紫花地丁輻照前、后鎮(zhèn)痛、抗炎及抗菌活性對比研究

顏宏 柴琇瑛 趙道強 郭琰 李婷 鐘承志 吳德松

摘要：目的 對紫花地丁輻照前、后樣品的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌活性和安全性進行對比研究。方法 采用最大給藥量法測定輻照前、后樣品小鼠灌胃給藥的急性毒性；采用醋酸致小鼠疼痛模型、二甲苯致小鼠耳腫模型和最小抑菌濃度（MIC）值測定實驗，對比紫花地丁輻照前、后樣品的藥效學(xué)活性。結(jié)果 小鼠急性毒性實驗結(jié)果顯示：紫花地丁輻照前、后樣品小鼠灌胃給藥最大給藥量為24 g/kg，小鼠灌胃后的毒性反應(yīng)主要為腹瀉癥狀，于給藥后第2日恢復(fù)正常，二者在安全性方面無明顯差異。藥效學(xué)研究結(jié)果顯示：紫花地丁輻照前、后樣品均可顯著降低醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)、抑制二甲苯致小鼠耳腫，并在體外對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和肺炎鏈球菌均具有一定的抑制作用，且輻照前、后樣品抑制作用一致，最小抑菌濃度MIC值分別為2.5、2.5、1.25、1.25 mg/mL。從藥效活性來看，二者無明顯差異。結(jié)論 紫花地丁輻照前、后樣品在安全性和藥效學(xué)活性方面均無明顯差異，初步表明輻照滅菌法可用于該藥材的滅菌。

關(guān)鍵詞：紫花地丁；輻照滅菌；急性毒性試驗；安全性；抗炎；鎮(zhèn)痛；抗菌

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2023）09-0001-03

輻照滅菌技術(shù)利用電離輻射（主要指60Co-γ射線、加速器產(chǎn)生高能電子束或轉(zhuǎn)換成的X射線）與物質(zhì)相互作用產(chǎn)生的物理、化學(xué)和生物效應(yīng)，抑制微生物遺傳物質(zhì)合成，從而達(dá)到滅菌效果［1］。它是一種新型、高效的滅菌方法，尤其是對揮發(fā)性、熱敏性中藥，表現(xiàn)出了優(yōu)越性，已成為傳統(tǒng)中藥滅菌的重要補充方法［2］。它的特點是穿透力強，可有效避免藥品或藥材在使用之前的二次污染；可在常溫下進行，不會明顯升高被輻照物的溫度，是熱敏藥物的最佳滅菌方法［3］；同時，輻照滅菌操作簡便、速度快，輻照后可立即使用，無需靜置或冷卻，可實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。[KG）]

紫花地丁（Viola yedoensis）是堇菜科多年生草本植物，性寒味苦，在民間有著悠久的用藥歷史，在中國傳統(tǒng)醫(yī)用上，紫花地丁主要以全草入藥，主要用于抗菌消炎、清熱解毒和涼血消腫，同時外用治療濕疹、瘙癢和粉刺等皮膚病。現(xiàn)代醫(yī)用上發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗病毒、抗炎、抑菌和抗腫瘤活性，臨床上多用于治療疔瘡腫毒、尿路感染、蜂窩組織炎、乳腺炎和咽炎等，外用治療癰腫、跌打損傷和毒蛇咬傷等。由此可見，紫花地丁有著很高的開發(fā)價值［1］。為了滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需要，我們將紫花地丁的滅菌方式改為輻照滅菌，但是對于不同的藥材，其最佳的輻照劑量不同，輻照劑量過大會引起個別中藥化學(xué)成分、生物活性的變化。參照《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)規(guī)定和紫花地丁的臨床應(yīng)用［4，5］，我們對紫花地丁輻照前后樣品的安全性、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌活性進行了初步評價，為其工藝改進提供實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 受試樣品 紫花地丁干燥全草，由云南白藥集團中藥資源事業(yè)部提供，批號：2018120503-1。樣品制備方法：取紫花地丁干燥全草，粉碎后過150目篩，過篩率67.13%，灰綠色粉末，批號：YC2421301，為紫花地丁（輻照前）樣品。取紫花地丁干燥全草，經(jīng)60Co輻照滅菌（輻照劑量為20 kGy），粉碎后過150目篩，過篩濾66.77%，灰綠色粉末，批號：YC2421301，為紫花地丁（輻照后）樣品。兩樣品均由云南省藥物研究所天然藥物化學(xué)研究室提供，常溫、密封、干燥保存。

