漆酶基因LACC1經(jīng)腺苷酸活化蛋白激酶/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3加重腦梗死缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

焦俊萍，鮑軍強(qiáng)，史慧敏，高超，田書娟

目的 探討漆酶基因LACC1對(duì)腦梗死后缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制。

方法 ①采購(gòu)C57BL/6J LACC1基因敲除（LACC1-/-）小鼠20只，野生型小鼠20只，建立大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型各15只，比較兩組小鼠的腦梗死體積。采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腦組織中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylate AMP-activated protein kinase，p-AMPK）及NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）水平，采用微陣列分析外周血中長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）表達(dá)譜及探討可能涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。②制備小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/再灌注（oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型，并通過(guò)小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)及抑制LACC1的表達(dá)，明確LACC1對(duì)腦梗死體外模型炎癥和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用。采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-AMPK、NLRP3水平，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)血清過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、IL-1β、IL-6、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、TNF-α水平。

結(jié)果 MCAO/R模型野生型小鼠組腦梗死體積比例為（21.38%±4.06%），LACC1-/-小鼠組腦梗死體積比例為（19.07%±2.86%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041），同時(shí)LACC1-/-小鼠腦組織中p-AMPK的蛋白表達(dá)水平增加，NLRP3蛋白表達(dá)水平受到抑制。OGD/R細(xì)胞模型中，LACC1的下調(diào)抑制了NLRP3蛋白的表達(dá)、增加了p-AMPK蛋白的表達(dá)。OGD/R細(xì)胞模型中，LACC1的過(guò)度表達(dá)增加了IL-1β、IL-6、INF-γ、TNF-α、MDA和ROS生成，降低了CAT和SOD的水平（P＜0.05）。

結(jié)論 LACC1可能通過(guò)AMPK/NLRP3途徑加重小鼠缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)，這可能為腦梗死或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其相關(guān)并發(fā)癥提供一種新的治療方案。

腦梗死的發(fā)病率及致殘率均較高，神經(jīng)免疫炎癥、氧自由基及細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自噬等均參與了缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展[1]。闡明腦梗死的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療干預(yù)措施，是臨床亟須解決的問(wèn)題。漆酶基因LACC1與脂質(zhì)代謝、NOD2復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和嘌呤核苷酸循環(huán)有關(guān)[2]，有研究顯示LACC1可以調(diào)節(jié)TNF、IL-17等細(xì)胞因子的水平[3]，LACC1的切割和降解導(dǎo)致巨噬細(xì)胞自噬阻滯。有研究證實(shí)LACC1對(duì)促進(jìn)腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylate AMPactivated protein kinase，AMPK）下游巨噬細(xì)胞的自噬通量很重要[4]。對(duì)于缺血性卒中患者，AMPK的上調(diào)不但能減輕氧化應(yīng)激、抑制神經(jīng)炎癥，而且能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的自噬和凋亡、改善線粒體的功能、抑制谷氨酸興奮毒性，并且促進(jìn)新生血管形成。在腦梗死的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，腸道菌群及IL-17發(fā)揮了重要作用[5]，LACC1是保持腸道穩(wěn)態(tài)的重要基因[6]。因此，本研究設(shè)計(jì)推斷LACC1對(duì)腦梗死急性期的缺血再灌注損傷有一定的影響，其機(jī)制可能與參與炎癥與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注模型建立及分組 選擇8周齡雄性C57BL/6J小鼠（購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）和8周齡C57BL/6JLACC1基因敲除（LACC1-/-）小鼠[購(gòu)于賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司]建立大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型，小鼠質(zhì)量為18～22 g。向小鼠腹腔內(nèi)注射水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，將右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈進(jìn)行分離，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈，夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端。在頸總動(dòng)脈距離分叉約0.2 cm處剪一“V”形小口，將栓塞線從切口處插入頸總動(dòng)脈，將線栓推進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈，縫合皮膚傷口。閉塞60 min后，緩慢回撤線栓以實(shí)現(xiàn)血流的再灌注。MCAO/R術(shù)后24 h，采用Longa評(píng)分系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為檢查。0分：無(wú)神經(jīng)功能障礙；1分：完全無(wú)法伸展左前爪；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。Longa評(píng)分為1～3分的小鼠是成功的MCAO/R模型。20只野生型小鼠MCAO/R造模成功15只，作為對(duì)照組；20只LACC1-/-小鼠MCAO/R造模成功15只，作為實(shí)驗(yàn)組。本研究經(jīng)過(guò)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：20220221）。

1.1.2 細(xì)胞模型建立及分組 將小鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞（購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司）在杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（購(gòu)于美國(guó)猶他州洛根Hyclone公司）中進(jìn)行培養(yǎng)。DMEM含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。根據(jù)不同轉(zhuǎn)染序列將細(xì)胞模型分為4組：陰性組、LACC1上調(diào)組、LACC1下調(diào)組及Si陰性組。

