不同成熟度鮮煙素質對烤后煙葉品質貢獻度的研究

胡永濤， 汪代斌， 陳益銀， 楊超， 鄭林林， 史宏志， 王建安*

（1.河南農業大學煙草學院，鄭州 450002； 2.中國煙草總公司重慶市公司，重慶 404100）

鮮煙采收成熟度是煙葉在田間生長發育和干物質積累到適于調制加工的質量狀態和程度，對煙葉烘烤的難易程度有較大的影響，同時也是提高烤后煙葉品質的必要條件[1]。不同成熟度煙葉的鮮煙素質差異較大，會影響烤后煙葉的品質。鮮煙素質是煙葉自身具備的特征特性，主要體現在組織結構、色素含量、酶活性、化學成分含量等方面[2]。鮮煙素質是田間煙葉成熟的基礎，因此，與成熟度具有對應關系。陳頤等[3]、劉輝等[4]研究表明適熟煙葉烤后質量最佳，然后反推適熟煙葉的植物學特性指標，得到了成熟度判斷標準。徐興陽等[5]研究了煙葉成熟度與鮮煙葉特征間的關系，得到了適宜采收的成熟度。高憲輝等[6]研究表明，可通過顏色值及其判別函數來判別煙葉的成熟度。張冰濯等[7]研究表明，SPAD 值可作為煙葉采收成熟度的判斷標準。這些研究大多通過烤后煙葉品質來反推鮮煙葉成熟度的植物學特征，羅列不同成熟度鮮煙素質的指標來確定采收成熟度的判斷標準，但對不同鮮煙素質指標影響烤后煙葉品質的貢獻度并不明確。偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discriminant analysis,PLS-DA）屬于有監督分析，通過預設分類盡可能去除未控制變量對數據造成的影響，進一步挖掘數據信息，量化特征物質造成樣品之間差異的程度[8]。因此，本研究通過PLS-DA 分析不同成熟度鮮煙素質特征指標對烤后煙葉品質影響的貢獻度大小，為煙葉成熟度判斷標準的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和地點

試驗于2019—2020 年在重慶市巫溪縣古路鎮黃陽村（海拔992.99 m，E 109°22′55″，N 31°18′50″）進行，土壤類型為沙壤土，地勢平坦，肥力適中。供試烤煙品種為‘渝金香1號’，田間采用標準化規范管理。

1.2 試驗設計

試驗按照煙葉外觀特征設置3 個成熟度，各成熟度鮮煙葉采收特征如表1 所示。各處理分別選取具有代表性的9 片鮮煙葉（中部葉：10~12 葉位）用于測定每片煙葉的色素含量、組織結構和主要酶活性等指標，3次重復。每個成熟度選取5竿樣煙進行烘烤試驗，烘烤時置于同一烤房中層，按照當地常規烘烤工藝進行烘烤。烘烤結束后，對烤后煙葉進行外觀質量評價、化學成分檢測和感官質量評吸。

表1 田間鮮煙葉采收特征Table 1 Harvest characteristics of fresh tobacco leaves in the field

1.3 測定指標及方法

1.3.1葉片生理指標的測定 各處理取中部鮮煙葉（10~12 葉位），在葉片第5~8 支脈之間，距主脈左右兩側3 cm 處用8 mm 打孔器取樣，樣品混合均勻后用于葉綠素a（chlorophyll a，CA）、葉綠素b（chlorophyll b，CB）、類胡蘿卜素（carotenoid，CD）、總葉綠素含量（total chlorophyll，TC）、類葉比（ratio of carotenoids to chlorophyll，RCC）、丙二醛含量（malondialdehyde，MDA）、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase，SOD）活性和總淀粉酶（total amylase，TA）活性共8 項指標的測定。其中，色素和MDA 含量及POD 和SOD 活性的測定采用分光光度法[9]；總淀粉酶活性采用3, 5-二硝基水楊酸比色法測定[10]。

1.3.2葉片組織結構石蠟切片的制備 對田間鮮煙葉沿著葉片中部至尖部中央段兩側距主脈2～3 cm 進行打孔取樣（圖1），將取下的葉片樣品用福爾馬林-乙酸-乙醇 （formalin-aceto-alcohol，FAA）固定液（70%酒精）固定保存。按照常規石蠟切片法[11]進行切片，采用番紅-固綠染色。使用Eclipse Ci-L 拍照顯微鏡選取葉片組織的目的區域進行100 倍成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0 分析軟件測定各部分數據。主要包括葉片厚度（thickness of leaf，TL）、上表皮厚度（thickness of upper epidermis，TUE）、下表皮厚度（thickness of lower epidermis，TLE）、柵欄組織厚度（thickness of palisade tissue，TPT）和海綿組織厚度（thickness of spongy tissue，TST），并計算組織比（tissue ratio， TR），公式如下。

