2021—2022年我國部分地區豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因變異分析

王志遠,劉博奇,許志穎,徐思佳,邢家寶,張桂紅,王 衡*,孫彥闊*

(1.華南農業大學獸醫學院,廣東省臨床重大疾病綜合防控重點實驗室,廣州 510642;2.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心,茂名 525000;3.華南農業大學國家生豬種業工程技術研究中心,廣州 510642;4.廣東海大畜牧獸醫研究院有限公司,廣州 511400)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)在全球范圍內普遍流行,俗稱藍耳病,其病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒[1],直徑50～65 nm[2],基因組長度約15 kb,編碼至少10個開放閱讀框(open reading frame,ORF)。PRRSV共分為兩種基因型,分別為歐洲型毒株(EU genotype)和北美型毒株(NA genotype),歐洲型毒株即PRRSV-1,代表毒株為Lelystad;美洲型毒株即PRRSV-2,代表毒株為ATCC VR2332[3],兩種基因型之間的相似性約為60%[4]。我國境內流行的毒株主要是PRRSV-2,根據ORF5基因分型主要分為4個譜系,即譜系1(NADC30-like毒株和NADC34-like毒株),譜系3(QYYZ和GM2),譜系5.1(VR2332和BJ-4),譜系8.7(CH-1a和JXA1)。1996年我國首次分離到PRRSV,命名為CH-1a,十年后在我國江西省暴發高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS),代表毒株為JXA1,后證實為CH-1a的突變毒株[5]。2010年,QYYZ毒株首次在我國大陸地區發現;2012年,GM2毒株被發現并被推測為是疫苗毒株與QYYZ的重組毒株[6]。2013年,NADC30-like毒株在我國首次報道,自傳入我國以來流行至今,我國流行的NADC30-like毒株表現為中等毒力,具備強大的遺傳進化能力[7]。2018年,我國遼寧省首次檢測到NADC34-like毒株,2020年該毒株以后在我國多個省份流行[8]。

PRRSV ORF5和ORF7基因長期以來一直被視為監測PRRSV遺傳進化的重要靶基因。ORF5基因序列長度約為603 bp,編碼GP5蛋白,該基因擁有重要的中和抗原表位,在誘導免疫應答過程中發揮重要作用,GP5蛋白存在多個潛在的N-糖基化位點,對病毒感染、免疫逃避有著非常重要的作用,因此ORF5是最常被用作分子流行病學監測的基因[9]。ORF7基因序列長度約372 bp,編碼N蛋白,該基因相比ORF5較為保守,也常用于PRRSV的臨床檢測及毒株分型[10],近年來,PRRSV ORF5基因的變異程度日趨復雜,導致ORF5基因序列獲取難度加大,因此ORF7基因具備替代ORF5基因作為PRRSV分子遺傳變異分析的潛力。自2018年非洲豬瘟在我國暴發以來,不斷擴大的疫情對我國養豬行業造成嚴重的打擊,導致PRRSV流行的關注力度明顯下降,進而導致我國PRRSV的分子流行病學數據相對較少。本研究在2021—2022年開展了PRRSV分子流行病學調查,通過獲取PRRSV陽性樣本的ORF5和ORF7基因序列分析PRRSV的主要流行譜系,所有樣品涵蓋13個省份,為了解近年來我國PRRSV的流行變異情況提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

2021—2022年,本課題組在我國黑龍江、吉林、河北、山西、河南、四川、貴州、湖南、廣西、廣東、海南、江西和福建13個省的50個豬場收集了117份疑似PRRS癥狀樣品,樣品類型主要為肺、淋巴結、血清?；疾∝i臨床表現為體溫升高、厭食、呼吸道癥狀、生長遲緩、耳鼻發紺、死亡,以及妊娠母豬出現流產、死胎、產木乃伊胎等。

1.2 引物設計

參考NCBI GenBank中收錄的JXA1、VR2332、CH-1a等毒株序列,利用Oligo7.0軟件分別設計PRRSV ORF5和ORF7基因引物(表1),同時設計PRRSV-1毒株實時熒光定量PCR引物,參照福建省地方標準(DB35/T 1852—2019)設計PRRSV-2實時熒光定量PCR引物,不同基因型引物序列由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

表1 PRRSV ORF5和ORF7引物及擴增片段長度Table 1 PRRSV ORF5 and ORF7 primers and amplified fragment lengths

