多重編輯先驅

編譯 莫莊非

在哈佛大學朗伍德校區，合成生物學家兼遺傳學家喬治 ? 丘奇（George Church）十分忙碌，不是指導學生構建最新的生物技術原型，就是與老伙伴一起開拓新領域。

丘奇一直被視為生物工程領域的開拓者。他在直接基因組測序和人類基因組計劃等方面的工作備受贊譽；他與他的學生對CRISPR-Cas9系統編輯人類細胞能力的證明更是引起了大眾關注。眼下，丘奇團隊正努力開展的項目有望推動基因編輯進入一個全新層次，對整個科學界產生重大影響。

用丘奇自己的話說：“我們實驗室正處于曲線的極點上，只需幾年，我們就會看到無限的可能。”

這個神奇的極點就是多重基因編輯（multiplex genome editing）。丘奇實驗室的合成生物學家們正關注幾個獨特的全基因組多重編輯應用案例。

多重工具箱

過去幾十年間，基因編輯已從科幻躍入現實。這一變革很大程度歸功于基于CRISPR的技術以及其他頂尖創新。魯道夫 ? 巴蘭古（Rodolphe Barrangou）是北卡羅來納州立大學CRISPR實驗室負責人，也是最早從嗜熱鏈球菌基因組中發現CR ISPR重復區域的人之一。他的團隊意識到Cas9酶會導致一種適應性免疫；他們展示了細菌如何存儲、識別和共享有關病毒病原體的信息。巴蘭古表示，CRISPR最初只是一種篩選耐噬菌體細菌的自然方法。

巴蘭古等學者于細微處收獲的關鍵發現后來演變為功能豐富的CRISPR魔剪。用一句話簡介CR ISPR編輯就是，Cas9酶由向導RNA（gRNA）引領，二者合力剪掉DNA的一部分，以刪除或插入新信息。如今，CRISPR的能力遠不止于此，它還可以使用失活形式的Cas蛋白激活或抑制基因——無須剪切；其他的進步包括堿基編輯——使用Cas蛋白一次編輯一個堿基，在DNA的單條鏈上形成一個小切口。

然而，基因編輯領域仍面臨一個巨大挑戰，那就是研究人員只能在某一處進行一次編輯。許多疾病本質上由多基因控制；應對氣候變化和工業生物工程的復雜問題時，改造生物體一兩個基因也完全不夠用。幾十年來，人們不斷尋找多基因編輯技術，或是一套可解決復雜多基因變化的工具。

MAGE系統的幾個循環可以將經過編輯的遺傳信息片段引入基因組中的多個靶點，促進集落中不同細胞群的生長，或交換多肽鏈中的氨基酸

隨著CRISPR成為首選基因編輯工具，丘奇和他的學生開始研究如何擴展這一工具以及其他新型生物技術的規模。多重編輯的目標是同時修改基因組的多處位置——數十、數百甚至數千個堿基。丘奇發現多基因編輯的最大障礙不是功效，而是安全性，“精確編輯獨特的序列并確保沒有任何嚴重偏離目標的內容是另一回事”。

脫靶效應包括編輯目標附近基因（未經修改）的錯誤表型表達，或多次編輯后基因組的大規模功能障礙。舉個例子，CRISPR技術雖然對于編輯從細菌到人類的任何生命體都非常有用且高效，但也可能產生毒性危害機體，尤其是用于治療的CRISPR。

2009年，丘奇和他以前的幾位學生開發了一種被稱為多重自動化基因組工程（MAGE）的系統。該系統可在DNA不出現雙鏈斷裂的情況下進行多次編輯，而雙鏈斷裂可能導致CRISPR結果不佳。同源重組現象發生于細胞分裂和DNA修復的過程中，是指核苷酸序列在相似染色體或基因之間交叉重組。MAGE系統允許各種細胞群通過同源重組方式的基因編輯來生長。這一編輯技術有時也稱“重組工程”。MAGE系統早期使用的工具來自一種叫作Redβ的λ噬菌體蛋白——其更廣為人知的名字是單鏈退火蛋白（SSAP）。

雖然CRISPR系統能編輯許多不同生物體的基因，但一些基因組工程技術的可用與否，往往受物種限制。過去幾十年間，SSAP僅被用于大腸桿菌等細菌。SSAP來自λ噬菌體，后者很善于感染大腸桿菌，并利用宿主的結合蛋白將自己基因嵌入到宿主基因組中。基因編輯者會把SSAP加到包含編輯的寡核苷酸上。這條DNA鏈與解鏈DNA中的同源位置同步，SSAP從滯后鏈開始將兩條鏈結合到一起。此過程很簡單，類似于DNA復制過程中看到的岡崎片段。

