亞硝酸鹽對鲆鰈類急性毒性影響研究進展

葛偉宏 趙心冉 劉栩華 吉 情 李云婷 曹 梅* 王興強于佳辰 于潤川

（1江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇連云港 222005；2連云港海之源水產育苗有限公司，江蘇連云港 222005）

鲆鰈類是一種富含多種營養成分的魚類，因它含有人體所需要的元素，且肉質鮮美、口感細膩，目前已成為中國人民餐桌上常見的食物。同時，鲆蝶類生長速度快、食性廣、養殖周期短、效益高的特點，已使其成為中國海水養殖業中最具有代表性的產業之一。亞硝酸鹽是水生環境常見污染物，對水生生物具有毒性。鲆鰈類在國內外的水產養殖中占有重要地位，被廣泛集約化養殖。本文總結了亞硝酸鹽的來源、毒性機理以及其對水產養殖生物的危害，綜述了硝酸鹽對鲆鰈類組織器官、應激反應、生理功能、免疫應答以及細胞凋亡方面的影響。[1]。

1 亞硝酸鹽的來源和毒性機理

亞硝酸鹽（NO2-）是水生環境中常見的污染物，對水生生物具有毒性。在天然水體中，亞硝酸鹽濃度通常低于0.1 mg/L。鲆鰈類主要在室內水池中進行高密度養殖及生產，養殖系統包括再循環和流經系統，其中海水經常被重復利用以節省能源，水質情況是影響魚類品質和生產水平的最重要因素之一[2-3]，因此有必要對此進行嚴格的水質控制。水體生態正常時，亞硝酸鹽等有害物質可以通過硝化細菌的作用被轉化為無毒的物質，或者被水中藻類生物利用變成無毒的氮氣。這樣可以使水體環境處于自凈平衡的狀態。然而，當水體中污染物超過了水體自我凈化的能力時，水質惡化。這會增加水中有害物質的含量，對水生生物健康產生威脅，影響水體生態平衡。

亞硝酸鹽對動物的致毒機理：①亞硝酸鹽會影響魚、蝦、蛙等動物體內的抗氧化酶活性，溶菌酶的活力和脾細胞的呼吸爆發力，從而降低動物的免疫能力；②亞硝酸鹽還會將動物體內血紅蛋白球中的血紅蛋白轉化為高鐵血紅蛋白，從而導致組織內缺氧，細胞膜的通透性改變，組織自溶性提高以及組織壞死等病理現象。目前，亞硝酸鹽對水生動物毒性效應方面的研究，多見于魚、蝦和鱉等[2]。

在海水魚類中，亞硝酸鹽攝取的途徑已被證明發生在腸道和鰓上皮[3]。一些研究還發現，亞硝酸鹽濃度過高會減緩海魚的生長，擾亂離子平衡，并引起缺氧應激，但亞硝酸鹽毒性的分子機制尚未完全了解[4]。關于亞硝酸鹽對鲆鰈類以及整個魚類的毒性機理研究一直在進行。

2 亞硝酸鹽的主要協同因子

導致亞硝酸鹽中毒的主要因子包括接觸時間、電離強度、鐵離子數量、pH 和溶氧濃度等。亞硝酸鹽對魚的毒性與接觸時間有關。在接觸時間不超過24 h 時，其半致死劑量（LD50/LCt50）通常高于最高值。但隨著接觸時間的延長，其毒性逐漸減弱。此外，相同含量的亞硝酸鹽在中等分子強度的軟水體中比硬水體毒性更強，在淡水中比在海水中毒性更強。水的離子種類也可以降低對亞硝酸鹽的毒害，較高的氯離子濃度（鹽濃度）能夠顯著減少亞硝酸鹽對魚類的侵害。而溴化物的分子也能以競爭通道的方式，從而抑制亞硝根物質滲透到魚鰓的上表層細胞。較好的氯化物分子與亞硝根離子比率可抑制亞硝酸鹽進入血液，從而減少其“表面上”的毒性。一般而言，當亞硝酸鹽含量在39～436 mg/L時，而氯離子含量大約為10～190 mg/L 時，就可以減少亞硝酸鹽的毒害。此外，碳酸根化合物雖然具有一個類似于與溴化物發生反應的功能，但是因為碳酸根離子的分子量較大，而無法有效地與亞硝根化合物競爭。控制水體的pH也有助于減少亞硝酸鹽的毒性，主要因為pH能夠反應亞硝酸鹽在水中的溶解狀態，其分子結構以及與其他分子結構之間的相互作用也取決于pH 而定。當pH 低于7 時，與亞硝酸根離子結合的H+會增加，因此生成亞硝酸元素的總量也就會增加。亞硝酸分子更易于透過魚鰓的上皮細胞，之后更順暢地進入到血液中，且不會被任何分子所阻滯。而水體中高含氧量也會降低亞硝酸鹽的毒性，這是因為亞硝酸鹽會降低向血液中運送氧氣的功能。已有研究證實，在水域中高亞硝酸鹽濃度的前提下，魚類對氧的需要量將遠高于在水域中亞硝酸鹽濃度低的情況。

