基于SNP和InDel 標記的余甘子群體遺傳分析

普天磊 金杰 何璐 瞿文林 廖承飛 袁建民 羅會英 趙瓊玲

摘要：【目的】采用高通量測序技術解析余甘子種質資源的群體遺傳結構和遺傳多樣性，為余甘子系統分類、遺傳資源創新利用提供理論基礎。【方法】利用ddRADseq 技術對112 份余甘子種質資源進行高通量簡化基因組測序，利用Cutadapt 和Trimmomatic 軟件對原始數據進行過濾，篩選得到高質量測序數據；使用MUNEAK軟件進行多態性標記發掘，基于獲得的SNP和InDel 標記，進行群體結構分析、主成分分析、系統發育分析及遺傳多樣性分析。【結果】余甘子測序樣品共獲得8934 個SNP 和InDel 標記，群體結構分析將余甘子種質分為2 個類群，類群劃分與種質來源地相關，該結果與主成分分析和系統發育分析相一致。余甘子各種質間遺傳距離為0.027～0.459，平均遺傳距離為0.248；云南地區的余甘子種質的期望雜合度、觀測雜合度及多態性信息含量值最高，依次為0.267、0.184 及0.218；余甘子群體間的Fst 在0.080～0.266 之間，群體遺傳分化程度中等偏高。【結論】該測序技術可有效地解析余甘子種質的群體結構和遺傳多樣性，為余甘子種質資源的鑒定評價、系統分類及遺傳多樣性研究提供參考。

關鍵詞：余甘子；SNP；InDel；群體結構；遺傳多樣性

中圖分類號：S667.5 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）05-0875-09

余甘子（Phyllanthus emblica L.）為大戟科葉下珠屬植物，果實、根、莖和葉都可入藥[1]。余甘子含有酚酸類、鞣質類、黃酮類及萜烯類等化合物，具有較好的抗氧化、保肝、抗腫瘤和抗病毒等藥理作用[2-4]。目前已知余甘子與35 種民族民間臨床治療功效有關，有17 個國家和民族在使用余甘子，并在中國的中藥、傣藥、壯藥、藏藥中廣泛應用[5-7]。除藥用功能顯著外，余甘子還因其富含維生素等營養物質及特殊的回甘風味，成為廣受群眾喜愛的特優稀水果[8]。此外，余甘子植株耐貧瘠，固土能力強，具有良好的生態功能，成為山區植被修復及水土保持等生態治理的優選物種[9]。

近年來隨著余甘子藥用價值、營養價值、生物及地理研究的深入，優良品種的選育與改良越來越受到關注。然而，中國余甘子目前無栽培種，基本處于野生狀態，各地區種質雖多，但缺乏系統的整理和發掘，種質的遺傳背景并不十分清晰。已有學者基于葉形、雄花性狀、果形等表型性狀對余甘子種質資源的遺傳多樣性進行研究[10-11]，但植物的表型性狀是由基因和環境共同調控的，并不能準確地反映余甘子群體的遺傳多樣性水平。邵雪花等[12]利用ISSR 分子標記技術分析28 份余甘子種質的遺傳多樣性，并構建了指紋圖譜。郭林榕等[13]研究表明SRAP分子標記技術可有效運用于南方濕潤分布區的22 份余甘子種質資源的遺傳多樣性分析。蔡英卿等[14]利用RAPD 分子標記技術將34 份福建省余甘子種質分為惠安余甘和莆田余甘兩類。

SNP 和InDel 是指基因組上單核酸的插入、替換、缺失引起的核酸序列多態性，與其他種類的分子遺傳標記相比，能更好地代表余甘子全基因組的遺傳信息，具有分布范圍廣、密度高、穩定性好、結果準確、容易實現檢測自動化和規模化的優點[15-16]。近年來，隨著測序技術的快速發展，SNP和InDel 分子標記已廣泛應用于非模式生物的群體遺傳結構分析、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、數量性狀相關性分析等領域[17-20]。然而，目前并沒有基于SNP 和InDel標記對余甘子群體遺傳結構和遺傳多樣性進行分析的報道。