作為MAGE系統的一部分，這個過程會隨著與大腸桿菌基因組不同部分相匹配的基因編輯寡核苷酸的多次引入而重復發生。然后，技術人員將這些編輯引入細菌菌落，菌落里每個成員都能吸收、共享它們。丘奇表示，一個技術人員可以對幾十處位點施用MAGE，于一天內制造40億個不同的基因編輯細胞。

美國俄亥俄州立大學醫學院的結構生物學家查爾斯 ? 貝爾（Charles Bell）表示：“就多重編輯性質和效率而言，SSAP可能比CRISPR更強大。如果有一天我們能設計出一種對人類有效的東西，我認為在某些方面，MAGE可能更強大?！?/p>

SSAP與宿主現有的單鏈結合蛋白一起編輯DNA的單鏈部分。在復制過程中使用SSAP結合編輯基因會產生新一代編輯細胞，可利用MAGE系統擴大此生產過程

貝爾過去曾與丘奇合作，現在把重點放在SSAP上；他使用低溫電子顯微鏡等技術來確定這些蛋白質的結構。在最近一項研究中，貝爾團隊在不同噬菌體中發現了一種與λ Redβ結構同源的蛋白質，而且它看起來與一種發現于人類、名為RAD52的蛋白質非常相似。RAD52蛋白是人類DNA修復機制的一部分，它與單鏈DNA結合，從而使互補鏈退火。

貝爾表示：“我們可以使結構排列整齊，并證明有共同的核心折疊存在，因此我們的噬菌體蛋白結構有助于大家理解這一整體機制。這些工作強化論證了噬菌體蛋白和人類RAD52之間的聯系?！?/p>

貝爾等人的發現可能是開發供人類使用的多重編輯SSAP的下一步。但在此之前，丘奇和其他學者正在將多重編輯技術與經過驗證的工具相結合。例如，丘奇團隊已證明，堿基編輯可以同時編輯人類干細胞的33個必需基因。CRISPR編輯能在全基因組范圍內發揮作用（無論脫靶效應如何），以獲得藥物開發所需的化合物，例如通過哺乳動物細胞生產抗凝血劑肝素（無須再從豬身上提?。?。更多研究表明，SSAP可助力CRISPR的雙鏈斷裂修復系統，減少不良影響，從而有望改進單基因和多基因編輯。

巴蘭古認為，對于許多應用，多重CRISPR編輯都是安全且完全可行的——這將極大助益生物設計，使合成生物學界能在基因組編輯領域實現下一個飛躍。巴蘭古說道：“想想合成生物學時代的‘類固醇基因組編輯’?！彼f。在生物工程方面，更多多重編輯的奇特應用案例正在冒出來。

保護我們的微生物工廠

自M AGE系統開發以來，丘奇團隊以多種特殊方式使用了它。利用MAGE來保護細菌免受病毒侵害，可以說是該團隊最基礎的研究領域之一。

2013年，丘奇和他的學生對大腸桿菌基因組做了個微小調整，從而修改轉運RNA（tRNA）將氨基酸傳遞和安裝至肽鏈上的方式。這個經過320多次編輯的初始“重新編碼”菌株可以毫無障礙地合成自己的蛋白質；而試圖入侵細菌的噬菌體無法復制并感染宿主。這是對基因編輯菌株抵抗病毒甚至質粒等可移動遺傳元件的能力的首次證明。

丘奇實驗室的合成生物學家阿科斯 ? 尼爾格斯（Akos Nyerges）2022年主導完成了一項研究：他們再次改變大腸桿菌的遺傳密碼，得到更強健的菌株，名為Ec_Syn61Δ3-SL，可防止噬菌體劫持其基因組翻譯機制來復制病毒蛋白，還擁有其他自保手段。

尼爾格斯仔細觀察了舊版改造后的大腸桿菌基因組，找到一些密碼子，并使用重編程的tRNA去重新編碼它們。編碼絲氨酸的兩個密碼子被修改，結果絲氨酸成了亮氨酸。一個終止密碼子被重新設計，從而引入一種不存在于任何生命系統中的氨基酸，名為“非標準氨基酸”（nsAA）?；蚪M的這三處變化使Ec_Syn61Δ3-SL的生命代碼保持穩定，同時能夠錯誤翻譯任何試圖入侵的病毒，從而自保周全。

相比于大約十年前的早期嘗試，尼爾格斯的新版改良大腸桿菌，對所有測試中的入侵者都表現出抵抗力——自然，它防御新型病毒的水平會比前輩強不少。尼爾格斯與同事發現了12種新的噬菌體菌株，它們能很輕易感染舊版改良大腸桿菌，卻奈何不了新版。研究團隊從各個地方，包括污水、河流和農業土壤等，都分離出了這些噬菌體。尼爾吉斯說道：“這次采樣表明病毒基因組具備許多未開發的功能。從系統發育層面看，這些噬菌體與人們早就在工業感染中發現的噬菌體相似，但它們并不專門針對實驗室記錄的生物體；因此，它們的一些近親可能是工業發酵和實驗室感染中的麻煩制造者。”

