SYNGR2影響豬圓環(huán)病毒2型體外增殖的研究

梁凱欣,鐘海文,宋長緒,楊化強,黃思秀,徐 錚

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心,廣州 510642)

豬圓環(huán)病毒 2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是豬圓環(huán)病毒中常見且危害較大的致病亞型,因其傳播性、變異性較強[1],目前PCV2及多個變種毒株在我國各地豬場廣泛傳播[2]。PCV2在感染過程中多與豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等其他病毒協(xié)同感染[3-5],引發(fā)仔豬斷奶后多系統(tǒng)消耗綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的發(fā)生[6],并導致仔豬免疫抑制[7],給相關(guān)疾病的預防及治療增添難度,且極大影響?zhàn)B殖效率及成本。PCV2主要通過和不同的宿主因子互作來完成自身生命周期[8-10]。因此,探究參與PCV2感染的關(guān)鍵宿主因子可以為病毒感染機制及抗病育種研究提供重要思路。

Synaptogyrin-2 (SYNGR2)被證實參與神經(jīng)囊泡和微囊泡組成,在除腦以外組織中高表達。在果蠅體內(nèi),缺失SYNGR2會造成突觸囊泡的發(fā)生受阻,在哺乳動物體內(nèi)SYNGR2的詳細功能仍然研究較少[11]。除神經(jīng)囊泡外,SYNGR2還參與了葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter-4,GLUT4)的胞內(nèi)循環(huán),SYNGR2參與組成的囊泡可將質(zhì)膜上的GLUT4轉(zhuǎn)移至反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(trans Golgi network,TGN)或溶酶體[12]。在病毒感染方面,SYNGR2可通過與病毒蛋白、脂筏等宿主因子結(jié)合形成復合體的形式參與發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)的包涵體組成,協(xié)助病毒復制[13]。在細胞膨脹毒素(cytolethal distending toxin,Cdt)內(nèi)化的過程中,SYNGR2也通過相似的方式與毒素活性亞基CdtB、脂筏結(jié)合。SYNGR2敲低的人巨噬細胞可抵御毒素引起的炎癥反應[14]。

Walker等[15]基于樣本量為974的豬群,通過全基因組關(guān)聯(lián)分析揭示了SYNGR2可促進PCV2感染,并且發(fā)現(xiàn)了位于SYNGR2關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域中的唯一SNP位點,在此位點存在針對豬的物種特異抗性突變SYNGR2 p.Arg63Cys,個體的PCV2抗性跟該位點的基因型直接相關(guān)。作者通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,對比國內(nèi)外幾種主要豬種的基因型與樣本中包含該SNP的幾種主要單倍型,發(fā)現(xiàn)在杜洛克等外來品種中SYNGR2 p.63Cys基因頻率較高,且該抗性突變在我國本土品種中較少見,揭示SYNGR2可能成為我國PCV2抗性豬培育的切入點。

本研究首先在體外驗證宿主因子SYNGR2及錯義突變SYNGR2 p.Arg63Cys對PCV2在PK15細胞上增殖的影響,并通過轉(zhuǎn)錄組分析研究與SYNGR2功能相關(guān)的基因變化,尋找與SYNGR2關(guān)聯(lián)的其他PCV2感染相關(guān)宿主因子,研究PCV2與宿主的相互作用,揭示PCV2感染宿主的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒及質(zhì)粒

PK15細胞、PCV2毒株(PCV2-JS17-8,GenBank編號:MH211363.1)、pX330質(zhì)粒為本實驗室保存;兩種SYNGR2過表達質(zhì)粒(Arg型和Cys型)由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑

RaPure Viral RNA/DNA Kit購自美基生物公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、DNA Ligation Kit、PrimeScript RT Master Mix購自TaKaRa公司;2×Rapid Taq Master Mix購自諾唯贊公司;Lipofectamine 3000購自Thermo Fisher公司。

