利血平灌胃誘導大鼠低血壓模型的構建

張璇 王慈 張澤宇 張培培 任秋安 王賢良 毛靜遠

摘要：目的 確定利血平誘導大鼠低血壓模型的適合劑量與時間。方法 60只雄性Wistar大鼠按照體重及收縮壓水平進行分層，然后每層再按照隨機數字表法分為對照組和5個不同劑量實驗組，每組10只。對照組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液10 ml/kg，實驗組灌胃利血平混懸液10 ml/kg，給藥濃度分別為0.016、0.032、0.064、0.128、0.160 mg/kg，各組均每日灌胃2次。每日監測大鼠體重，分別于造模前和給藥后1～6周末測量大鼠收縮壓及心率變化。給藥6周后，目內眥取血檢測大鼠血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、血肌酐及尿素氮水平，每組隨機選取3只觀察停藥后大鼠收縮壓變化情況，其余大鼠處死后測定腦內去甲腎上腺素及多巴胺水平。結果 與對照組比較，不同濃度利血平均可降低大鼠收縮壓水平（F=28.492，P＜0.001），收縮壓下降幅度隨藥物濃度的增高而增加，第1周達到最低，隨后稍有回升，給藥3周后趨于穩定。其中0.016 mg/kg組大鼠收縮壓水平自灌胃第5周開始與對照組比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）；0.032、0.064、0.128、0.160 mg/kg組各時間點大鼠收縮壓水平均顯著低于對照組（P均＜0.001），但4種不同給藥濃度組間比較差異無統計學意義（P=0.204）。停藥1周后，不同濃度利血平組大鼠收縮壓均回升至基線水平，并維持穩定。各組間大鼠心率隨時間的變化趨勢一致，均呈現先增快后減慢的變化特點，相同時間點不同組間大鼠心率差異無統計學意義（F=0.922，P=0.475）。與對照組比較，不同濃度利血平組大鼠海馬去甲腎上腺素含量（P均＜0.001）及0.128 mg/kg（P=0.045）、0.160 mg/kg（P=0.042）組大鼠紋狀體多巴胺水平顯著降低，但不同濃度利血平組間比較差異無統計學意義（P=0.343，P=0.301）。不同濃度利血平組大鼠血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶及尿素氮水平隨利血平濃度增高而增加，其中0.160 mg/kg組乳酸脫氫酶（P=0.001）、肌酸激酶同工酶（P=0.020）、谷草轉氨酶（P=0.007）及尿素氮（P=0.001）與對照組比較差異有統計學意義。結論 利血平灌胃可成功誘導大鼠低血壓模型，其中利血平0.032 mg/kg、每日2次灌胃、連續3周為造模適宜條件，成模后需持續給藥以維持大鼠穩定的低血壓狀態。

關鍵詞：低血壓；動物模型；利血平

中圖分類號： R544.2文獻標志碼： A文章編號：1000-503X（2023）04-0533-08

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15376

Establishment of a Rat Model of Hypotension Induced by Reserpine

ZHANG Xuan^1，2，WANG Ci^1，2，ZHANG Zeyu^1，2，ZHANG Peipei^1，2，

REN Qiuan^1，2，WANG Xianliang¹，MAO Jingyuan¹

¹Cardiovascular Department of First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，National

Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion，Tianjin 300381，China

²Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China

Corresponding author：MAO Jingyuan Tel：022-27986333，E-mail：jymao@126.com

ABSTRACT：Objective To determine the optimal dosage and intervention duration of reserpine to establish a rat model of hypotension.Methods According to the body weight and systolic blood pressure （SBP），60 male Wistar rats were assigned to six groups （n=10），including a control group and five observation groups with different doses.The control group was administrated with 10 ml/kg 0.5% sodium carboxymethyl cellulose solution，and the observation groups with 0.016，0.032，0.064，0.128，and 0.160 mg/kg reserpine suspensions，respectively.All the groups were administrated by gavage twice a day，and the body weights of rats were monitored daily.SBP and heart rate （HR） were measured before modeling and 1-6 weeks after administration.After 6 weeks of administration，the blood samples of inner canthus were collected.The levels of lactate dehydrogenase （LDH），creatine kinase MB isoenzyme （CK-MB），alanine aminotransferase，aspartate aminotransferase （AST），serum creatinine，and blood urea nitrogen （BUN） were measured by an autoanalyzer.Three rats in each group were randomly selected for observation of the changes in SBP after drug withdrawal and the rest rats were sacrificed for measurement of the levels of norepinephrine and dopamine in the brain.Results Compared with the control group，different doses of reserpine lowered the SBP of rats （F=28.492，P<0.001）.The decline in SBP increased in a concentration-dependent manner.SBP reached the lowest value after 1 week，rose slightly later，and was stable after 3 weeks of administration.There was no significant difference in SBP between 0.016 mg/kg reserpine group and the control group after the 5th week （P>0.05）.The SBP levels of rats in 0.032，0.064，0.128，and 0.160 mg/kg reserpine groups showed no significant difference between each other （P=0.204） and were lower than that in the control group （all P<0.001）.One week after drug withdrawal，the SBP of rats in the observation groups rose to the baseline level and remained stable.HR showed similar changes among groups，first increasing and then decreasing.There was no significant difference in HR among different groups at the same time point （F=0.922，P=0.475）.Compared with the control group，reserpine of different doses reduced the norepinephrine content in the hippocampus （all P<0.001），and 0.128 mg/kg （P=0.045） and 0.160 mg/kg （P=0.042） reserpine lowered the dopamine level in the striatum，which showed no significant differences between different reserpine groups（P=0.343，P=0.301）.The levels of LDH，CK-MB，and BUN in the serum increased with the increase in reserpine concentration，and the levels of LDH （P=0.001），CK-MB （P=0.020），AST （P=0.007），and BUN （P=0.001） in the 0.160 mg/kg reserpine group were significantly different from those in the control group.Conclusions The rat model of hypotension can be induced by gavage with reserpine.The gavage with reserpine at a dose of 0.032 mg/kg，twice a day for three consecutive weeks is the optimal scheme for the modeling.After the model establishment，continuous administration is essential to maintain the hypotension.

Key words：hypotension；animal model；reserpine

Acta Acad Med Sin，2023，45（4）：533-540

利血平灌胃誘導大鼠低血壓模型的構建

中國醫學科學院學報

低血壓病臨床較為常見，多伴有頭暈、心悸、疲乏甚至黑矇、暈厥等臨床表現^［1］，雖無明顯致死率，卻嚴重影響患者生活質量，增加心理及經濟負擔^［2-4］。其確切發病機制至今未明，臨床常采用α受體激動劑、鹽皮質激素、谷維素、維生素及補充營養等治療措施，療效均不理想^［5-7］。建立一種高效、穩定的低血壓動物模型，將有助于對低血壓發病機制的認識和新藥的開發。目前，廣泛應用于低血壓研究的動物模型包括手術模型和藥物模型，其中手術模型最常用縮窄腹主動脈法^［8］，手術模型穩定性較高，但僅在結扎點以下表現為低血壓，與人類低血壓病的整體狀態有較大差異；藥物模型常使用利血平灌胃誘導大鼠形成整體低血壓狀態，與臨床實際情況較為貼切，更適宜藥效評價與機制探討^［9］。鑒于利血平誘導大鼠低血壓模型的劑量和干預時間尚無統一標準，現有文獻顯示，一般為每日2次灌胃給藥，給藥濃度0.0128～0.1600 mg/kg，干預時間1～6周^［10-11］。因此，本研究在此區間設定不同給藥濃度，進行為期6周的實驗觀察，以期篩選最佳造模條件，為低血壓的研究提供穩定的動物模型。

