雷公藤甲素聯合吉非替尼對EGFR突變NSCLC細胞的協同效應分析

張 藝 ，郭 芬 （1.咸寧市中心醫院/湖北科技學院附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，湖北 咸寧 437100；.湖北科技學院臨床醫學院醫學實驗實訓中心，湖北 咸寧 437100）

肺癌是癌癥致死的首要原因，其中約85%的肺癌為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），嚴重影響人類健康[1]。近年來，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）編碼基因分型的鑒定和EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）靶向藥物的發展，極大地改變了EGFR基因突變晚期NSCLC患者的治療結局[2]。然而，幾乎所有的EGFR基因突變陽性患者都會在治療1 年內對EGFR-TKIs 產生獲得性耐藥[3]，故探尋能夠預防或克服EGFR-TKIs 耐藥的治療方案成為該領域的主要研究方向。

近期研究證實，某些天然藥物成分可通過不同的信號通路來推遲或阻止EGFR-TKIs耐藥的發生[4]。雷公藤甲素（triptolide，TPL）是從中藥雷公藤中提取分離的一種二萜類化合物，具有顯著的抗腫瘤活性，且在逆轉化療藥物耐藥方面具有一定潛力[5—6]，然而其具體機制尚不清楚。既往有研究證實，TPL可調節多種生物學過程關鍵蛋白的表達，且與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，又稱Akt）通路的關系尤其密切[7]；同時，PI3K/Akt通路與EGFR-TKIs 耐藥的發生密切相關[8]。為此，本課題組基于PI3K/Akt 通路，以耐藥細胞為對象，初步探索TPL 對第一代EGFR-TKIs 吉非替尼獲得性耐藥的抑制作用及潛在機制，旨在為進一步闡明TPL 的藥理作用提供參考，亦為預防或逆轉EGFR-TKIs 耐藥提供候選治療策略。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BD Accuri C6 型流式細胞儀（美國BD Biosciences 公司）、XBQ-2H 型細胞培養儀（上海佐研儀器科技有限公司）、LD-96A型酶標儀（山東萊恩德智能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

TPL對照品（批號111567-202005，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院；吉非替尼片（批號211102，規格0.25 g）購自日本Kagamiishi Plant，Nipro Pharma Corporation。TPL 對照品和吉非替尼片均保存于二甲基亞砜（DMSO）中（最終質量濃度均為100 μg/mL），臨用前以無血清培養基稀釋至相應質量濃度。

RPMI 1640 培養基購自美國Gibco 公司；核糖核酸酶Ⅰ購自美國Sigma-Aldrich 公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑購自北京百奧萊博科技有限公司；MTT試劑（批號c7062）購自北京博奧森生物技術有限公司；兔源PI3K p85α 單克隆抗體（批號ab191606）、兔源Akt3+Akt2+Akt1 重組單克隆抗體（批號ab32505）、小鼠源哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）單克隆抗體（批號ab87540）、兔源微管相關蛋白1 輕鏈3α（microtubule-associated protein 1 light chain 3α，MAP1LC3A）單克隆抗體（批號ab52768）、兔源MAP1LC3B 多克隆抗體（批號ab51520）、Alexa Fluor?488 標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號ab150077）、Alexa Fluor?488 標記的山羊抗鼠IgG 二抗（批號ab96879）均購自英國Abcam公司。

1.3 實驗細胞

人EGFR 低敏感性NSCLC 細胞系H1975（即EGFRT790M/L858R 突變的耐藥細胞系）和高敏感性NSCLC細胞系H1299（即EGFR野生型的非耐藥細胞系）均購自日本Riken細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養

將H1299 和H1975 細胞置于含有10%胎牛血清、L-谷氨酰胺（2 mmol/L）、1%青霉素-鏈霉素雙抗和25 mmol/L HEPES 緩沖液的RPMI 1640 培養基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養。待細胞生長融合度達90%時，用0.25%胰酶消化并按照1∶3的比例傳代繼續培養，取傳至第2代的細胞進行后續實驗。