1.3 SYNGR2敲除、過表達及點突變對PCV2增殖水平影響的鑒定

1.3.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建SYNGR2基因敲除PK15細胞系 設計靶向SYNGR2外顯子區(qū)域的gRNA,gRNA識別SYNGR2基因第2外顯子上的靶位點序列:GTACTGCTCTCCGGACTTG。合成gRNA相應的Oligo DNA(合成序列見表1SYNGR2-exon2-gRNA-F和SYNGR2-exon2-gRNA-R所示),經(jīng)過退火并連接入CRISPR打靶載體pX330,形成pX330-SYNGR2 gRNA質(zhì)粒。將pX330-SYNGR2 gRNA質(zhì)粒以電穿孔轉(zhuǎn)染入PK15細胞,經(jīng)過G418篩選獲得穩(wěn)定敲除SYNGR2的單克隆細胞。逐個挑取單克隆細胞,抽提基因組DNA后以PCR擴增SYNGR2打靶位點附近的基因組序列進行測序檢測,CRISPR打靶位點處含有純合移碼突變的細胞克隆即為SYNGR2基因敲除(KO)細胞系。經(jīng)過同樣篩選過程但是目的位點未發(fā)生敲除的細胞用作野生型(WT)對照細胞。SYNGR2基因型鑒定引物見表1 SYNGR2-exon2-F和SYNGR2-exon2-R所示。

表1 本研究用到的引物和寡聚核苷酸序列Table 1 Primer and oligo sequences used in this study

1.3.2 SYNGR2蛋白表達分析 采用Western blot方法檢測基因敲除細胞中SYNGR2蛋白的表達情況。WT和KO細胞以RIPA裂解液進行裂解,將等量細胞裂解液上樣進行SDS-PAGE分離蛋白。電泳完畢后將蛋白進行轉(zhuǎn)膜,并對蛋白膜進行封閉和SYNGR2一抗(Rabbit polyclonal to Synaptogyrin 2,ab106459,Abcam)孵育。此后對蛋白膜以TBST進行洗滌并繼續(xù)孵育HRP標記的羊抗兔IgG二抗,洗滌后進行ECL曝光,獲取目的蛋白信號。

1.3.3 SYNGR2過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細胞 以PK15細胞的cDNA作為模版擴增SYNGR2編碼區(qū)序列,并連接入pcDNA3.1載體構(gòu)建SYNGR2過表達載體。轉(zhuǎn)染前將PK15細胞鋪于24孔板中,待第2天細胞長滿后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 3000說明書步驟進行。

1.3.4 SYNGR2突變體PK15細胞篩選 PK15細胞系為SYNGR2 p.63Arg基因型,為了獲取SYNGR2 p.63Cys型PK15,采用CRISPR介導的同源重組方案進行目的位點突變操作。作者設計了覆蓋突變位點處的200 bp的單鏈DNA作為同源修復模板,并將模板中的編碼SYNGR2 p.63Arg的核苷酸突變?yōu)門GC(對應氨基酸為Cys)。將單鏈模板和pX330-SYNGR2 gRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PK15細胞,進行G418篩選,獲得單克隆細胞。逐個挑取單克隆細胞,抽提基因組DNA后以PCR擴增SYNGR2打靶位點附近的基因組序列進行測序檢測,目的位點處含有純合T/T或雜合T/C的細胞系為陽性突變細胞系。

1.3.5 PCV2感染PK15細胞 細胞以2×105·mL-1密度鋪板后24 h內(nèi),將PCV2儲存液以DMEM進行稀釋后,以MOI=1的劑量進行細胞感染。病毒于37 ℃吸附2 h后換DMEM繼續(xù)培養(yǎng),在對應時間點收集細胞和上清,凍融2次后釋放病毒,抽提病毒DNA進行定量檢測。病毒增殖情況,通過qPCR結(jié)合標準曲線計算病毒拷貝數(shù)或通過2-ΔΔCt法計算相對病毒量。病毒生長曲線需分別收獲感染后0、12、24、48、72 h各時間點細胞及上清樣品,通過qPCR計算病毒拷貝數(shù)。qPCR所用引物和探針見表1。qPCR體系包括Probe qPCR Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,探針0.2 μL,病毒DNA模板2 μL,ddH2O 7 μL。反應程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個循環(huán)。

1.4 SYNGR2 KO PK15細胞及野生型細胞轉(zhuǎn)錄組測序

1.4.1 原始數(shù)據(jù)過濾及質(zhì)量評估 對測序所得的reads采用Cutadapt去除3′端帶接頭的序列,并去除平均質(zhì)量分數(shù)低于Q20的reads。利用單堿基質(zhì)量分布圖、堿基含量分布、reads平均質(zhì)量分布來評估測序質(zhì)量。

1.4.2 基因組比對及基因表達差異分析 利用HISAT2將reads比對到參考基因組上。將統(tǒng)計到成功比對到各基因的read count作為各基因的原始表達量,采用DESeq對基因表達量進行差異分析,分析標準為P-value <0.05,log2(Fold Change)>1。