1.2 菌株 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC29213，批號：010123；大腸埃希菌Escherichia coli ATCC25922，批號：010888；白色念珠菌Candida albicans ATCC10231，批號：016783；肺炎鏈球菌Streprococcus neumonia ATCC49619，批號：010123，均購自美國特種生物貯藏中心。

1.3 培養(yǎng)基 Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基配制：精確稱取酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，氫氧化鈉40.0 mg，溶于純水并用容量瓶定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后備用。MUELLER-HINTON BROTH（MH）液體培養(yǎng)基配制：精確稱取21.0 gMH粉末溶于純水并用容量瓶定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后備用。

1.4 實驗動物 SPF級KM小鼠，體質(zhì)量18～22 g，共156只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供；實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0004。本單位實驗動物使用許可證：SYXK（滇）K2017-0004，發(fā)證單位：昆明市科技局。實驗動物經(jīng)云南省藥物研究所實驗動物管理與使用委員會（IACUC）審查同意，動物倫理編號：動（倫）IACUC-2018-023-01。

1.5 主要儀器 JJ2000型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠生產(chǎn)；SQP型電子分析天平，賽多利斯（北京）科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo公司生產(chǎn)；THZ-D型臺式恒溫振蕩器，江蘇太倉實驗設(shè)備廠。

1.6 主要試劑 冰醋酸，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)，批號：1211011；二甲苯，重慶川東化工（集團）有限公司生產(chǎn)，批號：20140701；阿司匹林腸溶片，拜耳醫(yī)藥公司生產(chǎn)，BJ24851；注射用美羅培南，住友制藥（蘇州）有限公司，批號：2160c。

2 實驗方法

2.1 小鼠灌胃給藥急性毒性試驗 在開展小鼠急性毒性正式試驗前，首先摸索紫花地丁輻照前、后樣品可配制出的，且利于動物灌胃給藥的最大濃度（濃度過高可能堵塞灌胃針）。用電子天平精確稱取紫花地丁輻照前、后樣品各10.00 g于研缽中，加入少量純水充分研磨均勻，并將研磨后的混懸液移入量筒中；再用純水多次洗凈研缽，并將混懸液移入量筒中，最終體積約為50 mL，此時兩樣品的濃度為0.2 g/mL；在正式試驗時，小鼠以40 mL/kg給藥體積灌胃給藥，則給藥劑量為8 g/kg。

正式試驗時，參照文獻(xiàn)方法［6］，取SPF級KM小鼠60只，隨機分為空白組、紫花地丁（輻照前）24 g/kg（單次最大給藥劑量為8 g/kg，給藥3次）、紫花地丁（輻照后）24 g/kg劑量組（單次最大給藥劑量為8 g/kg，給藥3次），每組20只，雌雄各半。禁食不禁水6 h后，各組以40 mL/kg給藥體積灌胃給予相應(yīng)受試樣品，間隔4 h給藥1次，共給藥3次。給藥當(dāng)天觀察并記錄動物4 h內(nèi)出現(xiàn)的毒性反應(yīng)和死亡情況；以后每天觀察1次，連續(xù)14 d。主要觀察動物飲食、一般狀態(tài)、行為活動、排泄物等是否異常和死亡情況。在給藥前、給藥后第3、7和14 d對動物稱重并對體質(zhì)量進行統(tǒng)計學(xué)分析。觀察14 d后結(jié)束頸椎脫臼處死動物，解剖后肉眼觀察動物臟器、組織的體積、顏色、質(zhì)地等有無異常。