材料和方法

實驗動物 健康清潔級雄性Wistar大鼠60只，體重200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［合格證號：SCXK（京）2021-0006］，飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所動物中心［實驗動物使用許可證：SYXK（津）2019-0002］，溫度22～25 ℃，濕度55%～60%，晝夜各半循環照明，飼養期間各組大鼠自由飲水，喂養普通維持飼料（批號：22073231）。正式實驗前適應性飼養1周。所有實驗操作均嚴格遵照動物倫理相關規定執行并通過中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物倫理委員會審批（倫理審查批號：IRM-DWLL-2022133）。

主要試劑與儀器 復方利血平片（石藥集團歐意藥業有限公司，每片含利血平0.032 mg，批號：H13024462）、羧甲基纖維素鈉（西格瑪奧德里奇貿易有限公司，規格100 g，貨號：419273）、三溴乙醇（西格瑪奧德里奇貿易有限公司，批號：MKCM1060）、大鼠去甲腎上腺素酶聯免疫試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號：JL13428）、大鼠多巴胺酶聯免疫吸附測定試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號：JL12965）；智能無創血壓計BP-2010A（北京軟隆生物技術有限公司）、精密電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、L550臺式低速大容量離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、STATFAX2100全自動酶標儀（美國Awareness Technology公司）、BS-350E全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）。

藥物配置 實驗組設置5種不同濃度的利血平混懸液，分別取1、2、4、8、16片復方利血平片于研缽中研磨至粉碎，成細粉后邊研磨邊向其中加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，研磨混勻后轉移至燒杯，定容至20 ml，每次使用前均需現用現配，避光放置，4 ℃保存。

實驗分組及模型制備 60只雄性Wistar大鼠適應性飼養1周，期間進行血壓測量適應性訓練。1周后按照大鼠體重及收縮壓水平進行分層，然后每層再按照隨機數字表法分為對照組和5個不同劑量實驗組，每組10只。對照組大鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉10 ml/kg，實驗組灌胃利血平混懸液10 ml/kg，給藥濃度分別為0.016、0.032、0.064、0.128、0.160 mg/kg，各組均每日早晚灌胃2次，連續給藥6周。

觀察指標及方法

一般狀態觀察：每天固定時間稱量大鼠體重，密切觀察給藥后大鼠精神狀態、活動量及對外周刺激的反應程度，記錄各組的死亡分布情況。

大鼠收縮壓及心率測定：分別于造模前，給藥第1、2、3、4、5、6周末進行收縮壓及心率測定。測量時，選擇安靜、溫暖、避風場所，先將清醒大鼠于昏暗、溫暖的保溫筒（39 ℃）中進行穩定，待智能無創血壓計BP-2010A顯示脈波平穩后進行測量，每只大鼠重復測量5次，記錄平均值。

血清生化指標水平測定：給藥6周末，目內眥采血1.5 ml加入分離膠促凝管，靜置30 min，3500 r/min（r=15.7 cm）離心10 min分離血清，收集上清液，全自動生化分析儀檢測血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、血肌酐及尿素氮水平。

腦內兒茶酚胺水平測定：給藥6周末，完成大鼠收縮壓及心率測定后，每組隨機選取3只觀察停藥后大鼠血壓變化情況，其余大鼠禁食不禁水，12 h后采用1.5%三溴乙醇（0.008 mg/g）腹腔注射麻醉大鼠，斷頭處死，迅速在冰臺上剝離海馬及紋狀體，分別稱重，按比例加入預冷的PBS溶液，玻璃勻漿器冰上勻漿，4 ℃ 5000 r/min（r=15.7 cm）離心15 min，取上清液，根據酶聯免疫試劑盒操作步驟檢測海馬去甲腎上腺素及紋狀體多巴胺含量。

統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件進行統計分析，實驗數據用均數±標準差表示，兩樣本計量資料進行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，不同時間點重復測量數據進行重復測量的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一般情況 對照組大鼠精神活潑，反應靈敏，體重逐日增加，活動量及食量正常；與對照組相比，實驗組大鼠蜷縮少動，活動量相對減少，給藥1周后體重開始下降，多數大鼠于第3周體重達最低值，隨后逐漸恢復呈增長趨勢。給藥5周后，除0.160 mg/kg組大鼠體重顯著低于對照組外（P=0.006），其余4組大鼠體重與對照組比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）（圖1）。

