STT3A和STT3B在上皮性卵巢癌中的表達及與預后的關(guān)系

孫崇鳳 楊萍 侯紀帥 趙鄒宇 于盼盼

1石河子大學第一附屬醫(yī)院婦科（新疆石河子 832008）；2國家衛(wèi)生健康委中亞高發(fā)病防治重點實驗室（新疆石河子 832008）

上皮性卵巢癌（EOC）是起源于卵巢或輸卵管上皮的惡性程度極高的腫瘤，占卵巢惡性腫瘤所有類型的85%以上［1］。EOC 的高增殖和高侵襲能力是患者預后差的主要原因之一［2］，研究EOC 的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制具有重要臨床意義，可為EOC 有效分子治療提供新的思路。N-連接糖基化（N-linked glycosylation）是蛋白質(zhì)翻譯過程中重要的修飾方式，其參與血管生成，免疫逃逸和耐受，腫瘤細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過程［3-4］。有研究［5-6］顯示，抑制N-糖基化過程，可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應及未折疊蛋白質(zhì)應答，從而激活相關(guān)蛋白促進卵巢癌細胞凋亡。寡糖轉(zhuǎn)移酶（OST）是這種N-糖基化過程的中心酶，催化定義明確的寡糖供體底物的轉(zhuǎn)移［7］。寡糖轉(zhuǎn)移酶復合物催化亞基STT3是哺乳動物中OST 復合物中主要的催化亞基，以STT3A 和STT3B 的形式存在［8］，研究表明，STT3A和STT3B 在部分實體腫瘤中高表達，且與患者預后密切相關(guān)。由此推測STT3A 和STT3B 在EOC 中亦可能存在差異表達，但目前國內(nèi)外關(guān)于STT3A和STT3B 與EOC 的研究較少，STT3A 和STT3B 在EOC 中的表達及與預后的相關(guān)性尚不明確。為此，本研究通過分析STT3A 和STT3B 在EOC 患者中的表達情況及其與患者臨床病理信息和預后的關(guān)系，為日后進一步研究STT3A和STT3B在EOC發(fā)生和發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)，亦為EOC 患者的靶向治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例資料選擇2010年10月至2019年12月在本院收治的88 例EOC 患者癌組織為觀察組，同期收集22 例非EOC（子宮肌瘤、子宮腺肌病或者卵巢良性腫瘤）患者正常的輸卵管上皮及卵巢組織作為對照組。因目前學說認為卵巢高級別漿液性癌起源于輸卵管上皮，故高級別EOC 組織的正常對照選擇正常輸卵管上皮；其他EOC 組織的正常對照為正常卵巢組織［9］。觀察組納入標準：（1）術(shù)后病理組織學檢查診斷為原發(fā)的EOC；（2）術(shù)前未接受過放化療。排除標準：（1）未進行手術(shù)的卵巢癌患者；（2）合并其他惡性腫瘤、免疫疾病；（3）術(shù)前接受過放療、化療或免疫治療。88 例EOC 患者基本臨床信息見表1。此項研究經(jīng)過石河子大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（編號：KJX-2021-111-02），所有參與人員皆簽署了《知情同意書》。

表1 88 例EOC 患者臨床病理資料Tab.1 The clinicopathological data of 88 EOC patients

1.1.2 細胞株及試劑EOC細胞系（SKOV3/A2780）和正常卵巢上皮細胞（IOSE-80）均購自北納生物公司細胞庫；McCoy's 5A 培養(yǎng)基購自中國博士德公司；胎牛血清購自美國Ominmabs 公司；胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司；STT3A（12034-I-AP），STT3B（15323-I-AP），SP 染色試劑盒，DAB 試劑盒，蘇木精染色劑，抗體均購自英國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色法（Immunohistochemistry，IHC）將EOC及正常對照的組織標本切片，依次在二甲苯中脫蠟，乙醇梯度脫水，雙蒸水水化，枸櫞酸溶液熱修復，冷卻后，經(jīng)過PBS 溶液沖洗切片（3 次），在室溫條件下，雙氧水封閉10 min，再使用PBS 溶液沖洗切片（3 次），滴加適量相應的一抗［STT3A（稀釋濃度為1∶400）；STT3B（稀釋濃度為1∶400）］，4 ℃過夜。次日早，切片在37 ℃烘箱或者室內(nèi)恢復至室溫，經(jīng)過PBS 溶液連續(xù)清洗切片（3 次），滴入濃度適當量的生物素標記的二抗，孵育30 min，PBS 溶液連續(xù)清洗切片（3 次），顯色液顯色延長20s，蘇木素復染，乙醇梯度脫水處理，中性樹膠封片。