1.1.3 試劑 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，單克隆抗體NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylate AMP-activated protein kinase，p-AMPK）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）和羊抗小鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，放射免疫沉淀（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、IL-1β、IL-6、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) （1）微陣列分析：造模4周后，采集兩組小鼠外周血，采用高通量長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）芯片進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)分?jǐn)?shù)值標(biāo)準(zhǔn)化，去除低質(zhì)量探針（保留20個(gè)樣品中至少10個(gè)樣品標(biāo)記為表達(dá)或未表達(dá)的探針），得到腦梗死lncRNA表達(dá)譜。將鑒別出的mRNAs[P＜0.05，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05]進(jìn)行通路富集分析，推斷腦梗死發(fā)生過(guò)程中可能涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

（2）TTC染色：造模4周后，取小鼠腦組織，由視交叉平面開始向后連續(xù)切取2 mm冠狀切片5張。配制1%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液，37 ℃避光浸染15 min后拍照，通過(guò)顏色不同評(píng)定小鼠的腦梗死體積，紅色、白色分別為正常組織、梗死區(qū)。使用Image J軟件進(jìn)行梗死區(qū)體積統(tǒng)計(jì)分析，腦梗死體積比例=總梗死體積/各腦切片體積之和×100%。

（3）蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠腦組織中的蛋白表達(dá)：造模4周后，取小鼠腦組織剪碎經(jīng)RIPA裂解緩沖液處理，離心后取上清液通過(guò)二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）分析蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)通過(guò)10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，在室溫下采用5%脫脂乳封閉膜封閉1 h，并在4 ℃下采用LACC1、AMPK、p-AMPK、NLRP3和β-肌動(dòng)蛋白一級(jí)抗體孵育過(guò)夜，將膜與二級(jí)抗體——辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的山羊抗小鼠二級(jí)抗體在室溫下孵育2 h。采用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法測(cè)定蛋白質(zhì)條帶，并采用Image J軟件進(jìn)行評(píng)估。

1.2.2 細(xì)胞模型 （1）細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)與傳代：從液氮中取出BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，37 ℃水浴快速?gòu)?fù)蘇后采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，在完全培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，1%雙抗（抗青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞。將BV-2置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為90%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

（2）siRNA轉(zhuǎn)染序列：①細(xì)胞鋪板，每孔30萬(wàn)，6孔板，過(guò)夜，使轉(zhuǎn)染前密度達(dá)到3～5×。②按照說(shuō)明書，配制轉(zhuǎn)染儲(chǔ)存液。③轉(zhuǎn)染終濃度選用50 nM，嚴(yán)格按照Lipofectamine試劑盒說(shuō)明書，將化學(xué)合成的LACC1模擬物、模擬陰性對(duì)照物（NC）、si-LACC1和si-NS（廣州市銳博生物科技有限公司）利用LipofectamineTM2000工具包瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]。對(duì)LACC1基因和內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）設(shè)計(jì)特異性引物，將LACC1進(jìn)行擴(kuò)增（引物由深圳華大基因科技有限公司合成）：LACC1-F：5′-CCATTCGCTCACCGTCATC-3′，LACC1-R：5′-CCTTTGCCTTCGTTGTTGTTC-3′，GAPDH-F：5′-CGCTCAACAAGAACTTCGTCAA-3′，GAPDH-R：5′-GTAGACAAGGAGGTCACAGA-3′。Si-LACC1基因序列[3]（Dharmacon On-Target Plus SMARTpool? siRNA試劑，北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司）：CGAAAGAUGUAGAGGUUUU（J-015653-17），CUAGAUAAGAGGCGAUCAA（J-015653-18），AGACAUUGUUGUUGUACUU（J-015653-19），GGAGAAAUUUUACCGAAUA（J-015653-20）。④按說(shuō)明書配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入無(wú)雙抗培養(yǎng)基中，混勻。⑤將孔板放入37 ℃孵箱培養(yǎng)。⑥24 h后用磷酸鹽緩沖液沖洗孔板，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其間可進(jìn)行加藥操作。⑦換液24 h后，進(jìn)行糖氧剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）處理及后續(xù)操作。