圖1 鮮煙葉取樣點Fig.1 Sampling point of fresh tobacco leaves

組織比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度 （1）

1.3.3烤后煙葉常規化學成分測定 取不同成熟度C3F 烤后煙葉2 kg，于65 ℃條件下烘干并粉碎研磨，采用孔徑為0.25 mm 的濾篩過濾。參考張炳輝等[12]的方法，使用連續流動法測定烤后葉片的總糖、還原糖及鉀、氯、煙堿和總氮含量，并計算氮堿比、糖堿比和鉀氯比。

1.3.4烤后煙葉外觀質量評價 由專業分級的技術人員按照GB 2635—1992 烤煙分級標準[13]進行外觀質量評價，包括：顏色、成熟度、結構、身份、油分和色度。

1.3.5烤后煙葉感官質量評價 由河南中煙技術中心專家按照YC/T 138—1998 標準[14]進行評價。包括：香氣質、香氣量、濃度、刺激性、雜氣、余味。

1.4 數據分析

運用Excel 2016 軟件進行數據的初步統計，運用SPSS 22.0 進行差異顯著性分析，運用Origin 2021進行PLS-DA分析及圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 不同成熟度鮮煙色素含量變化

由表2 可知，隨著煙葉成熟度的提高，葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量逐漸降低，且不同成熟度之間存在顯著差異；而類葉比逐漸增加，其中，適熟和過熟煙葉的類葉比顯著高于尚熟煙葉，但適熟和過熟煙葉間差異不顯著。

表2 不同成熟度鮮煙葉色素含量Table 2 Pigment contents of fresh tobacco leaves with different maturity

2.2 不同成熟度鮮煙葉組織結構差異

隨著成熟度的增加，煙葉的組織結構呈現由緊密到疏松的變化趨勢（表3 和圖2）。尚熟葉片的厚度顯著大于適熟和過熟葉片，而適熟與過熟間差異不顯著。適熟煙葉的上表皮厚度顯著大于尚熟煙葉；而過熟煙葉與尚熟和適熟間均差異不顯著。適熟和過熟煙葉的柵欄組織厚度顯著大于尚熟煙葉。3 個成熟度鮮煙葉的下表皮厚度、海綿組織厚度及組織比無顯著差異。

圖2 不同成熟度鮮煙葉組織結構Fig. 2 Tissue structure of fresh tobacco leaves with different maturity （100×）

表3 不同成熟度鮮煙葉的組織結構Table 3 Tissue structure of fresh tobacco leaves with different maturities

2.3 不同成熟度鮮煙葉主要酶活性

由圖3可知，隨著煙葉成熟度的增加，MDA含量顯著增加，表現為過熟>適熟>尚熟；葉內SOD和POD 活性顯著降低，表現為尚熟>適熟>過熟；總淀粉酶活性先升高后降低，表現為適熟>過熟>尚熟，且各處理間差異顯著。

圖3 不同成熟度鮮煙葉酶活性Fig. 3 Enzyme activity of fresh tobacco leaves with different maturity

2.4 烤后煙葉常規化學成分分析

不同成熟度烤后煙葉的化學成分如表4 所示。隨著煙葉成熟度的增加，煙葉中總糖、還原糖、鉀離子含量無顯著變化；過熟煙葉的氯離子含量顯著高于適熟和尚熟煙葉；尚熟煙葉的煙堿含量顯著高于適熟煙葉，而過熟煙葉的煙堿含量與尚熟和適熟煙葉差異不顯著；適熟煙葉的氮堿比和糖堿比顯著高于尚熟和過熟煙葉。不同成熟度煙葉的鉀氯比差異不顯著，但適熟煙葉的鉀氯比為4.13，更接近優質煙葉[15]。

表4 不同成熟度烤后煙葉化學成分Table 4 Chemical composition of flue-cured tobacco leaves with different maturity

2.5 不同成熟度烤后煙葉外觀品質

不同成熟度烤后煙葉外觀品質評價如表5 所示，隨著成熟度的提高，‘渝金香1號’烤后煙葉外觀品質的綜合評價得分呈先升高后降低趨勢，表現為適熟>過熟>尚熟，且不同成熟度間差異顯著。其中，適熟煙葉烤后顏色較好、成熟充分、結構尚疏松、身份適中、油分足，色度強，外觀品質較好。

表5 不同成熟度烤后煙葉外觀品質評價Table 5 Evaluation of appearance quality of flue-cured tobacco leaves with different maturity

2.6 不同成熟度烤后煙葉感官質量

不同成熟度烤后煙葉的感官質量評價如表6所示，其中，適熟煙葉烤后的香氣質、香氣量、濃度、勁頭、余味顯著優于尚熟和過熟煙葉，且評吸得分顯著高于尚熟和過熟煙葉。由此表明，適熟煙葉烤后香氣質較好、香氣量充足、濃度豐裕、勁頭適中、刺激性較小、雜氣較少、余味舒適，表現出更優的感官品質。