1.3 樣品處理及測序

所有PRRSV陽性樣品保存于-80 ℃超低溫冰箱,使用超低溫組織研磨儀(JXFSTPRP-CLN-48,上海凈信)將樣品勻漿,使用RNA Fast200(Fastagen)試劑盒提取病毒總RNA,使用qRT-PCR酶(HiScript III U+ One Step qRT-PCR Probe Kit,南京諾唯贊生物科技股份有限公司)鑒定陽性樣品及基因型,反應程序:55 ℃ 15 min;95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,共45個循環。將病毒RNA反轉錄制備cDNA,利用RT-PCR擴增樣品ORF7和ORF5基因,反應程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 60 s,共35個循環;72 ℃ 5 min。PCR產物在10 g·L-1瓊脂糖凝膠中進行電泳,電泳結果在凝膠成像系統中進行可視化分析,將條帶大小位置一致的擴增產物進行Sanger測序以獲取目的序列。

1.4 系統發育學分析及基因變異分析

應用DNA STAR 7.1軟件和MAFFT 7將PRRSV ORF5和ORF7基因序列進行比對,利用Megalign軟件分析不同毒株ORF5和ORF7基因的序列相似性。利用IQ-Tree軟件構建最大似然系統發育樹,應用Figtree v1.4.3軟件將系統發育樹進一步可視化分析。利用EditSeq軟件將PRRSV ORF5基因核苷酸序列轉換為氨基酸序列,利用Jalview軟件分析PRRSV GP5氨基酸突變位點。

2 結 果

2.1 2021—2022年我國部分地區PRRSV臨床樣品檢測結果

2021—2022年,本研究共收集疑似PRRS癥狀患豬樣品117份,其中大部分樣品來自于華南地區,部分樣品來自于我國西南和中部及北部地區(表2),經實時熒光定量PCR鑒定48份樣品為PRRSV陽性,且均為PRRSV-2毒株,應用 RT-PCR成功擴增出38份樣本ORF5基因,使用ORF7引物成功擴增出剩余10份樣品的ORF7基因。

表2 2021—2022年PRRSV臨床樣品收集地分布表Table 2 Geographic distribution of PRRSV clinical sample collections, 2021—2022

2.2 PRRSV ORF5和ORF7基因相似性分析

以PRRSV-2不同譜系代表毒株作為參考毒株,38條ORF5基因序列之間核苷酸相似性為77.1%～99.8%,與 NADC30相似性為82.4%～95.2%,與NADC34相似性為81.9%～96%,與QYYZ相似性為81.1%～91.4%,與GM2相似性為80.4%～90.7%,與VR2332相似性為81.4%～99.3%,與CH-1a相似性為82.9%～96.5%,與JXA1相似性為82.3%～97.7%;其中,GDHZ29與IA/2014/NADC34的相似性高達96%(圖1A)。10條ORF7序列間核苷酸相似性為83.3%～98.7%,與NADC30相似性為86%～96.8%,與NADC34相似性為84.1%～96%,與QYYZ相似性為85.2%～89.8%,與GM2相似性為84.4%～88.4%,與VR2332相似性為87.9%～93.3%,與CH-1a相似性為86.8%～98.1%,與JXA1相似性為86%～98.9%(圖1B)。

圖1 PRRSV ORF5(A)及ORF7基因(B)與不同譜系參考毒株基因相似性分析Fig.1 Gene similarity analysis of ORF5 and ORF7 genes with reference strains of different lineages

2.3 PRRSV ORF5和ORF7基因系統發育學分析

ORF5基因系統發育學分析表明,所有毒株均屬于PRRSV-2,進而劃分為4個分支:譜系1(譜系1.8 NADC30-like毒株24株,譜系1.5 NADC34-like毒株1株),譜系3(QYYZ-like毒株和GM2-like毒株 8株),譜系5.1(VR2332-like毒株2株),譜系8.7(CH-1a-like毒株 2株和JXA1-like毒株 3株)(圖2)。ORF7基因系統發育學分析同樣將所有毒株分為4個分支,其中4株屬于譜系1,4株屬于譜系3,2株屬于譜系8.7(圖3)。根據ORF5和ORF7基因系統發育學分析可知,譜系1毒株共29株(60%),占比最高且地理分布最廣,共在8個省份(8/9)均有檢出;譜系3毒株12株(25%),主要在華南地區檢出;譜系5.1毒株2株(5%),均在廣東省檢出;譜系8.7毒株5株(10%),均在華南地區檢出(圖4,表3)。