收縮壓 給藥前各組大鼠收縮壓基線一致，組間比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。重復測量的方差分析顯示，灌胃不同濃度利血平大鼠收縮壓差異有統計學意義（F=28.492，P＜0.001），與對照組比較，不同濃度利血平均可顯著降低大鼠收縮壓水平（P均＜0.001），且收縮壓下降幅度隨藥物濃度的增高而增加，呈現一定的劑量依賴趨勢（F=27.022，P＜0.001）。給藥時長亦對大鼠收縮壓產生影響（F=24.994，P＜0.001），多數大鼠于第1周收縮壓達最低值，隨后稍有回升，給藥3周后開始趨于穩定。給藥濃度與時長存在交互效應，隨給藥時間延長，不同濃度利血平收縮壓變化差異有統計學意義（F=4.892，P＜0.001）。其中0.016 mg/kg濃度組大鼠收縮壓水平自灌胃第5周開始與對照組比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）；0.032、0.064、0.128、0.160 mg/kg濃度組各時間點大鼠收縮壓水平均顯著低于對照組（P均＜0.001），但4種濃度利血平組間比較差異無統計學意義（P=0.204）（圖2）。

心率 給藥后不同時間大鼠心率差異有統計學意義（F=9.276，P＜0.001），但相同時間不同組間心率差異無統計學意義（F=0.922，P=0.475），各組間大鼠心率隨時間的變化差異無統計學意義（F=0.934，P=0.570），均呈現先增快后減慢的變化特點，多于給藥后1～2周達最高值，隨后下降（圖3）。

腦內兒茶酚胺水平 不同組間大鼠海馬去甲腎上腺素含量差異有統計學意義（F=7.789，P＜0.001），與對照組比較，不同濃度利血平大鼠海馬去甲腎上腺素含量均顯著減少（P均＜0.001），但不同濃度利血平組間比較差異無統計學意義（P=0.343）；不同組間大鼠紋狀體多巴胺水平差異有統計學意義（F=6.170，P=0.001），與對照組比較，0.128、0.160 mg/kg濃度組大鼠腦內多巴胺水平顯著降低（P=0.045，P=0.042），但不同濃度利血平組間比較差異無統計學意義（P=0.301）（圖4）。

安全性評價

大鼠死亡率：至6周末，60只大鼠共計死亡7只，分別為0.064 mg/kg濃度組1只、0.128 mg/kg濃度組2只、0.160 mg/kg濃度組4只。死亡大鼠均明顯消瘦，死亡時體重144.50～167.00 g。

大鼠血清生化指標變化：不同濃度利血平組大鼠血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶及尿素氮水平隨利血平濃度增高呈增長趨勢，其中0.160 mg/kg濃度組乳酸脫氫酶（P=0.001）、肌酸激酶同工酶（P=0.020）、谷草轉氨酶（P=0.007）及尿素氮（P=0.001）水平與對照組比較差異有統計學意義（表1）。

停藥后血壓恢復情況 停藥后大鼠收縮壓開始回升，停藥后1周各組大鼠收縮壓與自身基線水平相比差異無統計學意義（P=0.389），隨后趨于穩定（圖5）。

討論

低血壓病是多因素引發的臨床疾病，與已廣泛研究的高血壓不同，現代醫學對低血壓病理機制的認識較少。1995年，楊為國等^［12］采用3項緊張刺激方法進行測試，顯示原發性低血壓病患者植物交感系統興奮性減弱，副交感神經興奮性相對增強；2012年，Covassin等^［13］進一步選取相對無外界干擾的睡眠狀態，評估原發性低血壓病患者與正常血壓者的心血管自主神經活動，再次證實低血壓患者存在交感神經張力降低合并副交感神經興奮性增強的病理特征。