2.2 TPL、吉非替尼單用及兩藥聯合對2種細胞敏感性影響的檢測

待H1299和H1975細胞鋪滿培養皿60%左右時，取生長良好的細胞以2.5×105個/孔接種于6 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養（培養條件下同）。待細胞完全貼壁后，分為空白組（僅含細胞和培養液）、不同濃度TPL組（1、5、10、15、20、25、30 nmol/L，參考相關文獻[6]和預實驗結果設置）、不同濃度吉非替尼組（1、2、4、8、12、16、20 μmol/L，參考相關文獻[7]和預實驗結果設置）、不同濃度TPL+吉非替尼組（5 nmol/L TPL 分別聯合2、5、10、20 μmol/L 吉非替尼，10 nmol/L TPL 分別聯合2、5、10、20 μmol/L吉非替尼，參考前期MTT篩選結果設置），每組設6個復孔。棄去培養液，各藥物組加入相應藥液，空白組不作處理。培養24、48、72 h 后，收集各組細胞，加入5 mg/mL MTT 試劑20 μL，在37 ℃下孵育4 h，使用酶標儀于490 nm 波長處檢測各孔的光密度（optical density，OD）值并計算細胞存活率：細胞存活率（%）＝藥物組OD值/空白組OD值×100%。計算吉非替尼（作用24、48、72 h）的半數抑制濃度（IC50）和吉非替尼單用及兩藥聯用（作用48 h）的藥物敏感度指數（sensitivity index，SI）：SI＝ΔX/ΔY（式中，ΔX是細胞存活數，ΔY是正常細胞總數）。若SI＝1.0，表示細胞對藥物的敏感性不明顯；SI＞1.0，表示細胞對藥物的敏感性較高；SI＜1.0，表示細胞對藥物的敏感性較低[9]。采用中位藥效法（Chou-Talalay法）計算TPL聯合吉非替尼作用48 h的聯合用藥指數（combination index，CI）：CI＝d1/D1+d2/D2（式中，d1和d2分別為聯合用藥時吉非替尼和TPL的濃度；D1和D2分別為產生與聯合用藥相等效應時吉非替尼和TPL 單用的濃度）。CI＞1為兩藥拮抗，CI＝1為兩藥相加，CI＜1 為兩藥協同[6]；以受影響的細胞比例（Fa）為橫坐標、CI為縱坐標繪制散點圖，若Fa 為0.2～0.8 則表示藥物有效[7]。

2.3 TPL 聯合吉非替尼對H1975 細胞凋亡及周期分布影響的檢測

取生長良好的H1975 細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，培養，待細胞貼壁后，分為空白組（僅含細胞和培養液），低、高濃度TPL 組（5、15 nmol/L，參考“2.2”項下結果設置），吉非替尼組（2 μmol/L，參考“2.2”項下結果設置），低濃度TPL+吉非替尼組、高濃度TPL+吉非替尼組（5 nmol/L TPL+2 μmol/L 吉非替尼，15 nmol/L TPL+2 μmol/L 吉非替尼，參考“2.2”項下結果設置），每組設6個復孔。棄去培養液，各藥物組加入相應藥液，空白組不作處理。培養24、48 h后，收集各組細胞，并固定于冷的75%乙醇中，隨后用含200 mmol/L Na2PO4和0.1% Triton X-100 試劑的DNA 緩沖液處理，再以含200 μg/mL核糖核酸酶Ⅰ的PI試劑染色，使用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率及周期分布情況。

2.4 TPL與EGFR分子對接分析

從PDB 蛋白質數據庫（https：//www.rcsb.org/）加載EGFRT790M/L858R 突變型及野生型編碼產物的晶體結構，去除水分子后，基于AMBER99 力場對其進行質子化處理；利用MMFF94s 力場優化TPL 的分子結構。利用MOE 分子對接軟件模擬TPL 和EGFR 的結合位點。基于結合對接能量對TPL 的所有結合位點進行排序，并選擇能量最低的構象進行結合模式展示。

2.5 TPL 聯合吉非替尼對H1975 細胞PI3K/Akt/mTOR通路及自噬相關蛋白表達影響的檢測

采用流式細胞術檢測。取生長良好的H1975 細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，培養，待細胞貼壁后，按“2.3”項下方法分組、干預。培養24、48 h后，收集各組細胞，分別用核因子固定液和滲透緩沖液固定和滲透，然后加入PI3K、Akt、mTOR、MAP1LC3A、MAP1LC3B 一抗（稀釋比例均為1∶2 000），4 ℃孵育過夜；再加入相應二抗（稀釋比例均為1∶1 000），孵育1 h。使用酶標儀檢測并使用FlowJo V10 軟件分析目的蛋白的熒光強度以表示其表達水平。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 TPL、吉非替尼單用及兩藥聯合對2種細胞敏感性的影響

隨著濃度的增加和時間的延長，TPL、吉非替尼對H1975 和H1299 細胞增殖的抑制作用逐漸增強，且具有濃度、時間依賴趨勢（圖1A、1B）。作用24、48、78 h 時，吉非替尼對H1975 細胞的IC50分別為15.10、11.67、7.31 μmol/L，對H1299 細胞的IC50分別為15.78、12.75、9.48 μmol/L。作用48 h 時，吉非替尼對H1975 細胞的SI 為0.73；與5 或15 nmol/L 的TPL 聯用后，SI 分別升至1.88、2.30，提示聯用后藥物對H1975細胞的敏感性有所增加；此外，兩藥聯合作用48 h 對H1975 細胞的CI 均小于1（Fa 約為0.5），提示兩藥聯合對H1975 細胞的增殖具有協同抑制效應。但兩藥聯用對H1299 細胞的CI 均大于1（Fa多低于0.2），提示兩藥聯合對H1299細胞的增殖并無上述協同抑制效應（圖1C、圖1D）。