2.2 醋酸致小鼠疼痛 參照文獻(xiàn)方法［7］，取SPF級KM小鼠96只，全雄性，隨機分為溶媒對照組、阿司匹林0.4 g/kg組、紫花地丁（輻照前）0.5、1.0、2.0 g/kg劑量組，紫花地丁（輻照后）0.5、1.0、2.0 g/kg劑量組，每組12只。各組小鼠均以20 mL/kg的給藥體積灌胃給予相應(yīng)受試物，溶媒對照組給予等體積純水，每天一次，連續(xù)7 d，末次給藥后1 h，以10 mL/kg給藥體積腹腔注射0.62%冰醋酸，10 min后觀察小鼠在15 min內(nèi)的扭體反應(yīng)次數(shù)（以小鼠出現(xiàn)腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張，臀部抬起反應(yīng)為準(zhǔn)），并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.3 二甲苯致小鼠耳廓腫脹 參照文獻(xiàn)方法［8-9］，動物分組、劑量設(shè)定和給藥頻次均同2.2所述。末次給藥后1 h，各組小鼠在右耳兩面均勻涂抹二甲苯0.04 mL，左耳不涂抹作為對照。致炎后1 h脫頸椎處死小鼠，用眼科剪剪下小鼠雙耳，直徑6 mm的打孔器將雙耳同部位等面積切下，稱取耳片重量，以兩耳片重量之差作為腫脹度，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.4 體外對常見病原致病菌MIC值測定 參照文獻(xiàn)方法［10-11］，分別從菌落平板上挑取金黃色葡萄球菌ATCC29213單克隆接種于MH液體培養(yǎng)基中，挑取大腸埃希菌ATCC25922、白色念珠菌ATCC10231、肺炎鏈球菌ATCC49619單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；而后再分別接種于MH、LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。各菌活化后，將細(xì)菌濃度調(diào)整為1×105 CFU/mL，接種入96孔培養(yǎng)板中。第1孔內(nèi)加入190 μL菌液，第2～12孔內(nèi)均加入100 μL菌液。分別將受試樣品或美羅培南10 μL加入第1孔中，混勻后吸取100 μL菌液加入第2孔中，依次對倍稀釋，重復(fù)3次。同時，設(shè)立陽性對照、陰性對照、溶劑對照。其中，陽性對照僅加入相應(yīng)濃度菌液，陰性對照直接加入培養(yǎng)基，溶劑對照加入相應(yīng)濃度菌液和生理鹽水。培養(yǎng)板分別置于37 ℃養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)12 h，溶液清亮表示陰性（-），溶液混濁表示陽性（+）；讀出抑制細(xì)菌生長的最低樣品濃度（Minimal Inhibition Concentration，MIC）即為最小抑菌濃度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠急性毒性試驗 溶媒對照組所有動物給予純水后一般狀況良好，均未見明顯異常反應(yīng)和死亡情況。小鼠灌胃給予紫花地丁輻照前、后樣品后，在4 h內(nèi)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，其中紫花地丁（輻照前）24 g/kg劑量組4只雌性小鼠和2只雄性小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，紫花地丁（輻照后）24 g/kg劑量組3只雌性小鼠和3只雄性小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，剩余動物均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的異常反應(yīng)。毒性反應(yīng)在給藥后第2日恢復(fù)正常。觀察期14 d內(nèi)，各組動物均未見明顯毒性反應(yīng)和死亡情況。觀察期結(jié)束后處死動物大體解剖觀察，各組動物組織和器官均未見明顯異常。結(jié)果顯示，各組小鼠在給藥后均未出現(xiàn)死亡，結(jié)果以最大給藥量表示。紫花地丁輻照前、后樣品小鼠24 h急性毒性試驗的最大給藥量均為24 g/kg（8 g/kg/次，共灌胃3次，間隔4 h），相當(dāng)于成人每日口服紫花地丁輻照前、后樣品184.62 g（按體表面積折算，成人體重以60 kg計算）。觀察期內(nèi)動物體質(zhì)量變化情況見表1。

3.2 對醋酸所致小鼠疼痛的影響 試驗結(jié)果顯示：與溶媒對照組比較，紫花地丁輻照前、后樣品2.0 g/kg劑量組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)明顯減少（P<0.01）。與紫花地丁（輻照前）樣品組比較，紫花地丁（輻照后）樣品組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)均無明顯變化（P>0.05），結(jié)果見表2。

3.3 二甲苯致小鼠耳廓腫脹 試驗結(jié)果顯示：與溶媒對照組比較，紫花地丁輻照前、輻照后樣品2.0 g/kg劑量組小鼠耳腫脹度明顯減輕（P<0.01）。與紫花地丁（輻照前）樣品組比較，紫花地丁（輻照后）樣品組小鼠耳腫脹度均無明顯變化（P>0.05），結(jié)果見表3。

3.4 對常見病原致病菌MIC值的測定 試驗結(jié)果顯示：紫花地丁輻照前、后樣品對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、肺炎鏈球菌均具有一定抗菌作用，且重復(fù)三次結(jié)果一致，其MIC值見表4。

4 小結(jié)