利血平是從蘿芙木屬植物蛇根木中提取的生物堿，作為一種有效的單胺囊泡轉運蛋白抑制劑，可通過影響交感神經末梢中兒茶酚胺類物質攝取進入囊泡而致使其被單胺氧化酶降解，耗竭去甲腎上腺素的貯存以妨礙交感神經沖動的傳遞，從而使血管舒張、血壓下降，常被用作有效的降壓藥物使用^［14］。同時，利血平可透過血腦屏障，故臨床長期應用利血平患者常出現嗜睡、抑郁和運動障礙等不良反應。鑒于此，有研究將利血平用于嚙齒類動物抑郁癥及帕金森模型的構建，但區別于灌胃利血平誘導的低血壓模型，多采用腹腔或尾靜脈注射，且給藥劑量更大^［15-18］。此外，利血平還被廣泛應用于中醫脾虛證的建模^［19］。王璇^［20］梳理了近30年中醫藥治療低血壓病的相關文獻，結果顯示低血壓病病機以氣虛為主，核心病位在脾。利血平誘導的慢性低血壓模型與低血壓病患者的發病特點及臨床特征高度契合，適宜藥效的評價研究及機制探討。

本研究顯示灌胃不同濃度利血平均可導致大鼠收縮壓降低，且不同濃度利血平對大鼠收縮壓的影響程度不同，存在一定的量效關系，即一定濃度范圍內增加利血平濃度可導致大鼠收縮壓相應減低。不同濃度利血平組大鼠收縮壓多于給藥1周后達最低值，隨后稍有回升，并于給藥后3周開始趨于穩定。其中0.016 mg/kg組大鼠收縮壓水平自灌胃第5周開始與對照組比較差異無統計學意義，予以排除。0.032、0.064、0.128、0.160 mg/kg 組各時間點大鼠收縮壓水平均顯著低于對照組，但4種濃度利血平組間比較差異無統計學意義，即降壓效果不再隨利血平濃度的增加而增強，隨著交感神經末梢兒茶酚胺類物質的耗竭，利血平已達最大降壓效應^［21］。同時，隨著利血平濃度的增加，大鼠血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶及尿素氮等心、腎毒性指標逐漸升高，0.064、0.128與0.160 mg/kg組大鼠開始出現死亡，死亡率分別為10%、20%與40%，藥物過量使用的毒性逐漸顯現。本研究提示灌胃利血平0.032 mg/kg可成功誘導大鼠形成穩定的低血壓狀態，安全性良好，易化性較高，相較于結扎腹主動脈法，與人體低血壓發病機制及臨床表現的相似程度更高；相較于失血性模型所造成的整體低血壓狀態，操作簡單且易于控制，對模型大鼠的傷害較小，穩定性及可重復性高，是適宜藥效評價的理想模型。

利血平灌胃后大鼠心率較給藥前明顯增快，給藥1周后達最高值，隨后緩慢下降。分析可能原因，用藥第1周大鼠收縮壓顯著降低，外周灌注不足，體內壓力感受器激活，生理反饋被啟動，機體通過提升心率的方式增加心輸出量，以代償性維持有效循環血量^［22］；1周后大鼠血壓輕度上升逐漸趨于穩態，生理反饋伴隨減弱，利血平對交感神經的抑制作用逐漸顯現，大鼠心率減慢。

綜上，利血平灌胃可成功誘導大鼠低血壓模型，其中利血平0.032 mg/kg、每日2次灌胃、連續3周為利血平誘導大鼠低血壓模型的適宜條件，成模后仍需持續給藥以維持大鼠穩定的低血壓狀態。

參 考 文 獻

［1］陳灝珠.心臟病學—心血管內科學［M］.北京：人民衛生出版社，2016.

［2］Afari N，Buchwald D.Chronic fatigue syndrome：a review［J］.Am J Psychiatry，2003，160（2）：221-236.DOI：10.1176/appi.ajp.160.2.221.

［3］Barrett-Connor E，Palinkas LA.Low blood pressure and depression in older men：a population based study［J］.BMJ，1994，308（6926）：446-449.DOI：10.1136/bmj.308.6926.446.