▲. 不同譜系代表毒株;●. 本研究中的毒株▲. Representative strains of different lineage; ●. The strains of this study圖2 基于PRRSV ORF5基因的系統發育學分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on PRRSV ORF5 gene

▲. 不同譜系代表毒株;●. 本研究中的毒株▲. Representative strains of different lineage; ●. The strains of this study圖3 基于PRRSV ORF7基因的系統發育學分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on PRRSV ORF7 gene

圖4 2021—2022年PRRSV不同譜系毒株的檢出率Fig.4 Detection rates of different strains of PRRSV lineage from 2021 to 2022

表3 PRRSV不同譜系毒株地理分布表Table 3 Geographical distribution of different strains of PRRSV

2.4 PRRSV GP5氨基酸位點分析

GP5氨基酸序列分析表明信號肽(aa 1—26)、潛在N-糖基化位點(aa 32—35、aa 44、aa 51)及表位C(aa 52—61)區域氨基酸突變程度最復雜,其他區域的氨基酸突變均具有譜系一致性(圖5、6)。以VR2332為參考毒株,不同譜系毒株存在個別氨基酸位點相似性(譜系1、譜系3、譜系8.7毒株大部分均為E3G、S16F、A29V、D34 N、F127 L、A137S、R165 G、V185A)。GP5潛在的N-糖基化位點共有6個,其中2個N-糖基化位點44和51相對保守,4個N-糖基化位點32、33、34、35處于高變區,譜系5.1毒株存在2種點突變(S32 N、D34 G),譜系8.7毒株存在6種點突變(S32 N、N33S、D34S/N、S35 N/H),譜系3毒株存在6種點突變(S32 N/E、N33 G/Q/T、D34 N),譜系1毒株存在5種點突變(S32 G/D、N33K、D34 H、S35 N),在表位C區域(aa52-61 中和表位),譜系5.1存在3種點突變(D54E、A57 G、K59 N),譜系8.7存在5種點突變(A57 N、N58Q/D、K59 H、D61S),譜系3存在11種點突變(A57 N、N58 T/K/D/S/E、K59 N/R/S、D61E/Y)。

紅色框. 信號肽;黑色框. 跨膜區;黃色框. T細胞表位;黑色曲線框. 潛在的N-糖基化位點;黑色陰影框.非中和表位和中和表位區域Red box. Signal peptide; Black box. Transmembrane region; yellow box. T cell epitope; Black curved box. Potential N-glycosylation site; Black shaded box. Non-neutralizing epitope and neutralizing epitope region圖5 譜系3、譜系5.1和譜系8.7 PRRSV GP5氨基酸位點變異分析Fig.5 Analysis of amino acid residue variants in PRRSV GP5 in lineage 3, lineage 5.1 and lineage 8.7

紅色框. 信號肽;黑色框. 跨膜區;黃色框. T細胞表位;黑色曲線框. 潛在的N-糖基化位點;黑色陰影框.非中和表位和中和表位區域Red box. Signal peptide; Black box. Transmembrane region; yellow box. T cell epitope; Black curved box. Potential N-glycosylation site; Black shaded box. Non-neutralizing epitope and neutralizing epitope region圖6 譜系1 PRRSV GP5氨基酸位點變異分析Fig.6 Analysis of amino acid residue variants in PRRSV GP5 of lineage 1

