硼脅迫下煙草葉片轉錄組分析

王瀟然， 李笑語， 孫慧， 于海東， 石永春

（河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002）

硼元素是植物細胞壁中重要的微量元素之一，與植物碳、氮代謝及核酸合成等眾多生物學過程緊密相關[1]。硼含量的變化可能改變膜結合蛋白的結構，進而將外界信號通過細胞壁-細質膜-細胞骨架路徑傳遞到胞內；同時，進入細胞核內的硼元素與相關蛋白結合影響部分轉錄因子活性，從而實現對內源基因轉錄水平的調控[2]。

Ali 等[3]發現，高硼含量影響煙草對氮素的吸收，可能是由于硼改變了H+-ATPase 活性，影響跨膜質子的運輸，最終導致與質子共轉運的氮素吸收受到抑制。硼含量的改變導致細胞內第二信使的Ca2+信號發生顯著變化，并通過調節活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和NAD(P)H 氧化酶活性影響細胞代謝過程[4]。因此，土壤中適宜的硼含量是煙葉品質和產量的重要保證。研究表明，最適于煙草生長的土壤有效硼含量為0.5~1.0 mg·kg-1[5]。在我國干旱或半干旱植煙地區，土壤中硼含量多高于2.0 mg·kg-1，易造成嚴重的硼脅迫現象[6]。在西南煙區，重慶長江沿岸和湘西地區土壤中有效硼含量均高于煙草正常需硼量[7-8]。由于煙草對硼元素的敏感性較高，即使在缺硼地區，也容易因過量施用硼肥而導致短期的硼脅迫[9]。研究表明，硼脅迫會導致花椰菜蒸騰速率和光合速率下降[10]；白樺葉片淀粉和己糖（葡萄糖和果糖）含量降低[11]；向日葵[12]、小麥和大麥[13]根中總氮含量減少，硝酸還原酶活性下降；花生葉片中總氮和蛋白質含量下降[14]；抑制茶樹對磷的吸收[15]。

對煙苗進行無土栽培時，發現用200 mg·L-1的硼酸處理2 周即可導致硼脅迫現象，其株高僅為對照的70.00%，葉長為對照的80.93%，葉尖和葉緣出現變黃、干枯等現象[9]。但煙葉硼脅迫的臨界值和煙葉對長期硼脅迫的響應機制都未見報道。煙葉是煙草的收獲器官，因此，為深入研究煙草對硼脅迫的響應機理，本文通過高通量測序技術，結合生理和分子檢測技術，對煙草響應硼脅迫的相關基因進行初步篩選，為深入理解煙草對硼脅迫的響應機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

將栽培煙草‘K326’（Nicotiana tabccumcv.K326）種子鋪于濕潤的濾紙，萌發后轉移至滅菌的煙草專用基質上，24 ℃、16 h 光/8 h 暗環境育苗至8葉期開始進行硼脅迫處理。

1.2 試驗設計

將8 葉期煙草移入蛭石中，分別以含硼量為0、0.05、1.00、2.00、3.00 mmol·L-1的Hoagland 培養液澆灌，分別命名為T0、T0.05、T1、T2、T3。處理4 周，處理期間每隔3 d 澆100 mL 處理液，每次澆灌處理液之前用5 倍蛭石體積的去離子水沖淋，以確保處理水平的一致性。脅迫結束后，將第9 或第10 片葉去除葉緣和葉脈，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 測定項目及方法

1.3.1形態學指標測定 葉長、葉寬和根長用軟尺測量，根體積用排水法測定，根系面積用甲烯藍法[16]測定。

1.3.2生理指標檢測 利用比色法[17]測定葉綠素含量。脯氨酸含量按照Chakrabarty 等[18]的方法進行檢測。總糖含量采用蒽酮法[17]定量檢測。使用蔗糖/葡萄糖/果糖試劑盒（德國拜發，E0139 041）分析果糖、葡萄糖和蔗糖含量。依據鄒琦[17]的方法測定淀粉含量。依據Van 等[19]的方法檢測纖維素含量。果膠含量按照比色法[20]進行測定。蛋白質含量按照Bradford 等[21]的方法測定，H2O2含量按照Liu 等[22]的方法進行檢測。硼含量采用楊潔等[23]的方法用安捷倫ICP-OES 光譜儀測定。

1.3.3抗氧化酶活性測定 過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創木酚法，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）采用硝基四氮唑藍還原法測定[17]；蔗糖合成酶（sucrose synthetase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthetase，SPS）活性的測定采用Pramanik等[24]的方法測定。

