基于響應面的三葉青葉多糖的提取工藝和抗氧化活性研究*

龔來覲，李鶴，常青

江西農業工程職業學院 江西宜春 331200

三葉青主要分布于中國浙江、江西、福建、廣西，用于治療風濕性關節炎、祛痰、改善血液循環。現代藥理學研究，三葉青具有抗炎[1-2]、抗腫瘤[3-4]、抗病毒[5]、和抗菌作用[6]，臨床上廣泛應用于治療各種疾病，包括肺炎、病毒性腦膜炎、高熱等[7]。

三葉青的藥效和生物活性與其復雜的化學成分密切相關，近年來，研究者多集中于對三葉青塊根及其黃酮組分成分和藥效的研究[8-10]，鮮少對三葉青地上部分的研究，其中多糖是一種重要成分，從三葉青地上部分提取的多糖研究更少，此外，多糖具有抗氧化活性，可以清除過量的自由基以減少氧化損傷，這已被大量研究證實[11-12]。然而，三葉青葉多糖的抗氧化活性尚未研究。

本研究旨在結合超聲波和酶的優勢提取三葉青葉多糖。結合單因素實驗和RSM的BBD，獲得最佳提取條件，以碳水化合物的濃度來評估三葉青葉多糖的提取率。采用高效液相色譜法（HPLC）分析三葉青葉多糖的單糖組成。此外，用FRAP法、DPPH和羥自由基清除活性的研究揭示三葉青葉多糖的抗氧化活性。

材料與方法

1 材料和試劑

三葉青的地上由江西大茅山中藥生物科技有限公司提供。維生素C、纖維素酶（木霉Vride G）、DPPH1、PMP、TFA（遠野生物科技有限公司）；FRAP試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2 設備

KQ-500DE超聲波清洗機（中國昆山昆山超聲波儀器有限公司）；真空冷凍干燥器（美國Labconco）；分光光度計（美國BioTek Epoch2）；安捷倫1260 HPLC系統（DAD檢測器）。

3 方法

3.1 三葉青葉多糖的制備 取三葉青葉干粉2.0g，40mL95%乙醇在80℃回流1h，減壓過濾，80℃干燥2h。超聲波清洗機中，設計纖維素酶用量、時間、超聲波提取功率、水料比和溫度的，用去離子水提取干樣品，過濾后以8000轉/min的速度離心5min，從水提取物中獲得上清液。然后，將三倍體體積的95%乙醇與上清液充分混合，并保持在4℃沉淀12h以沉淀多糖。以4000r/min的速度離心10min，以將沉淀物從有機溶劑中分離出來。再溶解的三葉青葉多糖溶液用Sevag試劑脫蛋白。然后劇烈搖晃和離心后得脫蛋白的三葉青葉多糖，真空冷凍干燥[13-15]。

3.2 三葉青葉多糖含量的測定 以D-葡萄糖為標準，用苯酚-硫酸法測定三葉青葉多糖的碳水化合物濃度[10]，供試品制備成三葉青葉多糖溶液：5%苯酚：98%硫酸為1:1:5的混合物，并在100℃下培養℃20min，490nm處測量混合物的吸光度，三葉青葉多糖的提取率（%）計算如下:

其中C是萄糖標準曲線計算的三葉青葉多糖的碳水化合物濃度；V是三葉青葉多糖溶液的體積；D是稀釋系數；M是三葉青葉子粉末的重量。

3.3 三葉青葉多糖提取的單因素實驗 單因素實驗設計，纖維素酶用量（1、2、3、4和5%）、提取時間（20、40、60、80和100min）、提取功率（300、350、400、450和500 W）和水料比（v/W=10/1、20/1、30/1、40/1和50/1mL/g）。

3.4 基于RSM的三葉青葉多糖提取優化 根據單因素實驗的四個條件的初步范圍，如表1，以纖維素酶用量（%，XA）、提取時間（min，XB）、提取功率（W，XC）和水料比（mL/g，XD）為自變量，每個變量的三個水平表示為-1、0、1，用Design Expert12.0.3軟件建立了一個3水平29次的BBD，以最大限度地提高三葉青葉多糖的提取率，29次實驗運行和RSM結果如表2所示。四個自變量和響應變量之間的關系來自以下回歸模型。

表1 Box-Behnken設計（BBD）中使用的自變量及其水平

表2 自變量和響應變量的Box-Behnken設計（BBD）

3.5 三葉青葉多糖抗氧化活性的測定

3.5.1 DPPH自由基清除活性的測定 以維生素C作為陽性對照，[16-18]將一系列三葉青葉多糖溶液（1.0-6.0 mg/mL）與0.04 mg/mL DPPH自由基乙醇溶液混合，然后避光條件下在37℃放置30min。519nm下測吸光度。通過以下等式計算DPPH自由基清除活性:

DPPH自由基清除活性% =[1-（A1-A2）/A0]

其中A0是無水乙醇+DPPH的吸光度；A1是三葉青葉多糖溶液+DPPH的吸光度；A2是三葉青葉多糖溶液+無水乙醇的吸光度

綜上所述，健康教育在高血脂患者中有著重要的應用價值，有效的將血脂控制在正常范圍內，提高患者自我管理能力。

3.5.2 羥自由基清除活性的測定 將一系列三葉青葉多糖溶液與9 mM FeSO4和0.1%（v/v）H2O2混合。向混合物中添加9毫摩爾水楊酸-乙醇溶液以開始反應，并在37℃下持續30min， 在510 nm處測量三葉青葉多糖樣品和陽性對照品（維生素C）的吸光度。羥自由基清除活性計算為：

羥自由基清除活性 %=[1-（A1-A2）/A0]

其中A0是水楊酸在乙醇中被去離子水取代的吸光度；A1是三葉青葉多糖溶液的吸光度；A2是用去離子水取代的三葉青葉多糖溶液的吸光度。

3.5.3 FRAP法測定總抗氧化能力 使用FRAP試劑盒測量三葉青葉多糖的總抗氧化能力。將檢測緩沖液、基質溶液和基質液（v/v，10:1:1）混合并在37℃預熱10min，以制備FRAP工作溶液。制備FeSO4（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mM）的標準溶液，以獲得校準曲線。將5微升三葉青葉多糖溶液與160微升FRAP工作溶液混合，并在37℃下孵育10min，594nm處測量吸光度。以維生素C用作陽性對照。硫酸亞鐵的濃度表示三葉青葉多糖的總抗氧化能力。

結 果

1 三葉青葉多糖提取的單因素實驗

1.1 纖維素酶用量對三葉青葉多糖提取率的影響在提取溫度55℃、時間60min、功率400瓦、水料比設置為30:1 mL/g條件下。如圖1A所示，隨著纖維素酶用量從1.0%增加到2.0%，三葉青葉多糖的提取率顯著增加（P＜0.01），在2.0%的用量下達到峰值（4.452±0.143%）。然而，隨著纖維素酶用量從2.0%增加到5.0%，三葉青葉多糖的提取率略有下降，差異不顯著（P＞0.05）。因此，選擇纖維素酶的用量（1.0%～3.0%）進行RSM實驗。

圖1 纖維素酶用量（A）、提取時間（B）、提取功率（C）和水料比（D）對三葉青葉多糖提取率的影響

1.2 提取時間對三葉青葉多糖提取率的影響 提取時間對三葉青葉多糖提取率的影響如圖1B所示。在提取溫度55℃、纖維素酶用量3.0%、功率400W和水與材料的比例設置為30:1 mL/g條件下。隨著提取時間從20min延長到80min，三葉青葉多糖的提取率顯著增加（P＜0.01），而隨著提取時間的延長，三葉青葉多糖的提取率顯著降低（P＜0.01）。提取時間為60min，提取率為（4.254±0.170）%。因此，RSM實驗選擇了40～80min的提取時間。

1.3 提取功率對三葉青葉多糖提取率的影響 如圖1C.研究了提取功率對三葉青葉多糖提取率的影響。提取溫度、纖維素酶用量、時間和水料比設置為55℃、3.0%、60min和30:1 mL/g。隨著提取功率從300 W增加到400 W，三葉青葉多糖的提取率呈顯著（P＜0.01）上升趨勢，在400W時達到最大值（4.198±0.075）%。然而，當提取功率＞400 W時，其呈相反趨勢。因此，RSM實驗采用提取功率（350-450W）。

2 用響應面（RSM）優化三葉青葉多糖的提取

2.1 模型擬合 RSM數據分析由Design Expert 12.0軟件執行。使用SPSS Statistics 20.0和ANOVA進行統計分析。P＜0.05具有統計學意義。RSM實驗數據如表2所示。

獲得回歸方程，如下所示:

其中Y是三葉青葉多糖的提取率；XA為纖維素酶用量；XB是提取時間；XC是提取功率；XD是水與材料的比率。

使用Design Expert軟件12.0對RSM數據進行方差分析的結果如表3所示。通過F檢驗和P值評估顯著性。模型的P值＜0.0001，這證明了模型對提取的極端意義。擬合值5.58的缺失表明相對純誤差不顯著。確定系數（R2）和調整測定系數（R2）分別為0.9612和0.9223，變異系數（C.V.）為3.45%。ADEQ精度為14.8105（＞4是理想的），表明該模型可以導航設計空間。