尼爾吉斯團隊欣喜若狂，因為這種重新編碼創造了一個抵御感染的安全“防火墻”，尤其令人興奮的是，Ec_Syn61Δ3-SL的防火墻超越了實驗室或其他設施抵御病原體等生物危害的方式——這是一種分子水平上的生物防護。

尼爾吉斯表示，針對基因重新編碼的細胞做生物防護是有益的，他們不希望出現細胞意外逃逸和修改基因的擴散——盡管這種情況發生概率極低。前文提到的非標準氨基酸（nsAA）是關鍵的安全措施，可防止新的大腸桿菌菌株擴散到野外。丘奇指出：“如果你制造出一種具備多種病毒抗性的生物體，它就會是為數不多的能于野外存活超過幾分鐘的實驗室生物體。大多數實驗室生物體都非常脆弱，相較野生型沒什么競爭力，但你可以想見，一種健康到足以用于生產并且對所有病毒具備抵抗力的生物體，將在野外擁有巨大生存優勢。”

在邁克爾 ? 克萊頓（M ich a el Crichton）創作的《侏羅紀公園》中，遺傳學家亨利 ? 吳博士對恐龍基因組進行了一種所謂“賴氨酸應急”的改造。這種改造消除了恐龍自主生產賴氨酸的能力，從而迫使其必須依賴人類提供的賴氨酸補充劑，無法逃離公園。根據丘奇的說法，這就是一種生物防護形式，但它不夠精準。“我們想采取《侏羅紀公園》的方式，但要做得正確?！?/p>

丘奇表示，噬菌體需要進行數百次改變才能克服Ec_Syn61Δ3-SL中的大規模編輯，因此這是真正的保護。丘奇實驗室和世界各地其他實驗室的目標是讓這種生物防護適用于可持續的微生物基因編輯，應用于生物治理或生物燃料等行業，甚至是旨在疾病治療的人類基因組編輯。

大規模編輯的極大吸引力

尼爾吉斯表示，抵御病毒、具備生物防護的改良大腸桿菌是一個關鍵起點，“廣闊天地大有作為，無論是耐病毒屬性還是作為一個整體的MAGE系統，都將給其他領域帶去更大可能”。

丘奇認為，這項工作能很好地轉化應用于異種移植——這是他實驗室的另一項重大研究。2022年初，一名來自美國馬里蘭州的57歲男子接受了豬心臟移植手術，將生命延長了近兩個月。最終導致他死亡的并非排異反應，而是一種僅在豬體內發現的皰疹病毒。丘奇和他以前的學生、現在領導啟函生物技術公司的楊璐菡創立了eGenesis，旨在解決此類異種移植的風險。

丘奇和楊璐菡使用腎細胞，靶向62份豬內源性逆轉錄病毒（PERV）拷貝；這些病毒拷貝嵌入了豬的基因組中。對于豬來說，PERV無害；但研究人員不確定它們對人類有多大危害。丘奇和楊璐菡研究了這些元素，并使用多重CRISPR-Cas9系統滅活了62個病毒基因拷貝，從而將PERV從豬細胞到人類細胞的傳播減少到低于1‰。這一概念驗證或可引領我們最終生產出可用的哺乳動物細胞或用于治療的移植物。

與PERV一樣，人類基因組中也遍布內源性逆轉錄病毒和其他重復元素。這些重復區域曾被視為“垃圾DNA”，但現在研究表明，它們甚至能破壞基因表達、引發疾病并影響衰老過程。丘奇表示：“從本質上說，我們研究的是人類基因組中每一類主要重復序列，其中一些重復序列的數量以百萬計?！彼膶嶒炇乙远嘀鼐庉嫾夹g作為首要技術，研究了24 000個重復元素。

除了生物醫學應用外，丘奇也正試圖將多重編輯工程帶入現實世界的侏羅紀公園。他創辦的克羅索生命科學公司致力于復活已滅絕的猛犸象和塔斯馬尼亞虎，并保護世界上最龐大的生態系統“工程師”之一：大象。

即便多重基因編輯無法像CRISPR技術那樣掀起波瀾，丘奇也希望，至少這種新技術能像他自己的實驗室那樣激發一連串靈感。丘奇說道：“我們為改進多重編輯所做的一切，包括對細菌的多重編輯，都影響了我們在哺乳動物細胞方面的工作。我們在人類干細胞方面所做的一切，都使大象保護項目受益。通過多重編輯，這些領域可以產生一些協同作用?！?/p>