1.2.2 結(jié)果評定所有結(jié)果均由2 位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師在普通光學顯微鏡下通過雙盲法對兩組切片染色情況按評分細則進行評分。染色范圍評分標準為：陽性細胞的比例評分為1=0～10%，2=10%～25%，3=50%～75%，4=75%～100%。染色強度評分為0=無染色，1=弱染色，2=中度染色，3=強染色。最終的IHC 評分為以上兩個評分的乘積。IHC評分 ≤ 6分，為低表達組；＞ 6 分為高表達組［10］。

1.2.3 患者術(shù)后隨訪所有EOC 患者一般在完成了初次手術(shù)治療之后即可開始進行隨訪，隨訪的方法：＜ 2年每隔3 個自然月1 次，2～5年每6 個月1 次，＞ 5年隨訪者應至少每1年1 次，臨床表現(xiàn)明顯異常的患者縮短隨訪間隔時間。

1.2.4 總蛋白的提取及Western blot 檢測收集SKOV-3、A2780、IOSE-80 細胞，用RIPA 和PMSF 提取各組蛋白，以BCA 法測蛋白濃度并調(diào)齊蛋白濃度，100 ℃加熱5 min，電泳（10%聚丙酰胺凝膠，80 V，110 min），轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)，80 V，90～110 min），BSA封閉，TBST 溶液清洗（5次），進行一抗孵育［山羊抗鼠STT3A 多克隆抗體（1∶2 000）；山羊抗兔STT3B 多克隆抗體（1∶2 000）和山羊抗鼠β-actin單克隆抗體（1∶5 000）］，4 ℃過夜，次日洗膜后，加入相應的二抗室溫孵育2 h，TBST 溶液清洗（3 次），ECL 化學發(fā)光，Bio-Rad 成像系統(tǒng)曝光顯影獲取圖像。

1.2.5 生物信息學分析通過GENT2（http：//gent2.appex.kr/gent2/）數(shù)據(jù)庫下載1 516 例卵巢癌組織和110 例正常卵巢組織的STT3A 和STT3B 表達譜數(shù)據(jù)并進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0和R 軟件3.5.3。對于計量資料，以表示；正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用Kruskal Wallis 檢驗進行統(tǒng)計學分析。對于計數(shù)資料，采用χ2檢驗方法進行統(tǒng)計學分析。選擇Kaplan-Meier 法來進行生存分析，并通過Graphpad Prism（v7.0）軟件進行生存曲線的繪制。采用Cox 比例風險模擬分析各種影響患者生存率的風險因素，將有統(tǒng)計學差異的單變量因素納入多變量分析之中。STT3A 與STT3B 蛋白表達相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析。采用R 軟件建立列線圖模型，比較ROC 曲線、校正曲線以確定預后模型的預測準確性。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 STT3A和STT3B在卵巢癌中高表達通過下載GENT2 卵巢癌數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示STT3A和STT3B 在卵巢癌中高表達（P＜ 0.05）。

2.2 STT3A和STT3B在EOC組織中高表達IHC染色法檢測88 例觀察組和22 例對照組中STT3A和STT3B 的表達水平（圖2）。STT3A 和STT3B 在高級別漿液性卵巢癌與輸卵管上皮中的高表達率的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表2。而非高級別漿液性卵巢癌即其他類型的EOC 中，STT3A 和STT3B 高表達率與正常卵巢也差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表3。

圖2 STT3A 和STT3B 在EOC 組織和對照組織的免疫組化代表性圖片（IHC×400，標尺50 μm）Fig.2 Representative pictures of immunohistochemistry of STT3A and STT3B in EOC tissues and control tissues（IHC×400，scale 50 μm）

表2 STT3A 和STT3B 在高級別漿液性卵巢癌和正常輸卵管上皮中的表達Tab.2 The expression of STT3A and STT3B in high-grade serous carcinoma and normal oviduct parietal epithelial tissues例

表3 STT3A 和STT3B 在非高級別漿液性卵巢癌和正常卵巢中的表達Tab.3 The expression of STT3A and STT3B in non-highgrade serous carcinoma and normal ovarian例