表3 RSM實驗數據的方差分析

2.2 響應面分析 RSM分析顯示為一系列三維響應面和二維等高線圖（圖2）。三維圖（A1-F1）的陡度和二維等高線圖（A2-F2）的形狀解釋了這些自變量之間的相互作用。陡峭的三維響應面和橢圓等高線圖表明，兩個變量之間的相互作用顯著。相反，柔和的三維響應面和圓形等高線圖表明相互作用不顯著。此外，自變量對三葉青葉多糖提取率的影響也可以通過三維圖的陡度來評估。如圖2A1-C1所示，纖維素酶用量（XA）對三葉青葉多糖提取率的影響比提取時間（XB）、提取功率（XC）和水料比（XD）的影響更為顯著。從圖2D1-E1可以看出，很明顯，提取時間（XB）對三葉青葉多糖提取率的影響比提取功率（XC）和水料比（XD）更為顯著。同樣，圖2F1表明水與材料的比率（XD）對三葉青葉多糖提取率的影響比提取功率（XC）更為顯著。此外，圖2A2-F2表明，這四個變量之間的交互作用不顯著。上述結論與表3中的線性系數和叉積系數完全一致。

圖2 三葉青葉多糖提取率的響應面圖

3 模型驗證

通過響應面圖分析和回歸方程估計三葉青葉多糖提取的最佳條件為纖維素酶用量為2.25%，提取時間62.48 min，超聲波提取功率400.32W，水料比29.86 mL/g。根據實際情況，對提取條件進行了修改，并在表4中列出。在最佳條件下，三葉青葉多糖的平均提取率為（4.694±0.053）%，符合預測的響應值（4.702%）。因此，該模型是可靠的，足以優化三葉青葉多糖的提取。

表4 最佳條件下的預測結果和實驗結果

4 三葉青葉多糖的抗氧化活性

4.1 四氫卟啉的DPPH和羥自由基清除活性 圖4中記錄了三葉青葉多糖的DPPH和羥基自由基清除活性。顯然，測定了三葉青葉多糖的DPPH和羥基自由基清除活性低于維生素C。三葉青葉多糖的DPPH自由基清除活性隨著其濃度從1.0 mg/mL增加到5.0 mg/mL而顯著增加（P＜0.01）。然而，當三葉青葉多糖濃度＞5.0mg/mL時，其DPPH自由基清除活性從（78.204±1.242）%提高到（80.392±0.975）%，差異不顯著（P＞0.05）。類似的結果如圖5B所示，在1.0 mg/mL的濃度下，三葉青葉多糖的羥基自由基清除活性為（53.876±0.638）%，而當三葉青葉多糖的濃度增加到4.0 mg/mL時，活性顯著增加到（77.492±1.275）%（P＜0.05）。然而，在4.0、5.0、6.0和7.0 mg/mL的三葉青葉多糖濃度下，羥基自由基清除活性差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 維生素C和三葉青葉多糖的DPPH（A）和羥基（B）自由基清除活性

圖5 FRAP法測定總抗氧化能力

4.2 FRAP法測定總抗氧化能力 鐵還原抗氧化能力（FRAP）是一種用于測定還原能力的經典且廣泛使用的方法。[19－20]使用FRAP試劑盒測定三葉青葉多糖的總抗氧化能力（T-AOC），并進行回歸分析方程如下：Y=2.733X-0.03874，R2=0.9985。如圖4所示，維生素C的T-AOC顯著高于三葉青葉多糖，三葉青葉多糖的 T-AOC隨著濃度從1.0 mg/mL增加到7.0 mg/mL呈顯著上升趨勢（P＜0.01）。此外，三葉青葉多糖的濃度和抗氧化鐵還原能力接近標準溶液。這些結果表明，三葉青葉多糖具有較強的總抗氧化能力，T-AOC與其濃度密切相關。

討 論

在本研究中，使用超聲波輔助酶法從三葉青葉子中提取多糖。在RSM優化的最佳條件下，三葉青葉多糖的提取率有效提高。纖維素酶用量和提取時間是影響產率的關鍵因素。在最佳條件下，三葉青葉多糖的平均提取率為（4.694±0.058）%，與預期值吻合較好。因此，RSM建立的模型很好地適用于三葉青葉多糖提取的優化，RSM可以為優化提供很大的指導。

研究中發現，三葉青葉多糖的鐵還原能力的抗氧化能力接近標準溶液，這表明三葉青葉多糖具有較強的總抗氧化能力。DPPH和羥自由基清除活性的峰值分別為（80.388±0.972）%和（81.923±1.687）%。這表明三葉青葉多糖具有很強的抗氧化能力，但低于陽性對照。此外，當三葉青葉多糖在1.0～4.0mg/mL范圍內時，三葉青葉多糖的羥自由基清除活性大于DPPH。然而，當三葉青葉多糖濃度＞4.0mg/mL時，其DPPH和羥自由基清除活性接近。這些結果表明，多糖有助于三葉青的抗氧化能力，它可以拓寬探索新抗氧化劑的視野。應進一步研究三葉青葉多糖的結構和生物活性，以擴大三葉青的開發和利用。