1.4 高通量測序及數據分析

將T0.05和T2處理后凍存的煙草葉片送到壹基因公司測序，每個處理3 次重復。提取樣品總RNA 并使用DNase Ⅰ消化，然后用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA；打斷后合成一鏈cDNA 和二鏈cDNA，回收加接頭，再進行PCR 擴增建庫；質檢合格后用Illumina HiSeqTM4000 測序儀進行測序。將獲得的原始序列（raw reads）進行質控（quality control，QC）后過濾得到分析數據（clean reads），用SOAPaligner/SOAP2 與參考序列進行比對，而后利用R語言DESeq數據包篩選差異表達的基因（differentially expressed genes，DEGs），篩選標準為|log2Ratio|≥1 且FDR（false discovery rate）≤0.05。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（https://www.genome.jp/kegg/）和The Gene Ontology Resource（http://geneontology.org/）數據庫對差異基因進行注釋，利用R 語言完成GO 和KEGG pathway顯著性富集分析。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

隨機選取部分差異表達基因對上述凍存的樣品進行熒光定量PCR 檢測，以actin為內參，參照TB Green?Premix Ex Taq? Ⅱ (TliRNaseH Plus，TaKaRa 公司)試劑盒的說明書配制反應體系。所用引物如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 數據分析

采用SPSS 21.0 和Excel 2010 軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 硼脅迫對煙草生長的影響

為明確硼脅迫對煙葉生長的影響，以煙草栽培種‘K326’為試驗材料，在8 葉期連續4 周進行不同水平的硼處理，結果（圖1）表明，處理4周后，與T0相比，硼脅迫處理均導致煙株矮小，葉片變小，且對煙葉生長的抑制作用隨硼用量的增加而加重。其中，T0.05的葉片略小但生長狀態最好，T1處理出現葉緣輕微焦枯現象；T2處理葉緣出現明顯焦枯現象；T3處理則更嚴重。分析不同處理下煙葉的葉長和葉寬，結果（圖2）表明，處理組第10葉的葉長和葉寬均顯著低于對照，且表現為隨硼含量的增加而減少，其中T2和T3處理又極顯著低于T0.05和T1處理；而T0.05與T1處理、T2與T3處理間差異不顯著。因此，后續試驗及分析均以2.00 mmol·L-1（T2處理）進行硼脅迫處理。

圖1 不同硼處理下煙草的生長Fig. 1 Growth of tobacco in different treatments

圖2 不同處理下煙草的葉片形態Fig. 2 Morphological indexes of tobacco leaves in different treatments

2.2 硼脅迫對煙葉內主要成分的影響

為進一步分析硼脅迫抑制煙葉生長的原因，對T0和T2處理煙草相同葉位葉片的硼含量及其生理指標和酶活性進行了對比分析（表2~4）。結果表明，硼脅迫4 周后，硼主要積累在煙葉中，T2處理葉片中的硼含量是T0的7.256 倍；莖和根中的硼含量分別為T0的1.353 和1.554 倍（表2）。硼脅迫處理葉片中的可溶性總糖含量極顯著降低，僅為T0的57.7%；葡萄糖和果糖含量變化較小，但蔗糖含量顯著降低，僅為T0的38.4%；淀粉含量顯著下降，為T0的48.7%；葉綠素及類胡蘿卜素含量與T0差異不顯著；作為細胞壁主要組成成分的纖維素和果膠，硼脅迫處理后分別降至T0的64.0%和65.9%；硼脅迫極顯著提高了煙葉中脯氨酸、蛋白質和H2O2含量，分別為T0的1.582、1.421、5.198倍（表3）。酶活性檢測顯示（表4），T2處理葉片中SOD 活性極顯著低于T0；POD 活性極顯著高于T0；SPS 活性顯著高于T0；SS 活性與T0差異不顯著。

表2 不同處理下煙株各器官的硼含量Table 2 Boron contents in different tissues of tobacco under different treatments （mg·g-1 DW）

表3 不同處理下煙草葉片的生理指標Table 3 Physiological indexes of tobacco leaves under different treatments （mg·g-1 FW）

表4 不同處理煙草葉片的酶活性Table 4 Enzyme activities in tobacco leaves of different treatments（U·g-1）