3 亞硝酸鹽對鲆鰈類急性毒性影響

水體中亞硝酸鹽濃度過高是對水生動物是有毒害的，生存和致死濃度50%（LC50）被認為是評估急性毒性的關鍵參數[3]。溶解氧、氨、亞硝酸鹽等水質變化可能引起生物應激[4]。在大菱鲆（Scophthalmus maximus）中，亞硝酸鹽的急性毒性已被報道，96 h中位致死濃度（LC50）為1.88 mmol/L，但在分子和生理水平上的后續影響未被描述[5]。此外，海水中亞硝酸鹽暴露水平高于25 mg/L 則會影響褐牙鲆的抗氧化系統、神經遞質和免疫反應。亞硝酸鹽暴露水平高于25 mg/L 可以通過改變溶菌酶和IgM 活性來改變抗氧化酶（SOD、CAT、GST和GSH）的活性，以及神經遞質AChE的活性和免疫反應[6]。

3.1 亞硝酸鹽對鲆鰈類組織器官的影響

亞硝酸鹽不僅在血液中能積累，在鰓、肝臟、大腦和肌肉組織中也會發生生物積累。硬骨魚的鰓是一種多功能器官，可以進行離子運輸、氣體交換、酸堿調節和廢物排泄。它是環境污染物的主要靶器官，被認為是魚類吸收亞硝酸鹽、Cu 和Zn 等污染物的主要部位[6-7]。因此，魚鰓比其他器官更容易受到毒物的傷害。高濃度的亞硝酸鹽會導致鰓的肥大、增生、上皮細胞壞死和滲透調節功能障礙。在鰓中，高濃度亞硝酸鹽會引起氧化應激，導致抗氧化成分損失造成脂質過氧化[7]。目前，國內外研究者在亞硝酸鹽暴露水平升高時對魚類，特別是海魚鰓的分子效應的研究很少。

3.2 亞硝酸鹽對鲆鰈類應激反應的影響

魚的應激反應是由外部環境的改變或暴露于有毒物質引起的，應激指標用于檢測這些毒性效應[8]。高濃度的亞硝酸鹽暴露會對魚類造成相當大的應激，其毒性表現為生理變化、組織損傷和細胞損傷[9]。在各種應激指標中，葡萄糖濃度指標很重要，因為暴露于有毒物質的魚類，其碳水化合物代謝的增加通常會導致葡萄糖濃度升高[10]。水生動物對葡萄糖和糖原的利用是一種解毒機制，在應激條件下，葡萄糖濃度通常會增加。血漿皮質醇是魚類體內主要的類固醇激素，皮質醇的分泌通常受到各種應激源的刺激，如暴露于有毒物質和環境變化[11]。熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是由各種應激源誘導的應激蛋白，在亞硝酸鹽環境中作為可靠的應激指標。許多研究認為熱休克蛋白與細胞保護功能密切相關，它們在細胞和組織中的調節是一種應激反應[12-13]。