圖1 TPL、吉非替尼單用及兩藥聯用對2種細胞敏感性的影響（±s，n＝6）

3.2 TPL 聯合吉非替尼對H1975 細胞凋亡及周期分布的影響

H1975細胞培養24 h或48 h時，各藥物組細胞的凋亡率均較空白組顯著升高（P＜0.05）。同時，與空白組比較，各藥物組G0/G1期細胞的比例均顯著升高，S期、G2/M期（僅高濃度TPL組作用48 h和聯用組）細胞的比例均顯著降低，且高濃度TPL組細胞的凋亡率及周期變化普遍較吉非替尼組，聯用組較吉非替尼、TPL單用組，高濃度聯用組較低濃度聯用組更明顯（P＜0.05）。結果見表1。

表1 TPL聯合吉非替尼對H1975細胞凋亡率及周期分布的影響（±s，n＝6，%）

表1 TPL聯合吉非替尼對H1975細胞凋亡率及周期分布的影響（±s，n＝6，%）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與吉非替尼組比較，P＜0.05；c：與低濃度TPL組比較，P＜0.05；d：與高濃度TPL組比較，P＜0.05；e：與低濃度TPL+吉非替尼組比較，P＜0.05。

組別空白組吉非替尼組低濃度TPL組高濃度TPL組低濃度TPL+吉非替尼組高濃度TPL+吉非替尼組培養24 h凋亡率11.32±2.25 27.52±2.33a 26.43±2.64a 38.93±6.56abc 46.69±2.64abcd 52.12±4.81abcde G0/G1期比例57.60±4.63 63.15±5.04a 64.58±7.41a 70.21±6.38ab 77.82±5.26abcd 85.69±6.42abcde S期比例21.49±2.60 16.31±1.41a 12.61±5.12a 10.96±4.58ab 6.63±1.24abcd 4.43±0.26abcde G2/M期比例10.71±1.03 9.86±0.42 12.48±5.45 11.32±2.10 7.12±1.49abcd 5.49±0.69abcde培養48 h凋亡率22.16±2.38 35.47±2.55a 35.33±3.51a 40.43±2.43abc 50.78±2.30abcd 62.54±3.66abcde G0/G1期比例61.23±8.21 65.20±4.23a 67.41±2.52a 74.61±6.23abc 85.79±4.73abcd 93.87±6.90abcde S期比例30.64±5.13 21.03±2.08a 22.75±5.00a 17.72±0.39abc 11.81±3.29abcd 7.24±0.58abcde G2/M期比例20.85±3.91 18.73±4.05 18.18±3.42 16.68±0.62a 9.80±2.44abcd 5.70±0.28abcde

3.3 TPL與EGFR分子對接分析

TPL 的羥基可與EGFRT790M/L858R 突變編碼產物的Thr854 殘基形成氫鍵，結合對接能量為-6.504 kcal/mol（1 kcal＝4.19 kJ）；而TPL 與EGFR野生型編碼產物之間沒有氫鍵，結合對接能量為-4.460 kcal/mol。結果見圖2。

圖2 TPL與EGFR T790M/L858R突變和EGFR野生型編碼產物結合的二維模型

3.4 TPL 聯合吉非替尼對H1975 細胞PI3K/Akt/mTOR通路及自噬相關蛋白表達的影響

與空白組比較，各藥物組培養24、48 h 時通路相關蛋白PI3K、Akt、mTOR 的表達均顯著下調，而自噬相關蛋白MAP1LC3A、MAP1LC3B的表達均顯著上調，且高濃度TPL組上述指標的變化均較吉非替尼組，聯用組較吉非替尼、TPL 單用組，高濃度聯用組較低濃度聯用組更明顯（P＜0.05），結果見圖3。

圖3 TPL聯合吉非替尼對H1975細胞PI3K/Akt/mTOR通路和自噬相關蛋白表達的影響（±s，n＝6）

4 討論

吉非替尼是第一代EGFR-TKIs，可通過競爭性結合EGFR 結構域中的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）位點而阻止酪氨酸磷酸化，阻斷EGFR所介導的信號通路持續激活，從而發揮抗腫瘤作用，該藥被廣泛用于EGFR基因突變陽性NSCLC 患者的一線治療[1，7—8]。然而臨床實踐顯示，多數患者用藥后不久便會發生EGFR-TKIs耐藥，從而導致治療失敗[10—11]。