［4］Duschek S，Schandry R.Reduced brain perfusion and cognitive performance due to constitutional hypotension［J］.Clin Auton Res，2007，17（2）：69-76.DOI：10.1007/s10286-006-0379-7.

［5］羅德，陳少雄.七味平衡升壓湯聯合西藥治療原發性低血壓病的療效觀察［J］.中國民族民間醫藥，2018，27（13）：86-88.

［6］朱林章.維生素B1、甲鈷胺聯合參松養心膠囊治療原發性低血壓病的探討［J］.中國醫學創新，2009，6（36）：53.DOI：10.3969/j.issn.1674-4985.2009.36.032.

［7］呂耀成.七味平衡升壓湯聯合鹽酸米多君篇治療原發性低血壓病41例［J］.中醫研究，2019，32（8）：25-28.DOI：10.3969/j.issn.1001-6910.2019.08.11.

［8］Liu SQ，Fung YC.Relationship between hypertension，hypertrophy，and opening angle of zero-stress state of arteries following aortic constriction［J］.J Biomech Eng，1989，111（4）：325-335.DOI：10.1115/1.3168386.

［9］秦彩玲，劉婷，張毅，等.桂枝湯對大鼠血壓雙向調節作用及其有效部位探討［J］.中國實驗方劑學雜志，2001，7（4）：20-23.DOI：CNKI：SUN：ZSFX.0.2001-04-009.

［10］楊路，吳春曉，陳瑩，等.針刺手三陰經原穴對高、低血壓模型大鼠經穴特異性的影響［J］.廣州中醫藥大學學報，2016，33（3）：334-338.DOI：10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.03.013.

［11］田原.人參超微粉及水提物對大鼠實驗性低血壓的升壓作用研究［D］.吉林：吉林大學，2018.

［12］楊國為，周巖，林紅華.原發性低血壓病緊張刺激研究分析［J］.福建醫藥雜志，1995，17（6）：66.

［13］Covassin N，De Zambotti M，Cellini N，et al.Nocturnal cardiovascular activity in essential hypotension：evidence of differential autonomic regulation［J］.Psychosom Med，2012，74（9）：952-960.DOI：10.1097/PSY.0b013e318272db69.

［14］中老年醫學會高血壓分會，中華醫學會心血管病學分會，中國醫師協會高血壓專業委員會，等.復方利血平氨苯蝶啶片（0號）臨床應用中國專家共識2021版［J］.中華老年多器官疾病雜志，2021，20（9）：5.DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2021.05.005.

［15］Willner P.The validity of animal models of depression［J］.Psychopharmacology，1984，83（1）：1-16.DOI：10.1007/BF00427414.

［16］Carlsson A，Lindqvist M，Magnusson T.3，4-dihydroxypheylalanine and 5-hydroxy-tryptophan as reserpine antagonitst［J］.Nature，1957，180（4596）：1200.DOI：10.1038/1801200a0.

［17］高雪松，王永志，李麗，等.利血平致抑郁樣嚙齒類動物模型的研究進展［J］.實驗動物學，2017，34（2）：57-60.

［18］Ahmed-Farid OA，Taha M，Bakeer RM，et al.Effects of bee venom and dopamine-loaded nanoparticles on reserpine-induced parkinsons disease rat model［J］.Sci Rep，2021，11（1）：21141.DOI：10.1038/s41598-021-00764-y.

［19］李亞歡，張冬梅，王淑艷，等.脾虛證動物模型研制概況［J］.中醫藥導報，2019，25（1）：100-102.

［20］王璇.低血壓癥的中醫證候-方藥分布特點及臨床觀察［D］.濟南：山東中醫藥大學，2015.

［21］李艷芳，師樹田.受體激動劑與阻滯劑在心血管病的臨床應用［M］.北京：人民軍醫出版社，2014.

［22］王庭槐.生理學［M］.北京：人民衛生出版社，2018.

（收稿日期：2022-11-08）