3 討 論

自PRRSV首次在我國檢出以來已有20余年流行史,其遺傳進化歷程總體分為三個階段:第一階段為1996—2006年,優勢流行毒株為CH-1a;第二階段為2006—2013年,優勢流行毒株為JXA1;第三階段為2013年至今,優勢流行毒株為NADC30-like[6]。盡管我國進行了廣泛的疫苗免疫,由于PRRSV基因組的高度變異性導致新毒株層出不窮,使得常規疫苗的交叉保護效力并不理想。2018年以來,非洲豬瘟疫情的暴發給我國生豬養殖業帶來了嚴重打擊,同時使我國養豬業生物安全防護意識極大提高。然而,由于PRRSV自身遺傳進化、對外頻繁引種、疫苗使用不當等原因導致豬群免疫選擇壓力增大,使PRRSV得以傳入并迅速發生遺傳變異;此外,非洲豬瘟大流行背景下使養殖戶對PRRSV防控意識下降,伴隨著全國范圍內生豬大批量復養,豬存欄數量劇增,使PRRSV得到了再一輪的流行[11]。因此,即便在非洲豬瘟流行的大背景下,PRRSV的流行力度未能降低[12]。同時,由于對PRRSV關注力度下降,導致PRRSV分子流行病學調查的數據相對較少。開展PRRSV流行病學調查研究有重要意義,流行病學調查將有助于了解PRRSV最新的遺傳變異情況。在2021—2022年,本研究共收集了117份臨床疑似PRRSV感染樣品,經實時熒光定量PCR檢測均為PRRSV-2,總體陽性率為41%(48/117),ORF5和ORF7基因系統發育分析將所有的序列分為4個譜系(譜系1、譜系3、譜系5.1、譜系8.7),譜系1毒株數量最多(29/48),其次是譜系3(12/48),譜系8.7(5/48)和譜系5.1(2/48)少量檢出。有研究表明NADC30-like毒株已成為華中地區PRRSV主要流行譜系[13];福建省PRRSV主要流行毒株是以NADC30-like毒株為主要親本的重組病毒[14];綜合本研究結果顯示NADC30-like毒株已代替HP-PRRSV成為全國范圍內PRRSV主要流行毒株,NADC30-like毒株基因組變異程度極高,表現出強大的基因重組能力,有報道稱NADC30-like毒株極易與HP-PRRSV發生重組,從而增加了田間流行毒株的復雜性,導致不同毒力的新毒株出現[3,15],NADC30-like毒株的廣泛流行是當下我國PRRSV防控需要迫切關注的問題。譜系3毒株目前依舊在華南地區廣為流行,有研究表明譜系3毒株的核苷酸變異率為9.85×10-3位點·年-1,近幾年與譜系8.7毒株重組導致的高毒力毒株在華南地區廣泛流行[16]。譜系5.1毒株多為疫苗毒株,與臨床疫苗(Resp PRRS MLV)廣泛使用有密切的聯系。NADC34-like毒株在我國出現時間相對較晚,但2020年以來在全國范圍內波及的區域越來越廣[17],本研究于2021年在廣東省惠州市檢出一株NADC34-like毒株,與IA/2014/NADC34相似性為96%,證明NADC34-like毒株由我國北方地區(遼寧省、黑龍江省、河南省)[8]傳入華東(福建省)和華南地區(廣東省),結合相關報道可知NADC34-like毒株已經在廣東省發生潛在流行[18]。

PRRSV GP5與病毒免疫逃避及免疫保護密切相關,GP5蛋白區域的突變影響信號肽的裂解、N-糖基化位點的數量以及中和抗體對PRRSV變異體的識別[19-20]。GP5氨基酸突變分析表明,廣泛的突變位點分布在整個基因,信號肽、中和表位C及潛在的N-糖基化位點三個區域的突變程度最顯著,不同數量的N-糖基化位點可能會影響病毒復制和誘導中和抗體的能力,并可能有助于病毒通過聚糖屏蔽逃避抗體中和[21], 表位C區域的氨基酸突變可能導致同源中和失效[22]。

綜上所述,當下我國PRRSV的流行譜系以譜系1為主,同時譜系3和譜系8.7共存。其中,NADC30-like毒株檢出率最高且流行區域最為廣泛,NADC34-like毒株已經在華南地區出現并流行,多譜系毒株共存及譜系1毒株的廣泛流行的現狀給國內PRRSV的防控工作帶來了巨大的挑戰。NADC30-like毒株傳入我國以來,遺傳進化速度極快,極易與不同譜系毒株發生基因重組,導致PRRSV不同毒株的基因分型更加難以定性[23-24]。同時,我國PRRSV常規疫苗大多基于譜系8毒株研制,對于復雜多變的譜系1毒株的交叉保護效果不佳,不同疫苗的濫用也使得PRRSV控制難度加大[25]。同時,本研究發現譜系3毒株依然局限在華南部分地區流行,但流行率逐年增高,需要我們重視該譜系毒株的流行程度并及時加以控制。面對國內PRRS流行日趨復雜的現狀,需要人們更大力度建立生物安全防控,以及加強流行病學調查用以動態分析PRRSV的遺傳變異情況。本研究為國內PRRS流行現狀給出了最新的數據支撐,也給未來臨床防控策略制定提供了參考依據。

4 結 論

多個譜系豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)同時在我國流行,譜系1已替代譜系8.7成為主要流行譜系,并分布于我國大多數省份;譜系3僅次于譜系1,主要在華南局部地區流行;譜系8.7毒株檢出率較低。近幾年來,PRRSV在我國的流行日趨復雜,譜系1毒株的廣泛流行增加了PRRSV的遺傳多樣性。