亞硝酸鹽暴露通過引起氧自由基在體內積聚而誘發氧化應激。GST是一種與肝臟解毒有關的重要酶。該蛋白催化涉及GSH 的反應生成無毒或有毒的小GSH硫結合化合物，這些化合物與各種帶正電的內源性或外源性物質反應，確保這些物質可以很容易地從膽汁或尿液中排出[14]。生物絮凝體和海水中亞硝酸鹽暴露后，肝臟和鰓中的GST 活性均顯著升高，這可能是由于亞硝酸鹽暴露引起的抗氧化反應，以防止氧化應激[15]。暴露于亞硝酸鹽的鳙魚的GST 活性顯著增加。谷胱甘肽系統（谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物）在控制細胞氧化還原狀態和維持細胞正常生理功能方面具有關鍵作用；魚在氧化應激下，GSH 對外界刺激的敏感度降低[16]。亞硝酸鹽暴露在生物絮團和海水中后，肝臟和鰓中的谷胱甘肽顯著降低，有研究表明暴露于亞硝酸鹽的鳙魚肝臟中GSH的顯著減少，GSH的減少是由于GSH氧化為GSSG，從而消除了ROS，這一過程是作為氧化應激的防御機制。此外，GSH 的還原與GST 活性密切相關，因為GST 通過結合親電氧自由基催化GSH 的還原[17]。魚類暴露于亞硝酸鹽會導致細胞內ROS和RNS 的生成顯著增加[18]。海水養殖中的褐牙鲆，在水體亞硝酸鹽暴露后，顯著改變了SOD、CAT、GST和GSH等抗氧化反應酶的活性，這種反應可能通過刺激抗氧化防御系統而發生[19]。

膽堿酯酶廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物中，對乙酰膽堿酯酶活性的抑制被認為是一種可靠且精準的生物標志物，可用于評估暴露于毒物環境下魚類的神經遞質的毒性[20]。在生物絮凝體和海水中飼養的褐牙鲆（P.olivaceus）肝臟和鰓中的AChE 活性被水中亞硝酸鹽暴露顯著抑制[9]。暴露于高濃度亞硝酸鹽的卡特拉魮（Catla catla）、亞洲野鯪（rohu）和麥瑞加拉鯪（Cirrhinus mrigala）大腦和肝臟中的AChE 活性顯著降低[17]。進一步表明了暴露于亞硝酸鹽的亞洲野鯪的大腦AChE 活性顯著降低。這種AChE 活性的抑制是由于亞硝酸鹽暴露應激引起的突觸區域膽堿含量的增加，從而影響神經傳遞并引起神經毒性。

門診、急診就醫病人人流量較大、病情復雜多變[3-6]、病人及其家屬對醫院服務需求和服務質量要求差異較大[7]，加之疾病譜變化，醫療保險制度改革，導致異地就醫病人流動性增加，造成綜合性醫院志愿服務隊伍人力資源合理配置難度增加。

亞硝酸鹽暴露可誘發滲透調節毒性作用，如低鈉血癥、低氯血癥、氯攝取抑制和鰓氯細胞衰竭，這些都是應激源，導致應激反應[21]。例如，血紅蛋白轉化為高鐵血紅蛋白（亞硝酸鹽毒性的主要機制），這是一個高應激因子，因為它會誘導組織缺氧，而亞硝酸鹽暴露會導致應激指標顯著增加[22]。在這些脅迫指標中，血漿葡萄糖是評價脅迫的關鍵，因為該參數通常是通過環境脅迫誘導的糖異生作用而升高的[23]。在海水中的褐牙鲆的血漿葡萄糖濃度因水中亞硝酸鹽的暴露而顯著升高[24]。Roques等[25]發現暴露于亞硝酸鹽的尖齒胡鯰（Claris gariepinus）的血糖濃度顯著升高，這是由于密集的糖原分解和葡萄糖合成的升高。壓力刺激兒茶酚胺分泌，反應增加糖原分解，從而升高血糖濃度[26]。此外，還報道了亞硝酸鹽暴露導致大菱鲆幼魚血糖濃度顯著升高。皮質醇是魚類的主要應激激素，受下丘腦-垂體-腎間軸（HPI）調節，在代謝中起重要的調節作用。皮質醇被認為是各種應激反應的標志，暴露于亞硝酸鹽96 h 的露斯塔野鯪（Labeo rohita）的血清皮質醇顯著增加。以及暴露于亞硝酸鹽導致大菱鲆幼魚血漿皮質醇濃度顯著增加[7]。在魚類中，應激誘導的血漿皮質醇或皮質類固醇的增加會刺激淋巴器官的淋巴細胞減少，應激誘導的血漿皮質醇增加對先天非特異性免疫防御機制的影響已得到證實[27]。有研究表明，在海水中褐牙鲆血漿皮質醇濃度因亞硝酸鹽濃度升高而顯著升高，這可能是由刺激下丘腦垂體腎間軸（HPI）引起的一般應激反應[24]。