表6 不同成熟度烤后煙葉感官質量得分Table 6 Sensory quality scores of flue-cured tobacco leaves with different maturity

2.7 鮮煙素質指標的回歸分析

回歸分析能夠反映不同成熟度鮮煙素質指標對烤后煙葉外觀質量和感官質量的影響，回歸系數為正值，代表該指標與外觀質量和感官質量呈正相關，反之呈負相關。由圖4 可知，葉片厚度、下表皮厚度、海綿組織厚度、組織比、葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量與烤后煙葉外觀質量和感官質量呈負相關；上表皮厚度、柵欄組織厚度、類胡蘿卜素含量與烤后煙葉外觀質量和感官質量呈正相關；類葉比與外觀質量呈正相關，與感官質量呈負相關關系。其中，上表皮厚度、柵欄組織厚度和葉綠素b 含量對烤后煙葉外觀質量和感官質量影響較大。

圖4 鮮煙素質指標對煙葉外觀質量和感官質量回歸系數圖Fig.4 Regression coefficient diagram of fresh tobacco quality index on tobacco appearance quality and sensory quality

2.8 不同成熟度的鮮煙素質對烤后煙葉品量的影響

為進一步分析鮮煙素質指標對烤后煙葉質量貢獻度的大小，通過PLS-DA 模型下的變量重要性因子（variable importance in the projection，VIP）對其進行排序，篩選出VIP>1 的因子作為代表性差異指標，結果如圖5 所示。共獲得了5 個VIP>1的鮮煙素質指標，分別為柵欄組織厚度（VIP=1.31）、上表皮厚度（VIP=1.24）、組織比（VIP=1.22）、下表皮厚度（VIP=1.09）和類葉比（VIP=1.05）。這5個鮮煙素質指標對烤后煙葉的品質影響較大。因此，在采烤前，可通過這些指標的鑒定來確定適宜采收的成熟度，進而提高烤后煙葉品質。

圖5 不同鮮煙素質的 VIP值Fig. 5 VIP values for different fresh tobacco qualities

3 討論

不同成熟度煙葉的色素含量、組織結構和相關酶活性等指標差異顯著[16]。本研究結果表明，隨著煙葉成熟度的提高，煙葉的葉綠素和類胡蘿卜素含量逐漸減少，類葉比逐漸增大；葉片厚度逐漸降低，上表皮和下表皮厚度、柵欄組織厚度及組織比先升高后降低；MDA 含量顯著增加，SOD 和POD 活性顯著下降，總淀粉酶活性先升高后降低，與前人研究結果一致[17-20]。

鮮煙素質的差異是不同成熟度煙葉的內在反映，且影響調制后煙葉的品質[21]。光合色素含量不僅影響鮮煙葉的采收成熟度，也是影響烤后煙葉外觀質量的重要因素[22]。疏密適中的組織結構有利于煙葉內理化成分的充分轉化，是形成優質煙葉的基礎[23]。MDA 含量的高低反映了細胞膜脂過氧化水平[24]，SOD 在生物抗氧化系統中具有重要作用[25]，各種酶活性的不同反映了煙葉細胞生理生化反應和內含物降解轉化的程度不同，進而影響煙葉最終品質的形成。本研究結果表明，適熟煙葉烤后的化學成分更為協調，外觀質量和感官質量均顯著優于尚熟和過熟煙葉；上表皮和下表皮厚度、柵欄組織厚度、組織比和類葉比5 個鮮煙素質指標對烤后煙葉品質影響較大（VIP>1）。其中，下表皮厚度、組織比與烤后煙葉的外觀質量和感官質量呈負相關；上表皮厚度、柵欄組織厚度與烤后煙葉外觀質量和感官質量呈正相關；類葉比與外觀質量呈正相關，與感官質量呈負相關。研究表明，上、下表皮厚度影響烘烤過程中煙葉的水分遷移和烤后煙葉身份[26]，但具體機理還有待進一步研究；柵欄組織的厚度反映了植物保水性、適應性的強弱，柵欄組織越厚，光能利用率越高[27]。適熟煙葉的柵欄組織較厚，光合效率高，因此，內含物較為充足，烤后煙葉品質較好。葉片緊密度與組織比呈正相關關系，而葉片緊密度影響煙葉的調制。類葉比在一定程度上可以代表煙葉的變黃程度[28]，因此，對煙葉外觀質量影響較大。綜上所述，不同成熟度鮮煙素質指標與烤后煙葉品質間關系密切，本研究篩選出5 個對烤后煙葉品質影響較大的鮮煙素質指標，為煙葉成熟度判斷標準的選擇和烤后煙葉品質的提升提供了理論依據，對煙葉的適時采收、提高烤后煙葉品質具有重要意義。