2.3 硼脅迫對煙草葉片中碳代謝的影響

形態及生理指標檢測證實，高水平硼脅迫影響煙葉的物質代謝及生長發育，但煙草的正常生長又需要硼，因此，為篩選響應高濃度硼脅迫的基因及代謝通路，本研究以T0.05（常規Hoagland培養液）為對照，T2為處理對煙葉樣品進行轉錄組測序分析，共獲得差異表達基因389 個。對上述基因進行KEGG富集分析，獲得顯著富集的前20個途徑，硼脅迫主要影響煙草次生代謝物的合成、苯丙烷類合成、植物和病原菌互作、苯丙氨酸代謝，植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝、芪類和姜醇代謝、黃酮類合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、亞麻酸和甘油磷脂代謝等途徑（圖3）。

圖3 硼脅迫響應基因KEGG富集分析Fig. 3 KEGG enrichment analysis of DEGs responding to boron toxicity

在淀粉和蔗糖代謝途徑中，硼脅迫處理后，煙葉中內切葡聚糖酶11（LOC104086800）和18（LOC104216009）、β-淀粉酶3（LOC104239567）、果膠酯酶（LOC104118953）、α, α-海藻糖磷酸合酶11 同型X1（LOC104236587）、β-D-木糖苷酶2（LOC104210063）顯著上調；內切葡聚糖酶6 類（LOC104116779、 LOC104215840）、海藻糖酶（LOC107800135）、β-葡糖苷酶13 類同型X1（LOC104110715）、β-D-木糖苷酶5（LOC104228982）、蠶豆氰苷水解酶（LOC104218490）、半乳糖醛酸轉移酶類1（LOC104087120）、果膠酯酶抑制子51 同型X1（LOC104117285）顯著下調（表5）。其中，上調的磷酸海藻糖合酶催化合成海藻糖，下調的海藻糖酶降解海藻糖，這可能導致煙葉中海藻糖的積累。由于海藻糖參與植物的抗病信號途徑[25]，這一現象可能暗示硼參與煙草抗病信號調控。另外，上調的內切葡聚糖酶和果膠酯酶分別催化纖維素和果膠的分解；果膠酯酶抑制子51 同型X1的下調則進一步促進了果膠的水解。β-D-木糖苷酶參與木聚糖的分解，不同種類β-D-木糖苷酶的表達水平變化可能暗示木聚糖的分解在不同的組織中受到的影響不同。

表5 響應硼脅迫的淀粉和蔗糖代謝途徑相關基因Table 5 Genes related to starch and sucrose metabolic pathways responding to boron toxicity

2.4 硼脅迫對煙葉脂類代謝的影響

脂類是煙葉中重要的香氣來源和組成成分，KEGG 分析表明，硼脅迫導致脂類代謝途徑相關基因的表達豐度發生波動（表6）。其中涉及脂肪酸合成的乙酰CoA 羧化酶1 類（LOC104089343）、3- 酮二氫鞘氨醇還原酶類同型 X2（LOC1042 45391）均顯著下調，表明脂肪酸的合成受到抑制；參與脂肪酸降解的過氧化物酶體中的酰基CoA 氧化酶2（LOC104119660）顯著上調，表明硼脅迫可能促進脂肪酸的降解；而參與脂肪酸延長的3-酮酯酰CoA 合酶6（LOC104214086、LOC104094697）、3- 酮酯酰CoA 合酶19 類（LOC104228778、 LOC104218838）、長鏈酰基CoA合成酶2（LOC104110787）顯著下調，暗示硼脅迫可能抑制長鏈脂肪酸的合成；但涉及不飽和脂肪酸合成的長鏈烯酰CoA 還原酶類（LOC104114213）顯著上調，推測硼脅迫可能影響某些長鏈不飽和脂肪酸的含量。

表6 響應硼脅迫的脂肪酸代謝途徑相關基因Table 6 Fatty acid metabolic related genes that responding to boron toxicity