眾所周知，暴露于有機毒物和重金屬的魚類通過熱休克蛋白控制應激反應，這與細胞保護功能有關，可以預防和修復蛋白質損傷。熱休克蛋白在魚的細胞和組織中被調節，作為亞硝酸鹽暴露的應激反應[12]。HSP70因其對細胞凋亡的保護作用而被廣泛研究[13]。許多研究表明暴露于亞硝酸鹽的各種魚類的HSP70顯著增加，亞硝酸鹽暴露引起鰓、肝臟和腎臟等組織損傷[28]。亞硝酸鹽暴露也顯著提高了生物絮凝體和海水中褐牙鲆肝臟和鰓中HSP70 的濃度[24]。

3.3 亞硝酸鹽對鲆鰈類生理功能的影響

亞硝酸鹽通常對水生生物有毒，并破壞一些生理功能。血液參數已用于評估魚類的毒性作用[29]。亞硝酸鹽暴露通過將血紅蛋白轉化為高鐵血紅蛋白影響魚類血液生理，引起內源性一氧化氮產生等各種生理障礙，如炎癥、離子失調、內分泌紊亂和排泄過程干擾等現象[21，25，30]。此外，亞硝酸鹽暴露顯著降低了在海水中飼養的褐牙鲆的血紅蛋白和紅細胞壓積的血液學參數[24]。Svobodova 等[31]報道了鯉魚（Cyprinus carpioL.）暴露于亞硝酸鹽后血紅蛋白的顯著降低。Avilez 等[27]也報道了暴露于亞硝酸鹽的石脂鯉（Brycon cephalus）的血紅蛋白和紅細胞壓積顯著降低。亞硝酸鹽暴露導致溶血性貧血，由于NADH高鐵血紅蛋白還原酶降低了高鐵血紅蛋白的含量，增加了紅細胞（RBCs）的能量需求，從而減少了紅細胞在脾臟和腎臟代謝之前的循環時間。Costao 等[32]進一步研究點鰭紅眼脂鯉（Colossoma macropomum）暴露于亞硝酸鹽時紅細胞壓積和血紅蛋白的顯著降低。通過血紅蛋白轉化為高鐵血紅蛋白而減少血紅蛋白是暴露于亞硝酸鹽的魚類的主要毒性作用，當這些魚暴露于水中亞硝酸鹽時，觀察到灰鰭鯛（Sebastes inermis）的血紅蛋白顯著降低。類似的，Roques 等[25]發現暴露于亞硝酸鹽的尖齒胡鯰（Clarias gariepinus）的血紅蛋白也顯著降低。

有機血漿中的膽固醇成分是細胞膜結構中的重要物質，也是所有類固醇激素的前體。毒性誘導的氧化應激通常會導致高膽固醇血癥。然而，相關研究認為亞硝酸鹽會減少魚類體內類固醇激素的合成，這可能與亞硝酸鹽向NO+的轉變有關[30-33]。Das等[34]認為，在接觸毒物的情況下，血漿蛋白濃度可能會因蛋白質分解代謝的增加而降低，以維持體內平衡，將血液中的結構蛋白轉化為能量。Kim 等[24]的試驗證明，海水養殖中的褐牙鲆，血漿膽固醇濃度因亞硝酸鹽暴露而顯著降低，這可能抑制了類固醇激素的合成，對褐牙鲆血漿總蛋白濃度無顯著影響，所以亞硝酸鹽暴露不影響褐牙鲆蛋白質分解代謝。