2.3 EOC 組織中STT3A 和STT3B 表達的相關(guān)性分析在EOC 組織中，STT3A和STT3B蛋白同時高表達有40例（45.5%），同時低表達有18例（20.5%），STT3A 高表達、STT3B 低表達有17 例（19.3%），STT3A 低表達、STT3B 高表達有13 例（14.7%）。Spearman 秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，STT3A 和STT3B之間具有正相關(guān)的關(guān)系（r=0.511 9，P＜ 0.001）。

2.4 卵巢癌細胞中STT3A 和STT3B 的表達Western blot 實驗結(jié)果顯示：SKOV-3 和A2780 細胞中STT3A 和STT3B 的表達均比IOSE-80 高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 Western blot 檢測細胞系中STT3A、STT3B 的表達情況Fig.3 The expression of STT3A and STT3B in cell lines detected by Western blot

2.5 STT3A 和STT3B 在EOC 組織中的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系STT3A 在EOC 組織中表達水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。STT3B 在EOC 組織中的表達與FIGO 分期、腫瘤分化程度、血清CA125 水平、淋巴脈管間隙浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表4。

表4 88 例EOC 組織中STT3A 和STT3B 的表達與患者臨床特征的關(guān)系Tab.4 The relationship between the expression of STT3A and STT3B in 88 EOC tissue and clinical characteristics of patients例（%）

2.6 STT3A 和STT3B 在EOC 組織中的表達與患者預后的關(guān)系對EOC 患者進行隨訪，時間截止為2023年1月30日，共計隨訪148 個月，中位隨訪時間為50（4～148）個月，其中在訪82例，失訪6例，隨訪率為93.2%，復發(fā)37 例，死亡30 例。Kaplan-Meier 生存分析顯示，STT3A 高表達組患者的OS 及PFS 均顯著低于低表達組（圖4A），STT3B 高表達組患者的OS及PFS均顯著低于低表達組（圖4B）。

圖4 EOC 組織中STT3A、STT3B 表達與患者OS 及PFS 的關(guān)系Fig.4 The relationship between the expression of STT3A and STT3B in EOC cancer cells with patients' OS and PFS

2.7 預測模式的建立和驗證根據(jù)單因素Cox 回歸模型，在EOC 患者中，年齡、FIGO 分期、腫瘤分化程度、STT3A 和STT3B 高表達是影響EOC 患者PFS 的單變量風險因素。將上述因素納入多因素Cox 回歸模型中，結(jié)果表明：年齡、腫瘤分化程度、STT3A 和STT3B 高表達，為EOC 患者預后的獨立危險因素（表5）。

將年齡、腫瘤分化程度、STT3A 和STT3B 高表達納入構(gòu)建預測EOC 患者生存的列線圖（圖5A）。校準曲線顯示，在EOC 患者的1、3、5年P(guān)FS 中，列線圖預測的概率和實際概率之間具有良好的一致性（圖5B）。同時，1、3、5年P(guān)FS的ROC 曲線下面積分別為0.796、0.758、0.854（圖5C）。預測模型c-指數(shù)為0.748，預測效果較好。

同理，F(xiàn)IGO 分期、腫瘤分化程度、淋巴脈管間隙浸潤、STT3A 和STT3B 高表達是影響EOC 患者OS 的單變量風險因素。腫瘤分化程度、STT3A 和STT3B 高表達，為EOC 患者預后的獨立危險因素（表6）。構(gòu)建預測EOC患者生存的列線圖（圖6A）。校準曲線顯示，在EOC 患者的1、3、5年OS 中，列線圖預測的概率和實際概率之間具有良好的一致性（圖6B）。同時，1、3、5年OS 的ROC 曲線下面積分別為0.694、0.755、0.828（圖6C）。預測模型c-指數(shù)為0.733，預測效果較好。

3 討論

近年來，EOC 的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，EOC 仍然是婦科中病死率最高的疾病［11］。雖然腫瘤細胞減滅術(shù)及靶向藥物的臨床應用很大程度上改善了患者的預后，但EOC 的總體復發(fā)及病死率仍較高，綜合治療后的生存率仍較低。因此，尋找早期的診斷和治療新靶點及改善EOC 患者預后的因素尤為迫切。