1.4.3 基因表達模式聚類分析 對各組樣品中差異表達基因的表達量通過取log2(FPKM+1)的方式標準化,再通過計算Zscore對不同樣品同一基因表達量進行標準化,將標準化后的基因表達量代入ORIGIN 2021軟件繪制聚類熱圖。

1.4.4 GO富集分析及KEGG通路分析 使用TopGO進行GO富集分析,通過計算P-value篩選差異基因顯著富集的GO term;對差異表達基因進行KEGG富集分析,通過計算FDR值篩選被顯著富集到的通路。

1.5 PK15細胞中MYRIP、RAB27A、RAB27B等宿主因子mRNA表達量檢測

提取細胞中的總RNA,根據(jù)各樣品中RNA濃度適當稀釋后,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒去除樣品中的DNA并將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將得到的cDNA產(chǎn)物稀釋10倍后作為RT-qPCR模板,利用SYBR法進行定量PCR擴增和檢測,根據(jù)2-ΔΔCt方法計算得到相對定量結(jié)果。qPCR所用引物和探針見表1。qPCR體系包括SYBR Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O 7.2 μL。反應程序:95 ℃預變性 30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,40個循環(huán);熔解曲線反應條件為95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min。

1.6 不同品種豬群中SYNGR2等位基因頻率分析

基于29個豬種全基因組測序數(shù)據(jù),針對突變SYNGR2 p.Arg63Cys發(fā)生的SNP位點進行序列比對,統(tǒng)計該SNP位點中各等位基因出現(xiàn)的次數(shù)并計算相應的等位基因頻率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究采用GraphPad Prism 9的Ttest及one-way ANOVA進行差異顯著分析,ns表示P>0.05,差異不顯著;*、**、***、****分別表示P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1,代表差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同豬群中SYNGR2等位基因頻率分析

針對國內(nèi)外不同品種豬的群體遺傳學分析表明,在杜洛克、大白豬等外來品種豬群中SYNGR2 p.Arg63Cys突變發(fā)生頻率較高,而在國內(nèi)大部分豬群中未檢測到這一突變(表2),此結(jié)果與之前的研究相符[15]。

表2 不同豬群中SYNGR2的等位基因頻率Table 2 Summary of allele frequencies of SYNGR2 in different pig breeds

2.2 敲除SYNGR2抑制PCV2體外增殖

將構(gòu)建的靶向SYNGR2第2外顯子區(qū)域的CRISPR/Cas9打靶質(zhì)粒電轉(zhuǎn)PK15細胞,篩選SYNGR2基因敲除的單克隆。以打靶位點處含有雙等位移碼突變的細胞作為陽性克隆,并通過Western blot檢測SYNGR2蛋白的表達情況(圖1A)。SYNGR2基因敲除細胞標記為SYNGR2 KO細胞,同時將經(jīng)過同樣篩選的野生型細胞(WT)用作對照。PCV2以MOI=1感染KO細胞和對照WT細胞,感染后48 h,凍融細胞釋放病毒,通過qPCR檢測病毒拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,WT組增殖的病毒量顯著高于SYNGR2 KO組細胞(圖1B)。

A. 基因敲除PK15細胞的SYNGR2蛋白表達分析,紅色星號表示目的蛋白條帶;B. PCV2感染野生型和SYNGR2基因敲除型PK15細胞48 h的病毒拷貝數(shù);C、D. PCV2在野生型和SYNGR2基因敲除型PK15細胞上的生長曲線(C圖為細胞上清中病毒,D圖為胞內(nèi)病毒)。*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;****. P<0.000 1A. Western blot assay of SYNGR2 expression in gene KO cells, SYNGR2 protein signal is denoted by red asterisk; B. PCV2 viral copies in WT and SYNGR2-KO PK15 cells infected with PCV2 for 48 h; C, D. Growth curves of PCV2 in WT and SYNGR2-KO PK15 cells (Fig.C shows the viral growth level in supernantant of infected cells, and Fig.D shows the viral growth level within cells). *. P<0.05;**. P<0.01; ***. P<0.001; ****. P<0.000 1圖1 PCV2在SYNGR2敲除PK15細胞上的增殖情況Fig.1 PCV2 proliferation level on SYNGR2 KO PK15

進一步對各時間點細胞與上清病毒拷貝數(shù)定量,繪制生長曲線,對比發(fā)現(xiàn),SYNGR2 KO細胞中上清及細胞內(nèi)PCV2病毒量在感染后第48、72小時低于WT組(圖1C)。以上結(jié)果表明SYNGR2基因敲除可抑制PCV2在PK15上的增殖。