酶促血漿中的GOT 和GPT 已被廣泛作為暴露于有毒環境所引起的肝損傷的指標[35]。海水養殖的褐牙鲆血漿中GOT 和GPT 濃度因水中亞硝酸鹽濃度升高而顯著升高，這可能是由于氮代謝紊亂引起的肝臟損傷所致。Hyun 等[36]研究了暴露于亞硝酸鹽后，歐洲鰻鱺（Anguilla Anguilla）的GOT 和GPT 顯著增加，并伴有肝壞死現象。以上表明，亞硝酸鹽的暴露會影響海水養殖的魚類的生產效率。

3.4 亞硝酸鹽對鲆鰈類免疫應答的影響

環境變化往往會對魚類造成壓力，導致免疫力下降[37]。硬骨魚具有各種重要的防御分子，如溶菌酶、補體和IgM，它們參與保護機體，使其免受潛在有害條件的侵害[38]。LYS 是一種陽離子酶，在防止魚類感染革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌方面起著關鍵作用[39]。有研究表明亞硝酸鹽暴露導致露斯塔野鯪的LYS 活性降低[40]。同時，LYS 基因在鰓組織中的表達也發生了類似的變化[41]。C3 和C4 是經典途徑和凝集素途徑的關鍵成分，負責各種免疫效應功能[42]。然而，補體的持續激活可能導致對宿主的不良反應和免疫抑制[43]。研究表明，環境污染物導致魚類C3和C4基因或蛋白質上調[44]。魚類有四類免疫球蛋白，它們是體液免疫系統的組成部分，包括IgM、IgD、IgT 和IgZ，由B 淋巴細胞分泌。在這些免疫球蛋白中，IgM 在魚類的適應性免疫中具有關鍵功能，是評估魚類免疫毒性的關鍵因素[45]。在魚類中，一些研究報告了環境污染物，如硫酸銅、氨和二氧化碳，抑制了IgM 蛋白或mRNA 水平[46-47]。這些結果表明，亞硝酸鹽引起了大菱鲆的免疫毒性和體液免疫抑制。

在魚類中，2 個主要的HSP 家族是HSP70 和HSP90，它們被包括化學應激、熱應激和擁擠應激的各種應激源誘導，并參與免疫反應[48-49]。魚體內HSP70和HSP90水平的提高反映了蛋白質損傷或對后續應激耐受性的增強[50]。Jia 等[7，51]的研究表明，鰓中HSP70和HSP90基因的表達量隨著亞硝酸鹽濃度和暴露時間的增加而增加。這一結果與黃錫鯛（Sparus sarba）和團頭魴（Megalobrama amblycephala Yih）的研究一致。

魚體內ROS 的大量產生會影響免疫力，并改變細胞結構，如脂質、膜、蛋白質和核酸[52]。魚類的免疫系統對環境壓力很敏感，免疫系統的變化被廣泛認為是壓力源的可靠指標。Miao[53]提示暴露于亞硝酸鹽影響免疫反應，導致免疫抑制和免疫功能障礙。進一步表明毒性環境可影響水生動物的免疫反應。在魚類體內的各種防御分子中，溶菌酶在保護魚類免受細菌感染方面起著至關重要的作用。然而，亞硝酸鹽暴露可引起溶菌酶活性的增加。海水養殖的褐牙鲆暴露于亞硝酸鹽后血漿溶菌酶活性顯著提高，這可能是由免疫系統刺激引起的。因此，在亞硝酸鹽的環境脅迫下，魚體內溶菌酶活性顯著增加。

3.5 亞硝酸鹽對鲆鰈類細胞凋亡的影響

一般來說，細胞外刺激，如生物、化學或物理因素，通過信號轉導途徑轉導為細胞內反應，導致基因表達的變化[54]。亞硝酸鹽不僅引起氧化損傷，還可能引發細胞凋亡[55]。細胞凋亡是一種高度組織化的細胞過程，伴隨著大量細胞內蛋白酶和內切酶的激活。凋亡途徑主要分為2 類：死亡受體介導的細胞凋亡途徑和線粒體介導的細胞凋亡途徑。內在和外在終點的共同事件是一組半胱氨酸蛋白酶（Caspases）的激活[56]。硬骨魚的鰓是排泄、滲透調節和呼吸的多功能器官，與溶解毒物直接接觸的面積較大。因此，鰓特別容易受到毒物的傷害。亞硝酸鹽暴露會導致鰓肥大、增生、上皮細胞壞死和滲透調節功能障礙。在水生動物中，亞硝酸鹽暴露也促進細胞凋亡。Sun 等[50]報道亞硝酸鹽暴露誘導凋亡相關基因（Caspase-8 和Caspase-9）的轉錄，促進了斑頭巨斑魚幼魚鰓細胞的凋亡。同樣，在凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節對蝦（Penaeus monodon）和羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）中也觀察到亞硝酸鹽誘導的血細胞凋亡[57-59]。然而，亞硝酸鹽對海洋魚類鰓細胞凋亡相關基因表達的影響的研究資料非常有限。