簡化基因組測序技術可為種群遺傳學研究提供更為豐富而準確的數據，其中，限制性酶切位點關聯DNA 測序技術（restriction- site associated DNA sequencing，RADseq）是簡化基因組測序技術中發展較快、應用較廣的測序技術，根據不同試驗需求，該技術已有ddRAD、mbRAD、ezRAD、GBS 等多種版本[21-22]。ddRADseq 技術具有通量高、成本低、試驗時間短及無需參考基因組等優點[23]，已用于馬鈴薯、水稻螟蟲等多物種的種質鑒定、系統發育和遺傳進化及性狀關聯分析研究[24-25]。目前余甘子參考基因組并未發布，筆者在本研究中擬采用ddRADseq 技術對112 份余甘子樣品進行高通量簡化基因組測序，開發SNP和InDel 分子標記，分析余甘子種質的遺傳多樣性及群體遺傳結構，探討不同種質的系統演化關系，為后續余甘子育種親本選配、優良品系篩選提供材料和理論指導。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料均取自云南省農業科學院熱區生態農業研究所余甘子種質資源保護云南創新基地，共有112 份余甘子種質材料，供試名稱見表1，其中，1～3號FJ 種質自福建引種，4～12 號GJ 種質自廣西引種，13～23 號JY種質自廣東引種，24 號CL（西印度醋栗）種質為近緣種，25～112 號YGZ 種質從云南省內引種。采集各供試材料健康葉片，于-4 ℃保存備用。

1.2 余甘子基因組DNA提取及建庫測序

采用改良的CTAB法提取余甘子葉片的基因組DNA，分別用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop ND-1000 對DNA樣品純度和濃度進行檢測，調節樣品質量濃度至100 ng · μL-1，-20 ℃保存。采用限制性內切酶SacⅠ和MseⅠ對基因組DNA進行酶切，再用測序接頭與酶切片段進行連接，連接片段純化后，選擇插入長度在300～400 bp 范圍內的片段進行擴增，并使用Illumina Hiseq 測序，原始測序讀長為Pairedend150 bp。

1.3 SNP和InDel 分子標記開發

采用Cutadapt 和Trimmomatic 軟件對原始測序數據進行數據質控，統計測序得到的reads 數目。使用不依賴參考基因組進行變異發掘的MUNEAK軟件進行SNP和InDel 多態性標記的發掘以及各樣品基因型的分析。

1.4 余甘子群體結構分析

基于篩選的多態性標記，使用STRUCTURE軟件對所有樣品進行聚類分析，設定類群數K為1～6，計算ΔK值，ΔK值最大對應的K值即為最合理類群數。運用STRUCTURE 軟件分析每個余甘子樣品歸屬各類群比率，確定各種質歸屬的類群。

利用Plink 軟件對各樣品進行主成分分析，使用R 軟件計算各主成分向量，繪制主成分分析散點圖。采用MEGA 7 軟件計算參試材料的遺傳距離，使用iTOL（https：//itol.embl.de/）繪制進化樹圖。

1.5 余甘子群體遺傳多樣性分析

基于獲得的SNP、InDel 標記和群體來源地信息，利用PowerMarker 軟件計算余甘子群體的期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）、多態性信息含量（PIC）以及群體分化指數（Fst），以評估余甘子群體的遺傳多樣性。

2 結果與分析

2.1 建庫和測序質量評估

通過對所有余甘子樣品進行建庫和測序后，總共得到64.70 Gb 數據，共獲得233 960 457 條reads，讀長數目在288 386～7 202 919 bp 之間，平均讀長為2 088 933 bp；測序Q30 值在97.46%～98.40%之間，平均Q30 為97.96%，所有樣品Q30 值均在95%以上；測序GC 值在36.25%～38.68%之間，平均GC 為37.30%，測序數據質量符合預期，可用于后續分析。

2.2 SNP和InDel 分子標記開發

采用MUNEAK 軟件，對余甘子樣品根據缺失基因型的比例≤0.5、較小等位基因頻率≥0.05 進行過濾，共得到4019 個ddRADseq 測序位點和8934 個SNP和InDel標記，用于后續群體結構分析。

2.3 基于SNP和InDel 標記的余甘子群體遺傳結構分析

基于112 份余甘子樣品開發的SNP 和InDel 標記（CL樣品由于基因型數據缺失過多，在后續的分析中去掉），運用STRUCTURE 軟件進行群體結構的分析，通過設置K=1～7，得到如圖1 的ΔK隨K值變化的趨勢圖。從圖1 中可以看出，ΔK值最大對應的K值為2，余甘子群體的最佳亞群數為2，表明來自不同地區的余甘子種質可能來自于2 個祖先。