TPL 是一種具有強烈細胞毒性的環氧二萜內酯化合物，對乳腺癌、前列腺癌、肺癌等腫瘤細胞均有顯著的抑制作用，還可增強5-氟尿嘧啶、順鉑、阿霉素等化療藥物的抗腫瘤作用，從而提高化療藥物的治療效果[6，12]。本研究發現，不同濃度的TPL對H1975、H1299細胞的增殖有一定的抑制作用，且有時間和濃度依賴趨勢。

藥物相互作用評價在醫藥學各個領域都具有重要的價值，特別是在需聯合用藥的惡性腫瘤化療領域，其中CI分析是評估化療藥物相互作用的常用指標之一，當Fa 值為0.2～0.8、CI＜1 則表示聯用藥物具有協同效應[6—7，13]。本研究結果顯示，不同濃度的TPL聯合吉非替尼可對H1975細胞的增殖產生協同抑制效應（Fa約0.5，CI＜1）；而兩藥聯合對H1299 細胞幾乎沒有上述效應（Fa 多低于0.2，CI＞1），同時反映藥物敏感度的SI 也從單用的0.73升至聯用的1.88、2.30，可能是因為H1299細胞為吉非替尼敏感細胞，而H1975 細胞因存在EGFRT790M/L858R突變而對吉非替尼不敏感，TPL聯合吉非替尼增加了耐藥細胞的敏感性，提示TPL有逆轉吉非替尼耐藥的潛力。此外，細胞凋亡和細胞周期檢測結果同樣顯示，TPL聯合吉非替尼可明顯誘導H1975細胞凋亡并將其阻滯于G0/G1期。這些結果均證實了TPL聯合吉非替尼可發揮顯著的抗腫瘤作用，能更有效地抑制腫瘤細胞的生長，誘導其凋亡并阻滯細胞周期。

本研究進行的計算機模擬分子對接發現，與EGFR野生型編碼產物相比，TPL與EGFRT790M/L858R突變型編碼產物的結合更穩定，進一步佐證了TPL 聯合吉非替尼的協同抑制作用。有研究表明，TPL 可通過氫鍵與EGFR 結構域中的ATP 結合，結合自由能為-5.69 kcal/mol，且結合是穩定的[14]。本研究結果與上述研究基本一致，提示化合物的結構特征決定了其與EGFR的親和力，這可能也是影響聯用藥物協同效應的重要原因。

由于細胞對藥物的敏感性涉及多種因子和途徑的復雜交替過程，因此揭示聯合靶向治療的特定分子途徑是一項具有挑戰性的工作。PI3K/Akt 途徑是EGFR 下游的一條重要信號通路，EGFR 磷酸化激活后可形成Shc-Grb2-SOS1 復合物，從而激活PI3K，激活的PI3K 可催化磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的生成并進一步促進Akt激活，從而抑制腫瘤細胞凋亡并促進其生長[15—16]。本研究結果顯示，吉非替尼、TPL 單用和兩者聯用均可下調PI3K、Akt 蛋白的表達，且兩者聯用的效果優于吉非替尼、TPL單用。這提示PI3K/Akt通路可能是TPL的潛在作用靶點之一，TPL 聯合吉非替尼具有協同增效的效果。

現代醫學研究表明，自噬與化療敏感性的關系較為復雜，其中MAP1LC3A、MAP1LC3B等蛋白是MAP1LC3/LC3 自噬家族成員，可反映細胞的自噬水平[17]。有研究指出，mTOR 通路與自噬有關，抑制mTOR 通路可部分激活細胞自噬[18]；同時，作為PI3K/Akt 通路下游的重要調控因子，mTOR可促使腫瘤細胞對化療/靶向藥物產生耐藥性[19]?？紤]到誘導自噬與EGFR-TKIs 耐藥有關[20]，本研究檢測了MAP1LC3A、MAP1LC3B、mTOR 蛋白的表達情況。結果顯示，吉非替尼、TPL 單用和兩者聯用均可顯著上調細胞中MAP1LC3A、MAP1LC3B的表達，下調mTOR蛋白的表達，且兩者聯用的效果優于吉非替尼、TPL 單用。這提示H1975 細胞的自噬得以增多，其對藥物的敏感性有所提高；同時，PI3K/Akt/mTOR 通路可能是TPL作用的另一潛在靶點。

綜上所述，TPL 聯合吉非替尼可對EGFRT790M/L858R 突變NSCLC 細胞產生協同抑制作用，其作用可能與下調PI3K/Akt/mTOR 通路和誘導細胞自噬有關。這一結論為TPL的增效作用提供了潛在的研究方向，但仍需后續動物實驗予以驗證。