2.3 過表達SYNGR2補償PCV2在SYNGR2敲除細胞上的增殖能力

將構(gòu)建好的SYNGR2過表達質(zhì)粒通過脂質(zhì)體分別瞬時轉(zhuǎn)染SYNGR2敲除細胞及野生型細胞,定量PCR結(jié)果檢測顯示過表達Arg和Cys型SYNGR2比野生型細胞的SYNGR2 mRNA水平高30倍左右(圖2A)。SYNGR2敲除細胞轉(zhuǎn)染后以MOI=1接種PCV2,過表達SYNGR2補償PCV2在SYNGR2敲除細胞上的增殖能力(圖2C),證明SYNGR2敲除是PCV2增殖受阻的影響因素。野生型細胞過表達SYNGR2后以MOI=1接種PCV2,對比未處理的野生型細胞,感染PCV2 48 h后,PCV2病毒含量無顯著差異(圖2B)。以上結(jié)果證實SYNGR2敲除抑制PCV2體外增殖,在敲除細胞上進一步補償SYNGR2可以增加PCV2的復制能力。但是在野生型細胞過表達SYNGR2無法顯著促進PCV2體外增殖,原因可能是SYNGR2在細胞正常生理狀態(tài)下高表達,因此過表達后表型差異不顯著。

A. SYNGR2過表達后的SYNGR2 mRNA水平分析;B. 野生型PK15過表達Arg和Cys型SYNGR2后對PCV2復制水平的影響;C. SYNGR2敲除的PK15細胞過表達Arg和Cys型SYNGR2后對PCV2復制水平的影響。**. P <0.01;***. P <0.001;****. P <0.000 1A. Determination of SYNGR2 mRNA levels after overexpression of SYNGR2 in PK15 cells; B. PCV2 viral copies in WT PK15 transfected with SYNGR2-Arg and SYNGR2-Cys expressing plasmids and infected with PCV2 for 48 h; C. PCV2 viral copies in SYNGR2-KO PK15 transfected with SYNGR2-Arg and SYNGR2-Cys expressing plasmids and infected with PCV2 for 48 h. **. P <0.01; ***. P <0.001; ****. P <0.000 1圖2 SYNGR2敲除細胞及野生型細胞過表達不同基因型SYNGR2后PCV2的增殖情況Fig.2 PCV2 proliferation on WT PK15 or SYNGR2 KO PK15 over-expressing SYNGR2 with different genotypes

2.4 SYNGR2 p.Arg63Cys點突變降低PCV2體外增殖能力

PK15細胞的SYNGR2為Arg基因型,為了檢測Arg和Cys兩種基因型對PCV2復制能力的影響,作者對PK15細胞進行點突變,獲得SYNGR2-Cys型的PK15細胞。PCV2感染SYNGR2野生型(SYNGR2-Arg)及構(gòu)建好的突變PK15細胞(SYNGR2-Cys)。與野生型細胞相比,感染48 h后突變PK15細胞上的病毒含量顯著降低(P<0.01)(圖3A)。細胞及上清內(nèi)的PCV2生長曲線趨勢也表明SYNGR2-Cys型細胞中PCV2增殖較SYNGR2-Arg型細胞差(圖3B)。以上結(jié)果說明SYNGR2 p.Arg63Cys突變后可提高PK15細胞對PCV2的抗性。

A. PCV2感染野生型和SYNGR2 p.Arg63Cys突變型PK15細胞48 h的病毒拷貝數(shù);B、C. PCV2在野生型和SYNGR2 p.Arg63Cys突變型PK15細胞上的生長曲線(B圖為細胞上清中病毒,C圖為胞內(nèi)病毒)。**. P <0.01;***. P <0.001A. PCV2 viral copies in WT and SYNGR2 p.Arg63Cys mutant PK15 cells infected with PCV2 for 48 h; B,C. Growth curves of PCV2 in WT and SYNGR2 p.Arg63Cys mutant PK15 cells (Fig.B shows the viral growth level in supernantant of infected cells and shows the viral growth level within cells). **. P <0.01; ***. P <0.001圖3 PCV2在SYNGR2 p.Arg63Cys點突變PK15細胞上的增殖情況Fig.3 PCV2 replication level in PK15 with SYNGR2 p.Arg63Cys mutation