OST 是蛋白質(zhì)N-糖基化過程中重要的調(diào)控因子［7］，STT3 作為OST 高度保守的催化亞基，在人類組織中廣泛表達。并且現(xiàn)有相關(guān)文獻支持STT3A和STT3B 與多種實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PATEL 等［12］通過檢測甲狀腺癌中STT3A 的表達，發(fā)現(xiàn)有73%的甲狀腺濾泡性癌中STT3A 高表達。CHENG 等［13］研究結(jié)果顯示相對于正常肺組織而言，STT3A 在肺腺癌組織中的表達更高。DING等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者癌組織中STT3A 和STT3B 高表達。本研究通過生物信息學初步研究發(fā)現(xiàn)，STT3A 和STT3B 在卵巢癌中高表達，進一步通過組織及細胞水平實驗證實，STT3A 及STT3B蛋白在EOC 癌細胞中高表達，這表明STT3A 及STT3B 的表達與EOC 的發(fā)生發(fā)展可能有一定的關(guān)系。通過分析STT3A 和STT3B 與EOC 患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)STT3A 高表達與低分化程度、存在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學差異，提示STT3A 高表達可能與較高的腫瘤惡性程度有關(guān)；同時，STT3B 高表達與FIGO 分期（Ⅲ-Ⅳ期）、低分化程度、血清CA125 水平（≥ 200 μL）、存在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有淋巴脈管間隙浸潤等因素有關(guān)，提示STT3B高表達與EOC 進展可能有重要聯(lián)系。以上結(jié)果表明，STT3A 和STT3B 的高表達可能與EOC 侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表5 EOC 患者PFS 的單因素和多因素Cox 回歸分析Tab.5 Univariate and multivariate Cox regression analysis of PFS in EOC patients

表6 EOC 患者OS 的單因素和多因素Cox 回歸分析Tab.6 Univariate and multivariate Cox regression analysis of OS in EOC patients

圖5 PFS 列線圖預后模型Fig.5 Nominegram prognostic model of PFS

圖6 OS 列線圖預后模型Fig.6 Nominegram prognostic model of OS

文獻報道，STT3A 和STT3B 的高表達與上皮來源的惡性腫瘤患者的不良預后有關(guān)［14-16］。RUAN等［15］研究證實了STT3A 和STT3B 在結(jié)腸腺癌患者的癌細胞中過表達，且根據(jù)無病生存期分析，發(fā)現(xiàn)STT3A 和STT3B 與患者的預后不良有關(guān)。MA等［16］研究結(jié)果顯示STT3A 在鼻咽癌中高表達，且STT3A 高表達與晚期鼻咽癌相關(guān)。DING 等［14］通過OS 分析發(fā)現(xiàn)高表達的STT3A 和STT3B 與患者的預后不良相關(guān)，同時STT3A 和STT3B 與乳腺癌患者的年齡、分級、TMN 分期等臨床病理特征具有統(tǒng)計學意義。本研究中，通過Kaplan-Meier 分析發(fā)現(xiàn)，EOC 中STT3A 和STT3B 表達越高，患者的預后越差，提示STT3A 和STT3B 的異常表達可能與患者的預后不良有關(guān)，與上述研究結(jié)果趨勢一致。同時，Cox 風險評估結(jié)果顯示，年齡、腫瘤分化程度、STT3A 和STT3B 蛋白高表達是影響患者預后的獨立危險因素。為了更好地評估個體化生存預期并規(guī)劃EOC 患者個體化治療的短期隨訪，構(gòu)建基于Cox 結(jié)果的列線圖預后模型，結(jié)果顯示該預后模型具有較好的預測性能。這些結(jié)果進一步證實了STT3A 和STTB 可能是EOC 患者預后中的關(guān)鍵因素。

綜上所述，本研究結(jié)果表明STT3A 和STT3B在EOC 中高表達，且與EOC 患者臨床病理特征具有一定的聯(lián)系，可能與EOC 的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在EOC 組織中，STT3A 和 STT3B 表達水平越高，患者臨床預后越差，這些結(jié)果表明STT3A 和STT3B 的異常表達與EOC患者的預后不良有關(guān)，可能是EOC患者評估預后的潛在標志物。

【Author contributions】SUN Chongfeng performed the experiments and wrote the article.HOU Jieshuai，ZHAO Zouyu and YU Panpan provided follow-up information.YANG Ping oversaw the study.All authors read and approved the final manuscript as submitted.