（3）建立OGD/R模型：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV-2細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用1 mL高糖DMEM沖洗2次，加入胰酶消化細(xì)胞，在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞已被消化，再加入3 mL DMEM多次吹打，收取細(xì)胞懸液。離心后，用1 mL胎牛血清重懸沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，加入無(wú)糖DMEM（96孔板每孔100 μL，12孔板每孔1 mL）。將細(xì)胞培養(yǎng)板和氧濃度檢測(cè)儀同時(shí)放入缺氧小室中，連接缺氧裝置與備用氣瓶，用含95% N2和5% CO2的混合氣體通氣，流量為20 L/min，氧濃度監(jiān)測(cè)儀顯示缺氧小室內(nèi)氧濃度≤0.2%時(shí)，快速關(guān)緊進(jìn)、出氣閥，將缺氧裝置放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。除去培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，以高糖DMEM沖洗2次，再加入完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，模擬再灌注損傷。

（4）蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)：通過(guò)ECL法測(cè)定4組模型中LACC1、p-AMPK、NLRP3的蛋白表達(dá)，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描膠片后進(jìn)行吸光度分析，通過(guò)計(jì)算目的條帶與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參條帶的比值來(lái)表示目的蛋白的表達(dá)水平。

（5）ELISA檢測(cè)炎性因子水平：對(duì)細(xì)胞上清液中的GSH、SOD、MDA、IL-1β、IL-6、INF-γ和TNF-α水平采用ELISA法進(jìn)行定量檢測(cè)。使用微孔板讀取器（Bio-Rad）測(cè)定450 nm處的吸光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prime 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布、方差齊的計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用Turkey法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 微陣列分析結(jié)果 對(duì)LACC1-/-小鼠進(jìn)行微陣列分析，顯示其LACC1基因表達(dá)水平上調(diào)，對(duì)靶基因進(jìn)行通路富集分析得到AMPK/NLRP3信號(hào)通路（圖1）。

圖1 微陣列分析結(jié)果Figure 1 Microarray analysis results

2.1.2LACC1基因敲除后的腦梗死體積TTC染色結(jié)果顯示，野生型小鼠組腦梗死體積比例為（21.38%±4.06%），LACC1-/-小鼠組腦梗死體積比例為（19.07%±2.86%），野生型小鼠組腦梗死體積比例高于LACC1-/-小鼠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041），結(jié)果提示基因敲除對(duì)小鼠的腦梗死體積有顯著影響（圖2）。

圖2 LACC1基因敲除后小鼠腦梗死體積的變化Figure 2 Changes in cerebral infarction volume of mice after LACC1 gene knockout

2.1.3 兩組小鼠炎性指標(biāo)分析 與野生型小鼠相比，LACC1-/-小鼠腦組織中GSH和SOD表達(dá)水平增加，MDA、IL-1β、IL-6、INF-γ、TNF-α、I型膠原、E-鈣黏蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）mRNA表達(dá)水平受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 兩組小鼠炎性指標(biāo)比較Table 1 Comparison of inflammatory indicators between two groups of mice

2.1.4 p-AMPK、NLRP3在LACC1-/-小鼠中的表達(dá)LACC1-/-小鼠腦組織中p-AMPK蛋白為（3.014±0.817），高于野生型小鼠的（1.277±0.254），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.346，P＜0.001）；LACC1-/-小鼠腦組織中NLRP3蛋白為（0.295±0.058），低于野生型小鼠的（1.782±0.442），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.017，P＜0.001）。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 兩組小鼠p-AMPK蛋白、NLRP3蛋白的表達(dá)Figure 3 Protein expression of p-AMPK and NLRP3 between two groups of mice

2.2 細(xì)胞模型

2.2.1 細(xì)胞模型ELISA檢測(cè)結(jié)果LACC1上調(diào)組MDA、ROS、IL-1β、IL-6、TNF-α和INF-γ水平高于陰性組，CAT和SOD水平低于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。LACC1下調(diào)組MDA、SOD、IL-1β、IL-6、TNF-α和INF-γ水平低于Si陰性組，CAT和SOD水平高于Si陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表2 LACC1上調(diào)組與陰性組炎性指標(biāo)比較Table 2 Comparison of inflammatory indicators between the LACC1 up-regulated group and the negative group

表3 LACC1下調(diào)組與Si陰性組炎性指標(biāo)比較Table 3 Comparison of inflammatory indicators between the LACC1 down-regulated group and the Si-negative group

2.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LACC1下調(diào)組p-AMPK蛋白量為（2.204±0.632），高于Si陰性組的（0.913±0.226），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.820，P＜0.001）；NLRP3蛋白量為（0.445±0.078），低于Si陰性組的（0.917±0.245），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.033，P＜0.001），蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4A。LACC1上調(diào)組p-AMPK蛋白量為（0.352±0.113），低于陰性組的（1.092±0.284），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.158，P＜0.001）；NLRP3蛋白量為（0.883±0.226），高于陰性組的（0.237±0.062），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.075，P＜0.001），蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4B。免疫熒光顯示LACC1上調(diào)后p-AMPK蛋白的表達(dá)較陰性組降低（圖4C）。

