長的狀態仍有所不同，后期還需進一步利用動物模型開展體內生殖損傷修復實驗研究。本文研究發現，MnCl2與甲醇共同作用組相較于MnCl2組細胞存活率有顯著升高，推測其成分可能對MnCl2的生殖毒理作用有影響，但具體機制尚不明確，可進行深入研究，此外，還可進一步選擇DMSO、甲醇、羧甲基纖維素鈉溶解ICA進行生殖損傷修復實驗。以期為錳致生殖損傷的預防、治療提供參考。