Caspases 是半胱氨酸蛋白酶，在細胞對不同刺激的凋亡反應中起著重要作用。許多研究表明亞硝酸鹽可以通過Caspase 依賴通路誘導細胞凋亡[59]。Jia[7]發現亞硝酸鹽脅迫下大菱鲆鰓中Caspases-3、-7和-9的mRNA 水平升高。基于上述結果，推測亞硝酸鹽暴露通過激活大菱鲆的鰓中的啟動子Caspase（Caspase-9）和效應子Caspase-3 和-7 來誘導細胞凋亡。

此外，亞硝酸鹽暴露引起了凋亡相關基因的轉錄上調，表明Caspase 依賴通路的激活（圖1）[7]。另外，亞硝酸鹽暴露造成鰓細胞的凋亡與接觸時間和濃度呈正相關。由于mRNA水平不一定能反映蛋白質水平和活性，亞硝酸鹽誘導的細胞凋亡在今后的研究中需要在蛋白質水平上進一步評價。在血液中，亞硝酸鹽暴露改變了離子穩態，有助于metHb的產生，從而導致應激反應和皮質醇、葡萄糖和熱休克蛋白70 水平的升高。亞硝酸鹽暴露引起鰓的氧化應激，引起脂質過氧化和抗氧化劑的損失。此外，亞硝酸鹽誘導的氧化應激或NO 可能激活MAPK/JUK信號通路，增加P53 水平，觸發Caspase 級聯促進凋亡[7]。

圖1 亞硝酸鹽誘導大菱鲆毒性模型

4 研究與展望

隨著養殖標準的日益提升以及養殖密度的日益增加，水域的養殖容量已到達甚至超過飽和水平，導致水域的生化狀態日益下降，水域的氨氮含量、亞硝酸鹽、硫化物等有毒、有害物質不斷增加，養殖生物容易患病或者中毒致死，帶來很大的風險。因此，對于亞硝酸鹽對養殖生物的毒性危害問題的研究，必須從基礎理論上入手，尋找多元化的解決方法。

一是選擇一些同科（屬）的養殖生物在同一試驗環境下開展試驗。例如：可以選擇生活在同一水層，相同科（屬）且規格一致的魚開展毒性試驗，所得結果就有很大參考性。二是選擇目前常見的混養品種，某種魚和某種蝦在同一試驗環境下開展試驗。目前，有關亞硝酸鹽對單胞藻、大型藻類、海膽和海參等的試驗還較少。單胞藻作為重要的海洋初級生產力，是水產動物的天然餌料，但隨著市場經濟的日益發達，工、農廢物以及人類生活廢棄物對海洋的污染，導致了沿海地區赤潮頻繁、內陸海洋水華不斷，亞硝酸鹽作為單胞藻的氮來源，是引起這些問題的主要因素之一，有待進一步深入研究。三是養殖技術方面，生物絮凝技術（BFT）是一種將環境污染降到最低的創新方法，因為它不涉及水的交換。BFT能使水中的有益微生物將氨氮和亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽。生物絮凝體中的微生物有助于水產養殖魚類的免疫功能和生理活性的提高，促進生長。開發利用BFT養殖鲆鰈類，可以提高其育種水平，所以需要對生物絮團養殖環境中各種物質的耐受性標準進行更多的研究。

水產養殖業在中國以及全球都是主要的食物供應行業之一，做好水產養殖的研究工作有利于推動其科學、健康、長期穩定的增長，對保證全國食品供應、推動社會主義市場經濟建設、改善從業者收入水平以及提高人們生活質量等具有很大意義。