當K=2 時，STRUCTURE 輸出每個樣品組分比例數據，基于Q值，筆者將每個樣品分配到各個亞群，如圖2 所示。類群1 顯示為紅色，共有88 份樣品，這些種質均來自于云南；其中，61 份樣品的Q值為1，這61 份樣品代表類群1 的基因庫。類群2 在圖中顯示為藍色，有23 份樣品，分別引種自福建、廣西和廣東地區；類群2 共20 份樣品的Q值為1，這20 份樣品代表類群2 的基因庫，其中，GJ1 和GJ6 這兩個種質屬于類群2，對應Q值分別為0.59 和0.58，說明這兩個種質從廣西、廣東和福建引種后，在種質選育馴化的過程中，與云南的種質產生基因交流，具有混合的遺傳背景。

為了驗證群體結構分析結果的可靠性，基于所有參試樣品的高質量SNP和InDel 標記，采用主成分分析法對上述標記進行降維處理，繪制了主成分分析圖（圖3），圖中樣品點距離越近，表示樣品間遺傳背景差距越小。由圖3 可知，第一特征向量PC1 和第二特征向量PC2 將余甘子樣品分為2 個類群，該結果與群體結構分析結果一致。其中，類群1 在PC1 軸上分布較為集中，類群2 較為分散，說明類群2 樣品間遺傳背景較類群1 差異大。

2.4 基于SNP和InDel 標記的余甘子群體系統發育分析

基于余甘子樣品的SNP 和InDel 標記構建的系統發育樹如圖4 所示。由圖4 可知，所有余甘子種質分為2 個類群，來源于云南的88 份YGZ種質歸屬于類群1，來源于福建、廣西和廣東的FJ、JY 和GY等23 份種質歸屬于類群2，種質聚類結果與群體結構、主成分分析相一致，各個類群能較好地聚在一起。其中，類群1 樣品距離進化樹圓心較近且緊密的聚類在一起，說明類群1 個體親緣關系較近；類群2 的23 個樣品聚在一起，距離進化樹圓心的距離較遠，表明該類群個體在進化上積累了更多的遺傳差異。余甘子各種質間平均遺傳距離為0.248，其中，YGZ179 種質和YGZ180-3 種質遺傳距離值最小，為0.027，表明這兩個種質的親緣關系較近，種質間相似程度比較高；JY1 種質和YGZ401-1 種質遺傳距離值最大，為0.459，表明它們親緣關系最遠，遺傳信息差異大。

2.5 余甘子群體遺傳多樣性分析

從上述余甘子群體結構分析可知，余甘子群體結構劃分與地理來源地密切相關，為了解余甘子群體的遺傳多樣性水平，對不同來源地余甘子種質的雜合度、PIC 和Fst 進行分析。雜合度和PIC 值可反映余甘子群體的遺傳變異程度，它們的值越大，表示遺傳變異越大，則群體的遺傳多樣性越豐富，其中雜合度包括期望雜合度（He）和觀測雜合度（Ho）。當Fst 為0 或1 時，表明群體間沒有分化或完全分化；0＜Fst＜0.05 時，表明群體間遺傳分化較弱；0.05≤Fst＜0.15 時，群體遺傳分化中等；0.15≤Fst＜0.25 或0.25≤Fst＜1 時，表明群體間具有較強或非常強的遺傳分化[26]。

余甘子群體的遺傳多樣性參數和遺傳分化系數結果見表2 和表3。由表2 可知，余甘子群體的He值在0.094～0.267 之間，平均值為0.17；Ho 值為0.071～0.184，平均值為0.113；PIC值在0.095～0.218 之間，平均值為0.143。其中，來源于云南的YGZ 種質雜合度和PIC 值最大，表現出最多的遺傳變異，其次依次為廣東引種的JY 種質和廣西引種的GJ 種質，福建引種的FJ 種質He、Ho 及PIC 值最小，分別為0.094、0.071 及0.095。由表3 可知，余甘子群體間的遺傳分化指數在0.080～0.266 之間，表現為中等偏強的遺傳分化。其中，YGZ和其余種質間均為中等分化，親緣關系相對近；JY 種質和GJ 種質間Fst 為0.231，遺傳分化比較強，親緣關系遠；JY種質和FJ 種質Fst 間為0.136，屬于中等遺傳分化；GJ 種質和FJ 種質間Fst 最大，為0.266，遺傳分化非常強，親緣關系較遠。