2.5 硼脅迫影響煙葉的抗逆能力

硼脅迫導致煙葉中脯氨酸含量和酶活性發生變化，由此表明硼脅迫可能影響煙草的抗逆性。由表7 可知，硼脅迫后，除抗病蛋白RPP13（LOC104234903）基因顯著下調外，堿性發病相關蛋白PR1（LOC104235161）、抗病蛋白（LOC104116631）、抗病蛋白RPM1 類（LOC104233182）的表達顯著上調；富含半胱氨酸的受體類蛋白激酶3（LOC104216132）、響應脅迫的G 類植物凝集素S-受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激 酶 At4g27290 同 型 X1（LOC104217774、LOC104241125、 LOC104246103）的表達水平上調，僅G 類植物凝集素S-受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶At5g24080 同型X1（LOC104096948）表達下調；富含脯氨酸的受體類蛋白激酶PERK9（LOC104103311）表達水平上調；響應脅迫的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶1 類（LOC104236563、LOC104091723）表達水平上調；PTI1 類酪氨酸蛋白激酶At3g15890 類（LOC104223256）、ZmPK1 類受體類蛋白激酶（LOC104084644）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶同型X2（LOC104216857）的表達水平上調；響應脅迫的多聚半乳糖醛酸酶抑制劑類（LOC104112558） 、 轉 錄 因 子 PIF1 類（LOC104093573）、參與抗病途徑的TIFY8（LOC104239595）的表達水平上調，呼吸爆發氧化酶蛋白E類（LOC104111058）的表達下調。

表7 響應硼毒害的生物脅迫應答基因Table 7 Genes responding to boron toxicity

2.6 硼脅迫影響煙葉的激素信號轉導

激素是調節植物生長發育的重要信號之一。轉錄組分析發現，硼脅迫造成多個激素信號通路改變（表8）。響應乙烯（ethylene）信號途徑的乙烯響應轉錄因子ERF003（LOC104096661）和乙烯受體蛋白（LOC107784797）表達水平上調，表明硼脅迫激活乙烯信號途徑。硼脅迫處理后，煙葉中的生長素（IAA）受體蛋白TIR1（LOC104085449）表達水平顯著下調；而抑制生長素信號的生長素響應蛋白IAA26（LOC104100899）和生長素響應因子ARF9（LOC104243881）表達水平上調，表明生長素信號途徑被顯著抑制，從而影響煙葉生長。響應茉莉酸（jasmonic acid，JA）信號途徑的TIFY8蛋白（LOC104239595）和響應水楊酸（salicylic acid，SA）信號途徑的轉錄因子 TGA2.1（LOC107782457）的表達水平均上調，它們都能激活堿性PR1 蛋白（LOC104235161），從而增強煙葉抗病性。負調控脫落酸（abscisic acid，ABA）信號的蛋白磷酸酶PP2C 37（LOC104086506）表達水平下調；響應ABA 的轉錄因子PIF1（LOC104093573）表達水平上調，推測硼脅迫促進了ABA信號途徑。

表8 響應硼脅迫的植物激素信號轉導相關基因Table 8 Genes related to hormone signal transduction in plants responding to boron toxicity

2.7 熒光定量PCR驗證分析

為驗證轉錄組數據的可靠性，隨機選取8個差異基因（表1）進行qRT-PCR驗證，而后將驗證基因T2/T0.05的相對表達倍數取Log2，與轉錄組數據比對線性關系，結果（圖4）顯示，二者間存在良好的線性關系（R2=0.872 6），表明轉錄組數據真實可靠。

圖4 差異表達基因qRT-PCR驗證Fig. 4 Validation of transcript abundance of differentially expressed genes based on qRT-PCR

3 討論

硼脅迫影響植物生長發育已經被廣泛報道，在棉花、小麥等作物中均有發現[26-27]；在煙草中，硼脅迫影響煙株的農藝性狀，并導致凈光合速率、POD 活性、干物質量及經濟效益均顯著降低[28]。本研究發現，硼脅迫導致煙株矮小，煙葉變小變厚；且發現硼主要積累于煙葉中，硼毒害造成煙葉中可溶性總糖含量顯著降低，僅為對照的57.7%，其中蔗糖含量僅為對照的38.4%；淀粉、纖維素和果膠的含量也顯著降低。組學分析顯示，負責降解淀粉的β-淀粉酶3（LOC104239567）和纖維素的內切葡聚糖酶11（LOC104086800）、18（LOC104216009）均上調表達，與生理檢測結果趨勢一致。Massod 等[29]對小麥進行高硼脅迫6 周后，也發現葉片中總糖和蔗糖含量顯著降低，認為這是由于礦質元素紊亂造成的碳代謝抑制。高硼處理鳳梨也導致葉片中礦質元素紊亂，總糖和淀粉含量降低[30]。長期高硼脅迫導致煙草的總糖含量降低是否也與礦質元素紊亂有關，且影響了哪些礦質元素，還有待進一步的研究。