2.5 SYNGR2基因敲除細胞的轉(zhuǎn)錄組分析

為了探究SYNGR2在PCV2感染中的功能,對SYNGR2敲除細胞及野生型細胞進行轉(zhuǎn)錄組水平高通量測序。每組分別檢測3株KO或WT型細胞,平均每個樣品測得reads數(shù)約為440 000,其中絕大部分reads被正確識別(>99.9%),說明測序質(zhì)量良好。對RNAseq數(shù)據(jù)進行質(zhì)控篩選后,將篩選后數(shù)據(jù)以NCBI的Sscrofa11.1為參考基因組進行比對,平均94%左右的clean reads被成功匹配到特定基因。以P-value<0.05,log2(Fold Change)>1為表達量差異顯著條件篩選匹配到的基因。結(jié)果顯示,SYNGR2敲除后,共有176個基因表達量顯著上調(diào),85個基因表達量顯著下調(diào)(圖4A、B)。

A. 火山圖展示SYNGR2野生型和敲除型PK15細胞差異表達基因的分布;B. SYNGR2野生型和敲除型PK15細胞上上調(diào)和下調(diào)差異表達基因數(shù)A. Volcano plot showing distribution of differentially expressed genes between WT and KO cells; B. The numbers of differentially expressed genes with up-regulation and down-regulation between WT and KO cells圖4 SYNGR2基因敲除與野生型PK15細胞的差異表達基因分析Fig.4 Differentially expressed gene analysis between SYNGR2-KO and WT PK15 cells

對所有差異表達基因進行GO和KEGG通路富集分析,篩選富集到SYNGR2的通路,統(tǒng)計這些通路中包含的差異表達基因(DEG)并進一步分析。篩選共得到196個與SYNGR2功能相關(guān)的差異表達基因,包括細胞免疫相關(guān)的防御素β1(defensin beta 1,DEFB1)、參與組成胞吐囊泡的MYRIP及抗原呈遞相關(guān)的豬白細胞抗原Ⅱ型(swine leukocyte antigen-Ⅱ,SLAⅡ)基因等。196個SYNGR2功能相關(guān)差異表達基因在兩組細胞中的差異情況如圖5所示。其中最顯著上調(diào)和下調(diào)的10個基因信息見表3所示。進一步的GO富集分析結(jié)果顯示,差異表達基因與膜成分、囊泡組成及被膜細胞器組成等密切相關(guān)(圖6A、B),揭示SYNGR2在細胞中的主要功能為參與組成膜成分組成及相關(guān)囊泡運輸。

圖5 SYNGR2功能相關(guān)差異表達基因聚類熱圖Fig.5 Clustering heat map of SYNGR2-related differentially expressed genes

A. SYNGR2功能相關(guān)差異表達基因GO分析條形圖;B. SYNGR2功能相關(guān)差異表達基因GO分析餅圖A. Bar plot for GO analysis of SYNGR2 associated DEGs; B. Pie chart for GO analysis of SYNGR2 associated DEGs圖6 SYNGR2功能相關(guān)差異表達基因GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of differentially expressed genes functionally related to SYNGR2

表3 前10名顯著上調(diào)差異表達基因及前10名顯著下調(diào)差異表達基因Table 3 The top 10 DEGs for upregulation and downregulation between SYNGR2 KO and WT cells

2.6 SYNGR2基因敲除影響囊泡相關(guān)蛋白RAB27A的轉(zhuǎn)錄

作者對富集到囊泡相關(guān)功能的宿主因子MYRIP進一步研究。由于MYRIP在PK15細胞中表達豐度過低,無法通過qPCR檢測其mRNA表達量。MYRIP是RAB27特異的結(jié)合蛋白,通過qPCR檢測兩種細胞中RAB27A、RAB27B的mRNA表達量,結(jié)果顯示,RAB27A在SYNGR2敲除后,mRNA表達量提升約1.4倍(圖7)。

****. P<0.0001圖7 SYNGR2基因敲除細胞及野生型細胞中RAB27A mRNA的表達差異Fig.7 Differential expression levels of RAB27A mRNA between SYNGR2-KO and WT PK15

為了探究RAB27A與PCV2感染之間的關(guān)系,作者比較了PCV2感染及未感染情況下細胞中RAB27A表達量,結(jié)果顯示PCV2感染對細胞內(nèi)RAB27A mRNA表達量沒有顯著影響。對PCV2感染及未感染細胞中的SYNGR2 mRNA表達量進行檢測,二者差異也不顯著(結(jié)果未展示)。