3 討論

ddRADseq 測序技術是基于全基因組酶切位點的高通量簡化基因組測序技術，該技術無需參考基因組，采用的SacⅠ和MseⅠ兩種限制性內切酶目的性較強，減少了早期RAD文庫在物理打斷及片段選擇等制備過程中造成的DNA損失，簡化RAD文庫制備過程，降低待測基因組復雜度[27-28]。筆者在本試驗中采用該測序技術對112 份余甘子樣品進行建庫測序，共得到64.70 Gb 數據，開發了8934 個SNP 和InDel 標記，可達到余甘子種質資源群體結構和遺傳多樣性分析的目的。其中，余甘子近緣種CL 種質由于標記缺失過多，在群體和系統發育分析中被去掉，這應該是由本試驗中采用的標記是根據序列相似性進行聚類，然而該種質和其余種質基因型差異大，沒與其余種質的序列聚到一起所導致的。

全面了解種質資源的遺傳結構是有效保護和高效利用的前提，其中群體結構是遺傳結構的核心。不同地理來源的余甘子種質由于地理和環境等因素的影響，會出現遺傳信息差異，不同地理來源地種質的遺傳信息分析是遺傳學分析的重要內容。王建超等[29]研究表明余甘子存在明顯的地域分布規律，生境相似、來源相近的種質資源親緣關系較近；熊儀俊[30]也認為余甘子遺傳距離與空間距離有一定相關性。筆者在本研究中利用3 種群體結構分析方法將所有參試余甘子樣品分為兩個類群，其中，類群1 有88 份樣品，為云南收集的種質，類群2 為有23 份樣品，為從福建、廣東、廣西收集的種質，表明余甘子分子水平的群體聚類結果與地理來源地相關，地理區域近的種質遺傳距離較為接近。類群2 部分種質具有混合的遺傳背景，且福建、廣東、廣西3 個引種地的種質并未劃分開，該結果可能與3 個引種地的地理距離較近，種質間基因交流較為頻繁有關。此外，類群1 的YGZ179 和YGZ180-3 種質遺傳距離值最小，加之兩者收集時間和地點相近，推測可能為同一材料。同時，類群1 的云南種質遺傳多樣性較高，可作為種質創新利用的備選材料。近年來，筆者在云南種質的基礎上已成功選育出果型大的鮮食余甘子品種盈玉，并在生產中大面積推廣應用。

筆者計算并統計了余甘子群體的He、Ho、PIC以及Fst 值，以評估余甘子群體的遺傳多樣性，參試樣品中，來源于云南的YGZ種質雜合度和PIC 值最大，表現出最多的遺傳變異。李巧明等[31]采用ISSR分子標記技術檢測云南干熱河谷區的4 個余甘子居群的遺傳多樣性，也認為云南余甘子居群具有較高的遺傳多樣水平。前人研究表明，云南余甘子居群間遺傳分化系數為0.122[31]，熊儀俊[30]基于RAPD技術的研究結果表明64 份余甘子種群地理分化明顯，種群間遺傳分化較強。筆者在本文中發現歸屬于類群2 的FJ、GJ、JY 群體較類群1 的YGZ 群體遺傳分化強，表現為整體中等偏強，這與主成分分析和系統發育分析一致，即類群2 的個體分布更為離散，其中，來源于廣西的種質與來源于福建的種質間Fst 為0.266，遺傳分化非常強，后期可加大福建、廣西、廣東等地種質收集力度，豐富余甘子群體的遺傳多樣性。筆者在本文中解析了112 份余甘子種質的群體結構和遺傳多樣性，為后續余甘子遺傳圖譜構建、分子標記開發、系統發育研究、品種選育及產業開發利用提供理論依據。

4 結論

筆者在本文中基于高通量測序技術開發的8934 個SNP 和InDel 標記解析112 份余甘子種質的群體結構和遺傳多樣性。群體結構分析、主成分分析及系統發育分析將余甘子群體分為2 個類群，其中，類群1 有88 份樣品，主要為從云南收集的種質，類群2 為有23 份樣品，為從福建、廣東、廣西收集的種質，3 種分析方法相互補充印證，表明余甘子群體結構劃分可靠。遺傳多樣性分析結果表明，余甘子群體He 平均值為0.17，Ho平均值為0.113，PIC 平均值為0.143，群體間的Fst 在0.080～0.266 之間，群體遺傳分化整體中等偏強。遺傳距離分析顯示，余甘子群體遺傳距離在0.027～0.459 之間，平均遺傳距離為0.248。本研究可為后續余甘子優良基因挖掘、優良種質引進及創新利用提供參考依據。

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