在大豆中發現硼脅迫導致脂肪酸總量降低，尤其是軟脂酸顯著降低[31]。本研究發現，硼脅迫造成煙草脂肪酸從頭合成途徑的關鍵酶乙酰CoA羧化酶表達水平下調，而脂肪酸β-氧化途徑的酰基CoA 氧化酶表達水平上調，參與脂肪酸延長途徑的3-酮酯酰CoA合酶和長鏈酰基CoA合成酶表達水平下調，表明硼脅迫可能在促進脂肪酸降解的同時，又抑制了脂肪酸、尤其是長鏈脂肪酸的合成，進而導致煙葉中脂肪酸含量降低。脂肪酸是脂類物質合成的原料，其含量降低將導致煙葉油分減少，品質下降。同時，脂肪酸是合成細胞膜的主要成分之一，其合成受阻可能干擾細胞的正常分裂。

氮素代謝直接關系煙葉的產量和品質。番茄受硼脅迫后葉片中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性升高，蛋白質含量隨硼脅迫強度的升高而增加[32]。大豆[31]種子、擬南芥[33]和玉米[34]葉中的蛋白質也隨著硼脅迫強度的增加而增加。本研究發現，硼脅迫后煙葉中蛋白質含量顯著增加。盡管組學分析未檢測到氮素代謝相關基因的表達變化，但其他作物在硼脅迫后蛋白含量增加，由此推斷硼脅迫可能在加速糖類分解代謝的同時，促進了糖類碳骨架向蛋白質的轉換。

硼與植物的抗病性密切相關[35]。植物的抗病能力通常借助抗氧化酶活性的提高、啟動超敏反應、增強防御基因表達等體現[36]。Rezaee 等[37]發現，0.1 mmol·L-1硼處理洋桔梗24 h 后，洋桔梗中的SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性增強，其中CAT 尤其顯著。Kayihan 等[33]將擬南芥在含有3.0 mmol·L-1硼的MS 培養基上培養14 d，其葉片中GR、DHAR和APX基因的表達水平顯著增加，表明激活了AsA-GSH 循環，提高了擬南芥抗氧化能力和抗病性。本研究發現，硼脅迫處理煙株4周，不僅顯著增強了煙葉POD 活性，還在植物抗病機制信號途徑中，上調了發病相關蛋白PR1、抗病蛋白RPM1 以及響應脅迫的大量受體類蛋白激酶基因的表達，如富含半胱氨酸的受體類蛋白激酶3、G類植物凝集素S-受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[38]、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶[39]等關鍵生物脅迫應答基因的表達水平，因此，硼元素可能具有提升植物耐受生物脅迫的能力。盡管如此，但高硼積累通常引發煙草代謝紊亂，使其產量及品質下降。因此，探索科學合理的硼肥施用方案，可實現在穩產優質的同時，提升煙株抗病性，在煙草乃至其他作物栽培過程中具有重要應用價值。

植物生長受多種激素信號系統的綜合調控。Eggert 等[40]研究了油菜幼苗受短期（7 d）低硼處理（2.0 mg B·kg-1土）后葉片中的激素變化，發現隨硼水平的增加，葉片中IAA 和ABA 含量降低，GA含量增加，SA 含量無顯著變化。對玉米葉面噴施萘乙酸（naphthlcetic acid，NAA）和IAA，可有效降低硼脅迫對葉片造成的氧化脅迫[35]。由此推測，激素信號途徑可能是硼脅迫抑制植物生長的主要途徑，尤其是IAA信號途徑。本研究發現，硼脅迫處理4 周后，煙葉中多個激素信號途徑相關基因表達發生變化。其中IAA 受體TIR1的表達水平顯著下調；SA 信號途徑中的TGA表達水平上調；乙烯信號途徑中的乙烯響應轉錄因子ERF 和乙烯受體蛋白的表達水平上調，暗示硼脅迫還可能激活煙葉中SA 和乙烯信號途徑。硼脅迫導致負調控ABA 信號的蛋白磷酸酶基因PP2C-37的表達水平下調，響應ABA的轉錄因子基因PIF1的表達水平上調[41]，推測硼脅迫促進了ABA 信號途徑信號轉導。由于SA 和ABA 信號途徑與植物的抗病和抗逆響應機制密切相關[34]，通過檢測SA 信號途徑中的TGA、ABA 信號途徑中的PP2C 和抗病蛋白PR1 的表達變化，可為硼在煙葉抗病或抗逆機制中的應用提供參考。