圖4 LACC1調(diào)節(jié)AMPK/NLRP3通路Figure 4 LACC1 regulates the AMPK/NLRP3 pathway

3 討論

卒中患者會(huì)遺留功能殘障、社會(huì)功能和心理健康受損，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間[7]。相關(guān)的炎癥和免疫反應(yīng)是腦梗死病理生理學(xué)中的關(guān)鍵因素[8]。急性腦梗死患者中氧自由基含量升高，增加了抗氧化酶的降解，因此，機(jī)體中的SOD會(huì)減少，同時(shí)MDA水平會(huì)升高，增加了氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷。在缺血開始數(shù)小時(shí)內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)對(duì)改變的內(nèi)環(huán)境做出反應(yīng)，表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)改變和與神經(jīng)元接觸的增加，受累神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)興奮毒性鈣超載跡象[9]。伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞上模式識(shí)別受體的激活，炎癥小體所介導(dǎo)的IL-1β釋放和TNF水平增加，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞中的趨化因子和細(xì)胞因子產(chǎn)生，進(jìn)而反饋到炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。免疫系統(tǒng)在損傷部位發(fā)揮免疫抑制參與腦損傷，還會(huì)削弱機(jī)體抵抗力，導(dǎo)致致命的細(xì)菌感染，使卒中患者的預(yù)后受到影響，甚至?xí)＜吧黐10]。

AMPK在調(diào)節(jié)全身細(xì)胞能量代謝的內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用[11]。在正常生理?xiàng)l件下，AMPK可促進(jìn)大腦發(fā)育并調(diào)節(jié)神經(jīng)元極化。在腦梗死患者中，AMPK的上調(diào)可減輕氧化應(yīng)激、抑制神經(jīng)炎癥、調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬和凋亡、改善線粒體功能、抑制谷氨酸興奮毒性和促進(jìn)新生血管形成，AMPK還可促進(jìn)缺血性卒中的功能恢復(fù)[12]。氧化呼吸鏈在腦缺血期間受損，可產(chǎn)生ROS[13]。ROS使硫氧還蛋白相互作用蛋白與NLRP3受體結(jié)合，從而激活NLRP3，NLRP3炎癥小體可使caspase-1發(fā)生自剪切并產(chǎn)生酶活性，引起細(xì)胞凋亡[14-15]。本研究在腦梗死患者及腦梗死模型小鼠的血清中發(fā)現(xiàn)AMPK的表達(dá)水平降低，NLRP3的表達(dá)水平升高，從另一方面證實(shí)了AMPK在抗炎、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞方面的作用。

LACC1具有下調(diào)感染和免疫炎癥反應(yīng)的功能[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，LACC1可影響TNF及IL-17的水平[3]。LACC1缺乏降低了原代巨噬細(xì)胞的自噬通量，而脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2、巨噬細(xì)胞集落刺激因子在急性腦梗死過(guò)程中起著重要的作用，二者由血管壁成熟的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等分泌而來(lái)[4]。在腦梗死的發(fā)生、發(fā)展中，腸道菌群及IL-17發(fā)揮了重要作用[5]。LACC1是保持腸道穩(wěn)態(tài)的重要基因[6]。腸道微生物群與卒中后認(rèn)知功能障礙的多種危險(xiǎn)因素相關(guān)，推測(cè)二者存在某種聯(lián)系[17]。本研究證實(shí)LACC1基因敲除后，小鼠的梗死體積明顯減小，AMPK表達(dá)水平升高，NLRP3表達(dá)水平降低，顯示LACC1可能加重腦梗死后的神經(jīng)損傷。接下來(lái)，研究進(jìn)一步通過(guò)上調(diào)及下調(diào)LACC1的水平尋找該基因的作用通路，證實(shí)AMPK/NLRP3受LACC1的調(diào)節(jié)，因此推斷LACC1可能通過(guò)AMPK/NLRP3通路發(fā)揮作用，并促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-6、INF-γ、TNF-α等的表達(dá)，加重腦梗死后炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致缺血再灌注損傷。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示LACC1基因促進(jìn)炎性因子的表達(dá)，抑制AMPK及增加NLPR3表達(dá)，從而增加炎癥反應(yīng)和ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。因此推測(cè)LACC1基因可能通過(guò)AMPK/NLPR3途徑加重缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)。這項(xiàng)工作有助于深入理解腦梗死及缺血再灌注的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)進(jìn)一步研究，該通路中的重要蛋白亦可能成為腦梗死急性期新的疾病標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

【點(diǎn)睛】LACC1基因通過(guò)調(diào)控AMPK/NLRP3通路，加重炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致腦梗死后的缺血再灌注損傷，這可能為腦梗死及其并發(fā)癥的治療提供一種新思路。