輻照滅菌技術(shù)已發(fā)展了近40年，在食品和醫(yī)療器械生產(chǎn)過程中廣泛應(yīng)用［12］，但輻照滅菌對中藥材化學(xué)成分、有效性和安全性所產(chǎn)生的影響尚不明確。由于缺乏相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及指導(dǎo)原則，輻照滅菌過程中存在超劑量輻照、重復(fù)輻照等問題，嚴(yán)重影響了藥品的質(zhì)量。已經(jīng)出現(xiàn)擅自改變產(chǎn)品滅菌工藝，而被CFDA收回藥品GMP證書的事件［13］。為解決這一問題，CFDA于2015年發(fā)布《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》，其中明確提出，輻照滅菌應(yīng)遵循“必要、科學(xué)、合理”的原則。任何單位或藥企采用輻照技術(shù)對中藥進行滅菌，必須通過研究來證明輻照滅菌對產(chǎn)品質(zhì)量、穩(wěn)定性和生物學(xué)性質(zhì)沒有影響，必要時采用與適應(yīng)證相關(guān)的藥效指標(biāo)，詳細(xì)闡述其必要性、科學(xué)性和合理性；對于含有不穩(wěn)定或有毒成分的中藥，更需進行針對性研究，關(guān)注其滅菌前后的變化情況，以保證藥品安全有效［14］。

基于上述規(guī)定，本研究結(jié)合紫花地丁的現(xiàn)代藥理學(xué)活性，對比了輻照前后紫花地丁樣品在初步安全性和鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌方面的活性。其中，急性毒性試驗結(jié)果表明，20 kGy輻照劑量照射紫花地丁后，樣品對小鼠的急性毒性未發(fā)生重大改變。有效性研究結(jié)果顯示：輻照前后紫花地丁均可明顯抑制醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)和二甲苯所致小鼠耳腫，均表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛抗炎活性；且輻照前后紫花地丁對4株常見菌株具有一定的抑制作用，輻照后紫花地丁的藥效學(xué)活性無顯著改變。綜上所述，在此輻照劑量對紫花地丁的安全性和有效性均無明顯改變，初步表明輻照滅菌法可用于該藥材的滅菌。

輻照滅菌對中藥材化學(xué)成分、有效性和安全性所產(chǎn)生的影響尚不明確，本實驗結(jié)果表明，紫花地丁輻照滅菌后，在有效性和安全性方面與輻照前沒有發(fā)生改變，因此在紫花地丁生產(chǎn)過程中，可用輻照滅菌法進行滅菌處理，而輻照滅菌對其化學(xué)成分有無影響，還需要進一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］宋妍.紫花地丁藥理作用的研究現(xiàn)狀［J］.CJCM中醫(yī)臨床研究，2017，9（12）：136-137.

［2］林彤，畢福鈞，呂渭升，等.中藥的輻照滅菌現(xiàn)狀與監(jiān)管［J］.中國藥學(xué)雜志，2019，54（17）：1443-1447.

［3］張世才，李奉勤，史冬霞，等.輻照滅菌在中藥方面的應(yīng)用研究進展［J］.中國藥業(yè)，2009，18（9）：76-77.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：337-338.

［5］陳蔚文，高學(xué)敏.中藥學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：93.

［6］陶榮品，姚文慧，丁選勝.淫羊藿苷不同給藥途徑對小鼠的急性毒性試驗研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2022，1（36）：22-25.

［7］費逸明，龔純貴.白英提取物鎮(zhèn)痛抗炎作用研究［J］.藥學(xué)實踐雜志，2009，27（2）：111-114.

［8］李艷麗，胡彥武.紫花地丁水提物急性毒性試驗及其抗炎鎮(zhèn)痛作用研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（2）：390-392.

［9］陳胡蘭，湯沛然，陳興，等.紫花地丁抗炎及體外抑菌作用活性部位篩選研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，31（2）：52-54.

［10］Li B，Yao Q，Pan XC，et al.Artesunate enhances the an-tibacterial effect of beta-lactam antibiotics against es-cherichia coli by increasing antibiotic accumulation via inhibition of the multidrug efflux pump system［J］.AcrAB-tolc.J Antimicrob Chemother，2011，66（4）：769-777.

［11］孫藝方，杜利利，周樂，等.紫花地丁抗菌活性成分研究［J］.中國中藥雜志，2011，36（19）：2666-2671.

［12］耿建暖.食品輻照技術(shù)及其在食品中的應(yīng)用［J］.江蘇調(diào)味副食品，2013，133（2）：29-32.

［13］段國華，梅星紅，徐衛(wèi)國.GMP飛行檢查案例分析與思考［J］.機電信息，2016，482（20）：1-8.

［14］白潔，遲玉明，金紅宇，等.《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》解讀［J］.中成藥，2017，39（7）：1537-1538.