3 討 論

SYNGR2是四跨膜蛋白超家族(tetraspanins,tspans)成員,tspan蛋白可通過在細胞膜上聚集形成tspan富集的微結(jié)構(gòu)域(tspan-enriched microdomains,TEM),召集受體等功能蛋白至TEM后,tspan通過結(jié)合不同功能蛋白,可參與病毒感染吸附[16]、內(nèi)化[17]、胞內(nèi)運輸[18]、病毒復制[19]、胞間運輸?shù)雀腥倦A段[20]。SYNGR2可通過與病毒蛋白及其他宿主因子結(jié)合參與病毒感染[13],但SYNGR2的具體功能及作用機制仍未知。已有研究報道SYNGR2與PCV2引起的病毒血癥相關(guān),且SYNGR2點突變導致了可抑制體內(nèi)PCV2病毒載量增加的抗性突變體產(chǎn)生[15]。由于SYNGR2參與組成的微囊泡在多種細胞類型中普遍存在[21],結(jié)合上述研究,推測SYNGR2可能通過形成包裹病毒蛋白的病毒囊泡來協(xié)助PCV2等病毒感染。

本研究首先通過對PK15細胞中SYNGR2進行敲除、回補、定點突變驗證了SYNGR2對PCV2體外增殖的影響。試驗結(jié)果表明,敲除SYNGR2后攻毒,感染后48 h病毒拷貝數(shù)顯著低于相同處理的野生型細胞,感染后0～72 h內(nèi)生長曲線反映了相同趨勢;對敲除SYNGR2的細胞過表達SYNGR2回補后發(fā)現(xiàn),病毒拷貝數(shù)顯著提高,證實SYNGR2是PCV2拷貝數(shù)變化的因素之一。對Arg/Cys定點突變型細胞進行PCV2感染,感染后48 h病毒拷貝數(shù)顯示Cys型細胞抗性較Arg型細胞強。以上結(jié)果說明SYNGR2可促進PCV2體外增殖,并且突變SYNGR2 p.Arg63Cys發(fā)生位點是在SYNGR2參與PCV2感染過程中發(fā)揮主要作用的關(guān)鍵SNP位點。

本研究通過分析SYNGR2 KO細胞及WT型細胞的RNA-seq數(shù)據(jù),根據(jù)富集分析結(jié)果進一步篩選與SYNGR2相關(guān)數(shù)據(jù)進行后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),SYNGR2主要參與膜成分、囊泡等被膜細胞器組成,由差異表達基因MYRIP調(diào)節(jié)的外泌體分泌相關(guān)基因RAB27A[22]mRNA表達量在SYNGR2敲除或PCV2感染條件下顯著提高。研究報道,在SYNGR2敲除或者發(fā)生SYNGR2 p.63Cys點突變后,細胞內(nèi)外PCV2拷貝數(shù)之比明顯減小,研究者猜測這是由于PCV2內(nèi)化或者胞內(nèi)運輸受阻導致。由于PCV2感染的PK15細胞可分泌包含PCV2的外泌體[23],結(jié)合RAB27A參與組成的外泌體可協(xié)助塞內(nèi)卡病毒(Seneca Valley virus, SVV)[24]、PRRSV[25]、甲肝病毒(hepatitis A virus,HAV)和丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV)[26]內(nèi)化及免疫逃逸,作者推測RAB27A和SYNGR2可以通過組成囊泡參與PCV2運輸協(xié)助其體外感染PK15,這也可以解釋為何SYNGR2敲除后,PCV2內(nèi)化、胞內(nèi)運輸受阻,但仍有部分病毒可以正常增殖[27]。RAB27A在單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV-1)感染過程中與病毒蛋白共定位于囊泡,且RAB27A敲降可顯著抑制HSV-1感染,但qPCR及免疫熒光均未檢測到感染期間RAB27A表達量變化[28]。本研究同樣未能檢測到PCV2感染對SYNGR2及RAB27A表達的影響,其潛在機制可能與PCV2與宿主因子的互作模式相關(guān),病毒蛋白可誘導宿主因子轉(zhuǎn)移至病毒囊泡內(nèi),從而挾持宿主因子參與自身感染,但此過程不一定涉及宿主因子表達水平的改變,SYNGR2及RAB27A參與PCV2感染的具體機制還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

SYNGR2是支持PCV2在PK15細胞增殖的關(guān)鍵宿主因子,缺失SYNGR2顯著影響PCV2的體外增殖。通過對SYNGR2 敲除細胞及野生型細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達基因分析、富集分析,本研究揭示了SYGNR2及RAB27A在PCV2感染過程中潛在的功能。